Bibliografía Consultada
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PRACTICA 6
REACCIONES DE AGLUTINACIÓN
Objetivo. Conocer el uso de los anticuerpos como herramienta diagnóstica así
como para investigación. Asimismo, entender los fundamentos de diferentes
reacciones antígeno–anticuerpo utilizadas clínicamente. Diferenciar entre
aglutinación y precipitación.
Fundamento
Las pruebas de aglutinación han formado parte del laboratorio de diagnóstico
desde que se instituyeron. En 1896, Gruber y Durham publicaron observaciones
relacionadas con la capacidad de anticuerpos de agrupar (aglutinar) células
bacterianas y sugirieron que este fenómeno podría ser útil para propósitos de
identificación. En un estudio extensivo de aglutinación, Smith y Reogh
demostraron en 1903 antisueros contra constituyentes de la superficie de células
bacterianas, los cuales parecían ser específicos. Topley, Wilson y Duncan
extendieron esta observación y desarrollaron la primera prueba de aglutinación
con fines diagnósticos. Ellos desarrollaron antisueros contra algunos de los
principales grupos de microorganismos reconocidos. Cuando uno de estos grupos
se pensaba que estaba presente en un cultivo mixto, el antisuero preparado contra
una especie sólo aglutinaba esta especie. Ellos postularon que éste fenómeno
podría ser aplicado al diagnóstico de infecciones pulmonares y entéricas, su
suposición constituye la base para el amplio uso de las pruebas de aglutinación
actualmente.
La aglutinación es el agrupamiento de partículas por anticuerpos o antígenos
específicos bajo condiciones fisicoquímicas particulares. Difiere de la precipitación
en la aglutinación, uno de los reactantes (antígeno o anticuerpo) están adsorbidos
en la superficie de una partícula acarreadora. En la precipitación el antígeno y el
anticuerpo son solubles.
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Aunque las teorías básicas que gobiernan la formación de un aglutinado o un
precipitado tienen mucho en común, esta diferencia en la naturaleza de los
reactantes permite que la aglutinación sea un ensayo semicuantitativo
produciendo resultados que puedan ser expresados sólo como unidades relativas
(como título). La precipitación puede ser usada para determinar la cantidad exacta
de antígeno o anticuerpo en solución, además mucho de lo que se conoce de la
naturaleza de las reacciones antígeno-anticuerpo vienen del estudio de las
reacciones de precipitación.
La aglutinación como todas las reacciones serológicas ocurre en dos etapas. La
reacción primaria es la combinación del antígeno y el anticuerpo. Una fuerza
iónica baja favorece la interacción. La reacción secundaria, o visible es la
agregación visible de las partículas. Cada clase de anticuerpo tiene propiedades
biológicas particulares y participa con diferentes eficiencias en las diferentes
pruebas. Dos tipos de inmunoglobulinas son útiles para las reacciones de
aglutinación: IgM e IgG, IgA aunque está en menor proporción también puede
aglutinar. IgM aparece 1 día ó 2 días después de la infección . Su gran tamaño
molecular (850 000 Da) y su arreglo circular la hace más eficiente en combinar
partículas (por ejemplo: bacterias y virus) en grumos (aglutinación) para facilitar su
remoción en vivo por el sistema retículoendotelial. La IgG aparece más tarde en el
curso de la infección o exposición al antígeno a diferencia de la IgM, la IgG puede
ser encontrada en el suero por años. Su tamaño y distribución la hace más
eficiente para combinarse con el sitio de unión de un microbio invasor, con la
neutralización y opsonización resultante, pero menos eficiente para aglutinar y
matar. Por esto las pruebas de aglutinación son mucho más eficientes (aprox. 750
veces) al medir IgM que IgG.
La utilización de la reacción in vitro entre un antígeno y anticuerpos séricos es
llamada serología. No hay enlaces covalentes involucrados en la interacción entre
Ac y el epítope del Ag. Consecuentemente las fuerzas de unión son relativamente
débiles. Estas son principalmente del tipo de fuerzas de Van der Waals, fuerzas
electrostáticas, puentes de hidrógeno y fuerzas hidrofóbicas las cuales requieren
una muy estrecha proximidad entre las partes reaccionantes. De esta manera la
interacción requiere un muy cercano ajuste entre un epítope y el anticuerpo, que
es comparado con aquel entre una llave y su cerradura. Debido a los bajos niveles
de energía involucrados en la interacción entre antígeno y anticuerpo, los
complejos Ag-Ac pueden ser disociados por alto y bajo pH, altas concentraciones
de sales, o por iones caotrópicos, tales como cianatos, lo cual interfiere con los
puentes de hidrógeno de las moléculas de agua.
