CROMATOGRAFÍA

La cromatografía es un método físico de separación en el que los componentes a separar

se distribuyen entre dos fases, una de las cuales está en reposo (fase estacionaria)
mientras que la otra (fase móvil) se mueve en una dirección definida.

La separación se debe a la influencia de dos efectos contrapuestos:

a) Retención: Efecto producido sobre los componentes de la mezcla por una fase
estacionaria, que puede ser un sólido, un gel o un líquido anclado a un soporte sólido.

b) Desplazamiento: Efecto ejercido sobre los componentes de la mezcla por una fase
móvil, que puede ser un líquido, un gas o un fluido supercrítico. Un fluido supercrítico es
una sustancia sometida a presión, y calentada a una temperatura superior a su
temperatura crítica. Posee algunas características propias de un gas y algunas
correspondientes a un líquido. Presenta las ventajas de tener una viscosidad menor a la de
un líquido y ser amigable con el ambiente.

El fenómeno de migración de los componentes de una muestra impulsados por la fase

móvil, a lo largo de la fase estacionaria, se denomina elución. La mezcla a separar se
deposita sobre la fase estacionaria, mientras que la móvil atraviesa el sistema arrastrando
los componentes de la misma, los cuales se desplazan a distintas velocidades
dependiendo de la magnitud de las interacciones relativas de dichos componentes con
ambas fases.

Aquellos componentes que son retenidos fuertemente por la fase estacionaria, se mueven
lentamente con el flujo de la fase móvil. Por el contrario, los componentes que se unen
débilmente a la fase estacionaria se mueven con rapidez junto con la fase móvil. Como
consecuencia de esta movilidad diferente los componentes se separan en bandas o
manchas que pueden analizarse cualitativamente y/o cuantitativamente.

Los fenómenos físicos que influyen directamente sobre las constantes de equilibrio de
distribución de los compuestos entre fase estacionaria y fase móvil son:

 Partición: Los solutos se separan en base a las diferencias de las solubilidades de

los mismos, entre la fase móvil y la fase estacionaria. (Cromatografía Líquido o Gas-
Sólido)
 Adsorción: La fase estacionaria sólida retiene a los solutos, principalmente por
efecto de fuerzas físicas de superficie del tipo de fuerzas de Van der Waals.
(Cromatografía Líquido o Gas – Sólido).
  Intercambio iónico: el sólido retiene a los solutos gracias a atracciones
electrostáticas. Por lo tanto, se usa con sustancias que se ionicen. (Cromatografía
Líquido – Sólido).
 Exclusión: la fase estacionaria es un material poroso que retiene a los solutos
selectivamente en función de la geometría y tamaño molecular. (Cromatografía
Líquido – Sólido).
 Afinidad: la fase estacionaria es generalmente un polímero líquido inmovilizado
sobre un sólido inerte, unido por enlaces covalentes. (Cromatografía líquido-
líquido).

Se clasifica a las distintas técnicas cromatograficas en:

 CROMATOGRAFÍA DE GASES
 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA
 CROMATOGRAFÍA SUPERCRÍTICA.

Se clasifica por la naturaleza del soporte en el que se aloja la fase estacionaria:

 Cromatografía plana
 Cromatografía en papel
 Cromatografía en capa fina (TLC)
 Cromatografía en columna

CROMATOGRAFÍA EN PAPEL

La fase estacionaria está constituida por una tira de papel de filtro. La muestra de deposita
en un extremo del papel colocando pequeñas gotas de la solución y evaporando el
solvente. Luego, se coloca la tira de papel verticalmente y con la muestra en el lado
inferior dentro de un recipiente que contiene la fase móvil en el fondo. El disolvente
empleado como fase móvil asciende por capilaridad.

Es una Cromatografía líquido-líquido porque la fase estacionaria es el agua contenida en la

celulosa del papel. Cuando la fase móvil (solvente orgánico) pasa sobre la fase
estacionaria, las sustancias se separan “repartiéndose” entre ambas.

CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA

En la cromatografía en capa fina (CCF) la fase estacionaria consiste en una capa delgada de
un adsorbente (por ejemplo gel de sílice, alúmina o celulosa) depositada sobre un soporte
plano como una placa de vidrio, o una lámina de aluminio o de plástico. La fase móvil es
líquida y la fase estacionaria es un sólido, que se caracteriza por ser polar. El eluyente será
menos polar que la fase estacionaria, y los componentes de la muestra que se desplacen
con mayor velocidad serán los menos polares.

Se deposita una pequeña cantidad de la muestra en disolución en un punto en la parte

inferior de la placa. La placa se introduce en una cubeta cromatográfica, de forma que
sólo la parte inferior de la placa queda sumergida en el líquido. El eluyente o líquido
asciende por la placa por capilaridad.