El término afinidad es la constante de asociación intrínseca entre el anticuerpo y
un ligando univalente. El término avidez es dado a la fuerza total de unión entre
una molécula de anticuerpo a un antígeno o partícula. Para anticuerpos IgG, la
unión divalente puede incrementar significativamente la avidez; en los anticuerpos
IgM, los cuales están constituidos por 5 moléculas divalentes, tendrá 10 sitios de
unión al antígeno, la afinidad de cada sitio para un antígeno monovalente puede
ser baja, pero la avidez de unión de la molécula completa de anticuerpo a la
superficie de una bacteria que tenga epítopes idénticos y múltiples puede ser muy
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alta. Por esto, los anticuerpos IgM tienen una más grande avidez que los IgG,
aunque la unión de cada Fab en el anticuerpo IgM con su ligando pueda ser la
misma afinidad que aquella del Fab con la IgG.
Reacciones de aglutinación.
Las reacciones de anticuerpo con un antígeno multivalente que es particulado
(partícula insoluble) da por resultado el entrecruzamiento de varias partículas
antigénicas por los anticuerpos. Este entrecruzamiento da origen al agrupamiento
o aglutinación de las partículas del antígeno por los anticuerpos.
Dilución del suero 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 1:2048
Aglutinación - - + + + + + + + -
Prozona Aglutinación
Título 1:1024
La aglutinación es dependiente de la proporción correcta del antígeno y
anticuerpo. En la figura anterior se presenta un ejemplo de una prueba de
aglutinación para anticuerpos contra las bacterias Brucella abortus presentes en el
suero de un individuo afectado. Se presentan 10 tubos conteniendo una dilución
doble seriada del suero, que va de 1:4 a 1:2048, a cada uno de los cuales se les
agregó una cantidad igual de una suspensión de Brucella abortus (un antígeno
particulado). Los signos + o – indican la presencia o ausencia de aglutinación. Los
resultados de la prueba mostrados debajo de cada tubo indican que la aglutinación
ocurre en las diluciones del suero entre 1:16 y 1:1024. No hay aglutinación a
diluciones más altas, ya que a esas diluciones no hay suficientes anticuerpos para
causar aglutinación visible. La dilución más alta del suero a la cual se presenta
aglutinación es llamada título. En el ejemplo mostrado sería 1:1024 ó 1024. En las
primeras diluciones los tubos no muestran aglutinación, aunque esta se presenta a
altas diluciones del suero. Esto se denomina fenómeno de prozona. En este caso
los anticuerpos están presentes en exceso, de manera que la proporción de
antígeno y anticuerpo está desbalanceada. En este caso cada molécula de
anticuerpo puede unirse al epítope de una partícula individual, con lo cual no se da
el entrecruzamiento y por lo tanto no se observa la aglutinación.
El tipo más simple de inmunoensayo involucra la medición de la aglutinación de un
antígeno y su correspondiente anticuerpo como una función de la concentración
de uno de estos componentes. Los ensayos de aglutinación se pueden clasificar
en:
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- Ensayos de aglutinación activa,
- Ensayos de aglutinación pasiva,
- Ensayos de aglutinación mediados por antiglobulina,
- Ensayos de inhibición de la aglutinación.
En el primer caso los antígenos que intervienen en la reacción son componentes
naturales de la partícula (bacterias, levaduras, eritrocitos, linfocitos, etc.). En el
caso de la aglutinación pasiva los antígenos son acoplados en forma artificial a
partículas que sólo funcionan como soportes. Las partículas más usadas con este
fin son: eritrocitos y partículas de poliestireno (látex). En los dos casos la
aglutinación se puede llevar a cabo en placa o en tubo.
AGLUTINACIÓN ACTIVA.
Aglutinación bacteriana
La aglutinación de bacterias se lleva a cabo entre los antígenos localizados en su
superficie celular (cápsula, pared, flagelos, etc.) y la población heterogénea de
anticuerpos específicos presentes en el huésped que estuvo en contacto con el
microorganismo en cuestión. Este contacto puede establecerse en forma natural
(infecciones clínicas o subclínicas) o artificiales (por vacunación o inmunización de
animales de experimentación).