A medida que el eluyente se desplaza por el lugar donde está la depositada la muestra se
establece un equilibrio entre las moléculas de cada uno de los componentes de la mezcla
que son adsorbidas y las que se encuentran en disolución.

Los componentes se diferenciarán en solubilidad y en la fuerza de su adsorción, por lo

que, unos componentes se desplazarán más que otros. Cuando el eluyente llega a la parte
superior de la placa, esta se saca de la cubeta, se seca, y los componentes separados de la
mezcla se visualizan.

Si los compuestos son coloreados se pueden observar las manchas a simple vista. Si no es
así, hay varios métodos para visualizar las manchas correspondientes a cada componente
de la mezcla.

 Método físico: Se añade un colorante fluorescente al adsorbente, de forma que al

colocar la placa bajo una lámpara ultravioleta, aparecen manchas fluorescentes en las
zonas en las que hay componentes o en otros casos aparece toda la placa fluorescente
excepto donde hay componentes orgánicos.
Algunos compuestos poseen la capacidad de emisión de fluorescencia, propiedad que
les permiten ser detectados directamente cuando son sometidos a radiación
ultravioleta.
 Método químico: Se utilizan reveladores, como el yodo, que reacciona con los
componentes orgánicos, produciendo manchas amarillo-marrón; o el ácido sulfúrico,
produce manchas negras, o el permanganato potásico, que deja unas manchas de
color amarillo.

Cuando los compuestos son visibles, se puede determinar para cada una de las manchas el
valor de Rf (factor de retención), o la distancia que cada compuesto se desplaza en la
placa. Cada compuesto tiene un Rf característico que depende del disolvente empleado y
del tipo de placa de CCF utilizada, pero es independiente del recorrido del disolvente. De
esta manera se puede ayudar a identificar un compuesto en una mezcla al comparar su Rf
con el de un compuesto conocido.

Aplicaciones de la cromatografía en capa fina

Una de las principales aplicaciones es la caracterización de componentes orgánicos que
constituyen los bajos explosivos, como por ejemplo la nitrocelulosa.

También es aprovechada por la Documentología para el estudio de las tintas que

conforman un documento. La cromatografía en capa fina permite separar los pigmentos
que componen una tinta y luego compararlos con los que conforman otra,
fundamentándose en el hecho que dos compuestos de diferente estructura molecular
diferirán en su comportamiento cromatográfico.

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA

La cromatografía en columna utiliza una columna de vidrio vertical que se llena con un
soporte sólido adsorbente (fase estacionaria: los más utilizados son gel de sílice y alúmina.
La muestra que se quiere separar se deposita en la parte superior de este soporte. El resto
de la columna se llena con el eluyente (disolvente que constituye la fase móvil) que, por
efecto de la gravedad, hace mover la muestra a través de la columna. Se establece un
equilibrio entre el soluto adsorbido en la fase estacionaria y el disolvente eluyente que
fluye por la columna. Debido a que cada uno de los componentes de una mezcla
establecerá interacciones diferentes con la fase estacionaria y la móvil, serán
transportados a diferentes velocidades y se conseguirá su separación.

Si los compuestos separados en una cromatografía en columna son coloreados, el

progreso de la separación se puede monitorizar visualmente. No obstante, a menudo los
compuestos que deben ser aislados suelen ser incoloros. En este caso, se recogen
secuencialmente pequeñas fracciones de eluatos en tubos rotulados y la composición de
cada fracción se analiza por cromatografía en capa fina. Una vez identificadas las
diferentes fracciones que contienen el mismo producto, se reúnen, se elimina el
disolvente y se analiza la identidad de los componentes por métodos espectroscópicos.

CROMATOGRAFÍA DE GASES

La cromatografía de gases es una técnica de separación mezclas de compuestos volátiles y

térmicamente estables a temperaturas hasta 350-400°C. Para realizar una separación
mediante esta técnica se inyecta una pequeña cantidad de la muestra a separar en una
corriente de un gas inerte, como helio, argón o nitrógeno, a elevada temperatura, esta
corriente de gas atraviesa una columna cromatográfica que separará los componentes de
la mezcla por medio de un mecanismo de partición (cromatografía gas-líquido), de
adsorción (cromatografía gas-sólido) o por medio de una mezcla de ambos. Los
componentes separados emergerán de la columna a intervalos discretos y pasarán a
través de algún sistema de detección adecuado, o bien serán dirigidos hacía un dispositivo
de recogida de muestras.
La separación se logra debido a la interacción diferenciada de los componentes de la
muestra con las fases presentes: la fase estacionaria y la fase gaseosa. Los compuestos
que presentan mayor interacción con la fase estacionaria recorrerán más lentamente la
columna saliendo de ella a mayor tiempo de elución. Por el contrario, los componentes
con menor afinidad por la columna, como también el gas acarreador, saldrán primero de
la columna y tendrán, por lo tanto, los menores tiempos de retención (intervalo de tiempo
en que el analito se encuentra en la columna).