Entre las aplicaciones más importantes de la aglutinación bacteriana están:
1. La identificación y clasificación de microorganismos aislados de diversas
fuentes, tales como exudados, heridas, sangre, alimentos, aguas negras, etc.
2. El diagnóstico de cuadros infecciosos mediante el hallazgo de anticuerpos
específicos en el suero de pacientes, así como para seguir la evolución del
proceso en aquellos casos en que exista una correlación entre el título de
anticuerpos y el cuadro clínico.
Reacciones febriles
Objetivo: Identificar la presencia de anticuerpos circulantes producidos contra
Salmonella tiphy, Salmonella paratiphy A y Salmonella paratiphy B, Brucella
melitensis y Rickettsia prowaseki.
La infección por gérmenes de diversas especies conduce a una elevación
marcada de la temperatura, entre otros síntomas igualmente inespecíficos, por lo
cual se dificulta el diagnóstico de la enfermedad. Este es el caso de la fiebre
tifoidea causada por Salmonella tiphy, las paratifoideas causadas por Salmonella
paratiphy A y Salmonella paratiphy B, la fiebre de malta, causada por Brucella
melitensis y el tifo, causado por Rickettsia prowaseki. Sin embargo estos
microorganismos inducen una respuesta humoral con la producción de
anticuerpos que pueden identificarse con antígenos específicos. En el caso de
Rickettsia prowaseki es difícil contar con antígenos provenientes de ella, pero se
utiliza Proteus OX19, el cual posee determinantes antigénicos comunes con la
Rickettsia.
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Desarrollo
Material
Placas de vidrio para la prueba,
Palillos,
Antígenos comerciales para reacciones febriles,
Suero problema para realizar la prueba.
Procedimiento
- Coloque 0,4 ml de suero problema en cada una de las 6 divisiones de la placa
(una por cada suero).
- Agregue 1 gota de cada uno de los antígenos a cada una de las gotas de suero
colocadas.
- Mezcle cada par de gotas con palillos diferentes.
- Agite la placa con movimiento oscilante por 5 min.
- Busque la presencia de aglutinación. Puede usar una fuente de luz indirecta
para que sea más fácil la observación.
- En caso de que aparezca aglutinación en alguno de los antígenos con el suero,
coloque en otra serie de divisiones, los siguien tes volúmenes de dicho suero:
0,08 ml (dil. 1:20 con respecto a los 0,4 ml originales), 0,04 ml (dil. 1:40), 0,02
ml (dil. 1:80), 0,01 ml (dil. 1:160) y 0,005 ml (dil. 1:320).
- Agregue 1 gota del antígeno correspondiente a cada gota de suero, se mezcla
bien con palillos, se agita y se lee igual que en la primera ocasión.
Reporte el título del suero como la recíproca de la dilución más alta en la que
todavía se observa aglutinación. El hallazgo de títulos de 20 y 40 no son
significativos, puesto que muchos individuos de la población general los tienen
debido a contactos previos con lo gérmenes mencionados, lo cual no
necesariamente representan la presencia de la enfermedad.
Diagrama de flujo del procedimiento (Realizarlo en la página anterior)
Resultados y observaciones
Discusión y conclusiones
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Tipificación de grupos sanguíneos
Objetivo: Identificar los tipos de sangre y Rh de muestras desconocidas.
Los eritrocitos poseen en su membrana substancias antigénicas determinadas
genéticamente, las cuales pueden ser identificadas serológicamente mediante
anticuerpos específicos. El primer grupo de estas substancias fue identificado por
Landsteiner en 1901, al cual le llamó ABO. En éste sistema hay tres alelos
principales: A, B y O, y pueden presentarse cuatro fenotipos, O, A, B y AB,
dependiendo de si los glóbulos rojos del individuo presentan uno, dos o ninguno
de los antígenos (A y B) pertenecientes a este sistema. De esta forma los
individuos que poseen el antígeno A serán del tipo A, los que tengan el B serán
tipo B, los que tengan los dos serán AB y los que no tengan ninguno serán O. Los
individuos del tipo A tienen en su suero anticuerpos anti-B, los del tipo B poseen
anticuerpos anti-A, los del tipo O, anti-A y anti-B y los de tipo AB ninguno.
Más tarde, en 1940, Landsteiner y Wiener descubrieron otro antígeno como
resultado de la inmunización de cobayos y conejos con sangre de monos de la
especie Macacus rhesus, basándose en la suposición de que en los eritrocitos de
estos monos podrían existir antígenos similares a los de humanos pero que aún
no se hubieran descubierto en los glóbulos rojos humanos. Después de adsorber
los anticuerpos conocidos, el suero de los conejos que había recibido eritrocitos de
mono rhesus reaccionó con los eritrocitos del 85% de las personas de raza blanca
estudiadas. Los individuos que reaccionaron fueron denominados Rh positivos (+)
y los que no reaccionaron Rh negativos (-). En 1977, el Comité de Expertos de
Estandarización Biológica de la Organización Mundial de la Salud recomendó que
fuera adoptada universalmente la nomenclatura DCE. Esta teoría asume la
existencia de tres pares de genes: D y d, C y c, y E y e. Aunque no hay antígeno d
(hipotético), es conveniente marcar la ausencia de D usando el símbolo d en los
genotipos. Por su potencia antigénica la substancia más importante es la D, que
es la que se determina en el laboratorio con el suero anti-D (anti-Rh), con lo que
se proporciona el criterio de Rh+ ó Rh - según sea el resultado de la prueba.
Desarrollo
Material
Placas de vidrio para la prueba,
Palillos,
Antígenos comerciales anti-A, anti-B, anti-Rh,
Sangre problema para realizar la prueba.
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Procedimiento
- Obtenga sangre por punción venosa, o mediante una lanceta de un dedo y
coloque una gota en cada una de las excavaciones de una placa de porcelana
o en un portaobjetos.
- Añada a cada una de las gotas de sangre, una gota de cada uno de los
siguientes antígenos: anti-A, anti-B, anti-Rh.
- Mezcle suavemente con la ayuda de un palillo y después con movimientos
rotatorios.
- Busque la presencia de aglutinación antes de 25 segundos.
- Prepare un autotestigo mezclando una gota de sangre con una gota de
solución de albúmina al 25%, en la cual no deberá haber aglutinación. Si esta
se presentara, se deberá a que existen autoanticuerpos anti-eritrocitos, lo cual
deberá ser informado inmediatamente.
Diagrama de flujo del procedimiento (Realizarlo en la página anterior)
Resultados y observaciones
Discusión y conclusiones
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Prueba de Coombs
Objetivo: Identificar la presencia de anticuerpos no aglutinantes mediante el uso
de anticuerpos anti-inmunoglobulina.
En algunas ocasiones, los anticuerpos unidos a sus antígenos correspondientes
que están en la membrana de los eritrocitos no dan lugar a la formación de un
agregado visible en un tiempo relativamente corto.
En 1908 Moreschi describió esta prueba para acelerar y reconocer la aglutinación
bacteriana. En 1945 independientemente Coombs, Mourant y Race en Inglaterra
volvieron a descubrir la prueba y la aplicaron a la “Identificación de aglutininas Rh
débiles e incompletas”. Para poner en evidencia la presencia de estos anticuerpos
(que por su comportamiento han sido denominados incompletos) se utiliza un
sistema de un anticuerpo anti-inmunoglobulinas humanas preparado en otra
especie (Suero de Coombs).
En el caso de incompatibilidad en el sistema Rh entre la madre y su producto, en
la cual la primera es Rh- y el segundo Rh+, puede haber isoinmunización con la
producción de anti-D de la clase IgG que se comportan como “incompletos”. Estos
anticuerpos pueden atravesar placenta, unirse a los eritrocitos del producto y
desencadenar un estado patológico (enfermedad hemolítica del recién nacido,
eritroblastosis fetal). Por tal motivo es de gran importancia la búsqueda de los
anticuerpos anti-D en el suero de la madre o los que se han unido a los eritrocitos
del recién nacido, y como estos anticuerpos no aglutinan , es necesario recurrir a
las pruebas de Coombs (indirecta y directa). Es importante señalar que esto
mismo puede ocurrir con otros sistemas de grupos sanguíneos.
Prueba directa de Coombs
Objetivo: Poner en evidencia anticuerpos no aglutinantes en eritrocitos de
humano.
Esta prueba se aplica en el caso de que los eritrocitos estén naturalmente
recubiertos con anticuerpos “incompletos”. Se utiliza en el caso de glóbulos rojos
provenientes de niños con eritroblastosis fetal, en el estudio de anemia hemolítica
adquirida (en la que se buscan autoanticuerpos) y en la investigación de
reacciones consecutivas a transfusiones de sangre incompatibles.