Su principal detector es el espectrofotómetro de masas. En contraste con el GC, un

espectrómetro de masa (MS) no es utilizado para tratar mezclas. Si se introduce una
sustancia pura en el MS, su espectro de masa permite identificarlo unívocamente,
empleando un método de ionización apropiado. Con este equipo se puede realizar una
identificación positiva de una sustancia o la confirmación de su estructura molecular. En
cambio, si se coloca una mezcla de sustancias, el espectro de masa será la suma de todos
los espectros de los compuestos presentes y será imposible identificarlos.

Combinando ambos métodos se obtiene un sistema llamado Cromatógrafo Gaseoso con

detector de Espectrometría de Masa (GC/MS) capaz de separar, identificar y cuantificar las
mezclas complejas, siempre que los componentes puedan ser volatilizados.

Funcionamiento:

 Fase móvil: gas acarreador + muestra gaseosa.

 Fase estacionaria: depende del tipo de columna y análisis, lo cual define el tipo de
cromatografía gaseosa. Pudiendo ser:
 Cromatografía Gas-Líquido: La fase estacionaria es una delgada película de
líquido que moja las paredes internas de la columna.
 Cromatografía Gas-Sólido: La fase estacionaria es un sólido que debe tener
poros de un diámetro controlado donde se retienen las moléculas mientras
migran por la columna.

Los componentes esenciales de un cromatógrafo de gases son:

 Fuente de gas
 Sistema de inyección
 Horno y columna cromatográfica
 Sistema de detección
 Sistema de registro
El detector es sensible a la perturbación o cambios físicos/químicos que ocasionen las
moléculas o componentes de la muestra, y responderá con una señal que se amplifica y
representa a través de un cromatograma.

El cromatograma permite el análisis de las señales, sus formas y alturas en función del
tiempo de retención de las moléculas o compuestos.

Aplicaciones

Las muestras sospechosas de incendios provocados normalmente consisten en madera

carbonizada, ropa o alfombra tomadas de la escena del fuego. Para aislar los posibles
acelerantes, las muestras se sellan en viales herméticos. Si está presente un acelerante
como la gasolina o el queroseno, se obtienen los vapores de estos líquidos desde el
contenedor sellado. Entonces se toma una muestra del aire que rodea a la muestra con
una jeringa hermética y se inyecta en un sistema de Cromatografía de Gases para su
análisis.

 Medioambientales: análisis de pesticidas y herbicidas, análisis de hidrocarburos

volátiles, análisis del aire.
 Alimentos y aromas: fragancias, azucares, aceites, bebidas, ect.
 Química industrial: aminoácidos, enzimas, ácidos orgánicos, ácido nucleico, etc.
 Biociencia: drogas, fármacos, alcoholes, etc.
 Derivados el petróleo: gas natural, gasolinas, parafinas, etc.

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA

La Cromatografía Líquida es una técnica de separación de mezclas de componentes poco o

nada volátiles y térmicamente sensibles, utilizando como fase móvil un líquido.

La muestra se introduce en el puerto de inyección donde es arrastrada por un líquido (fase

móvil) hacía una columna cromatográfica, que contiene la fase estacionaria. La diferente
interacción de los compuestos o analitos con la fase móvil y la fase estacionaria permiten
la separación de los componentes de la mezcla para una posterior detección, y/o
caracterización, y/o cuantificación utilizando diversos detectores.

Aplicaciones

1. Química forense: Drogas, venenos, alcohol en sangre, narcóticos

2. Fármacos: Antibióticos, sedantes esteroides, analgésicos
3. Bioquímica: Aminoácidos, proteínas, carbohidratos, lípidos
4. Productos de alimentación: Edulcorantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas,
aditivos
5. Productos de la industria química: Aromáticos condensados, tensoactivos,
propulsores, colorantes
6. Medicina clínica: Ácidos biliares, metabolitos de drogas, extractos de orina,
estrógenos.

Comparación con la Cromatografía de Gases

 La cromatografía liquida posee detectores más universales

 Métodos simples, rápidos y sensibles
 Instrumentación más sencilla y económica
 No presenta limitaciones como la GS en cuanto a la influencia de la temperatura.