Material
Suspensiones de glóbulos rojos problema y normales, lavados 5 veces con
solución salina y ajustados a una concentración del 2%,
Solución salina isotónica,
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Tubos de ensaye de 10 mm x 75 mm,
Pipetas Pasteur,
Bulbo de hule,
Suero de Coombs.
Procedimiento
- En un tubo de ensaye coloque 2 gotas de la suspensión al 2% v/v de glóbulos
rojos problema.
- Añada 2 gotas de suero de Coombs.
- Mezcle bien y centrifugue a 160 x g durante 1 minuto.
- Desprenda el botón suavemente y macroscópicamente busque aglutinación.
- De la misma manera prepare un tubo en el cual se sustituye el suero de
Coombs por solución salina (testigo negativo de los eritrocitos problema)
- Simultáneamente prepare de la misma forma un tubo que contenga una
suspensión de glóbulos rojos normales y suero de Coombs (testigo negativo
del suero de Coombs).
La presencia de aglutinación de los eritrocitos problema con suero de Coombs
indica que los glóbulos rojos del paciente están recubiertos por anticuerpo
específico.
Diagrama de flujo del procedimiento (Realizarlo en la página anterior)
Resultados y observaciones
Discusión y conclusiones
Prueba indirecta de Coombs
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Objetivo: Poner en evidencia la presencia de anticuerpos no aglutinantes en suero
de pacientes isoinmunización materno fetal.
Esta prueba se usa para determinar la presencia de anticuerpos “incompletos” en
el suero de sujetos sensibilizados a uno o más antígenos sanguíneos. Es útil en el
estudio del suero proveniente de mujeres afectadas por isoinmunización
maternofetal y se emplea amplia y rutinariamente en pruebas cruzadas que
permiten descubrir ciertas incompatibilidades que no pueden descubrirse por otras
técnicas.
Material
Suspensión de glóbulos rojos tipo O Rh(+), lavados 3 veces con solución salina y
ajustados a una concentración del 10% v/v,
Suero problema,
Pipetas Pasteur,
Bulbos de hule,
Suero de Coombs,
Solución salina isotónica.
Procedimiento
- En un tubo de ensaye coloque dos gotas de suero problema.
- Añada dos gotas de la suspensión al 10% de eritrocitos O Rh(+).
- Mezcle bien y centrifugue a 160 x g durante 1 minuto.
- Desprenda suavemente los glóbulos rojos sedimentados y observe si hay
aglutinación macroscópica. En caso de ser negativa o débilmente positiva,
resuspenda los eritrocitos e incube en un baño maría 20 minutos a 37 ºC.
- Lave los eritrocitos por centrifugación con solución salina una sola vez y
después de escurrirlos resuspenda en la solución salina remanente.
- Añada dos gotas del suero de Coombs.
- Mezcle bien y centrifugue a 160 x g durante 1 minuto.
- Desprenda el botón suavemente y busque macroscópicamente aglutinación.
- De la misma manera prepare un tubo en el cual se sustituye el suero de
Coombs por solución salina (testigo negativo de los eritrocitos O Rh(+).
- A dos gotas de la suspensión de eritrocitos O Rh(+) añada una gota de suero
anti-D, diluído 1:16. Incube 15 minutos a 37 ºC. Agregue el suero de Coombs y
a partir de este paso se trata igual que a los otros tubos. (testigo positivo de los
eritrocitos O Rh(+)).
La aglutinación de los glóbulos rojos conocidos con el suero problema indica la
presencia de anticuerpos aglutinantes. La aglutinación de estos eritrocitos con
suero problema y suero de Coombs señala la presencia de anticuerpos
“incompletos” en el suero problema.
Diagrama de flujo del procedimiento (Realizarlo en la página anterior)
Resultados y observaciones
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Discusión y conclusiones
Pruebas Cruzadas
Objetivo: Verificar la compatibilidad entre sangre de dos individuos.
Previo a la realización de una transfusión sanguínea entre individuos compatibles
en el sistema ABO y para el sanguíneo D, es necesario realizar una prueba
cruzada que ponga de manifiesto la existencia de otros anticuerpos dirigidos
contra antígenos de los sistemas menores. Esta prueba se lleva a cabo con
eritrocitos del donador y suero del receptor (prueba mayor) y con eritrocitos del
receptor y suero del donador (prueba menor).
Material
Solución de albúmina al 25% p/v,
Solución de Fiscina (1 mg/ml) o Papaína (10 mg/ml),
Pipetas automáticas y puntas,
Tubos de ensaye de 10 mm x 75 mm,
Gradilla,
Pipetas Pasteur,
Bulbos de hule,
Suero de Coombs,
Procedimiento
- Obtenga unos 5 ml de sangre venosa sin anticoagulante del donador y coloque
0,1 ml de esa sangre en un tubo que contenga 5 ml de solución salina
(suspensión al 2%). El resto de la sangre deposítela en un tubo para obtener
suero.
- Repita el proceso, ahora con la sangre del receptor.
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- Etiquete nueve tubos como: P.M.(s) (prueba mayor-salina), p.m.(s) (prueba
menor-salina), auto(s) (auto testigo-salina), P.M.(a) (prueba mayor-albúmina),
p.m.(a) (prueba menor-albúmina), auto(a) (auto testigo- albúmina), P.M.(fop)
(prueba mayor-ficina o papaína), p.m.(fop) (prueba menor-ficina o papaína),
auto (fop) auto testigo-ficina o papaína).
- A cada tubo agregue los reactivos según se indica en el cuadro siguiente:
Susp. Al 2% Suero del Susp. Al 2% Suero del [Link] Albú- Fiscina o
GR donador donador GR receptor receptor mina 25% papaína
P.M.(s) 1 gota - - 1 gota - -
p.m.(s) - 1 gota 1 gota - - -
Auto(s) - - 1 gota 1 gota - -
P.M.(a) 1 gota - - 1 gota 2 gotas -
p.m.(a) - 1 gota 1 gota - 2 gotas -
Auto(a) - - 1 gota 1 gota 2 gotas -
P.M.(f op) 1 gota - - 1 gota - 1 gota
p.m.(f op) - 1 gota 1 gota - - 1 gota
Auto(f op) - - 1 gota 1 gota - 1 gota
- Mezcle bien todos los tubos y se centrifugan 1 min a 1 000 x g.
- Busque la presencia de aglutinación en todos los tubos y anote los resultados.
- En caso de que no se presente aglutinación en ninguno de los 9 tubos, incube
a 37 ºC durante 30 minutos.
- Centrifugue los tubos de 1 000 x g por 5 minutos y descarte el sobrenadante.
- Lave el paquete celular de cada tubo con solu ción salina y centrifugue a 1 000
x g por 5 minutos. Descarte el sobrenadante. Repita este paso una vez más.
- Agregue una gota de suero de Coombs al paquete celular de cada tubo.
- Busque la presencia de aglutinación.
- Simultáneamente monte 2 tubos adicionales, uno que servirá como testigo
positivo (TP) y el otro como testigo negativo (TN).
- En el tubo marcado como TP coloque 2 gotas de suero comercial anti-D diluído
1:32 y dos gotas de una suspensión al 2% de eritrocitos O Rh(+).
- En el tubo marcado TN se coloque dos gotas de suero comercial diluído 1:32 y
2 gotas de una suspensión al 2% de eritrocitos O Rh(-).
- Incube ambos tubos (TP y TN) a 37 ºC por 30 minutos y procéselos igual a lo
señalado para los otros tubos después de la incubación.
Si hay aglutinación en cualquiera de los tubos marcados como PM o pm, después
de cualquiera de los pasos, indicará que hay incompatibilidad entre el posible
donador y su receptor.
Diagrama de flujo del procedimiento (Realizarlo en la página anterior)
Resultados y observaciones
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Discusión y conclusiones
Aglutinación Pasiva
Los glóbulos rojos de diversas especies han sido ampliamente usados como
soportes, ya que son fáciles de obtener, de ser mantenidos en el laboratorio y de
estandarizarlos. Pueden utilizarse frescos (entre una semana y un mes, si son
conservados en una solución apropiada como la de Alsever) o bien fijados con
formaldehído o glutaraldehído, en cuyo caso pueden conservarse indefinidamente
en congelación o liofilizados. A estas células se les pueden acoplar moléculas
pequeñas o macromoléculas. En el caso de substancias de peso molecular bajo,
se utilizan métodos químicos apropiados para establecer enlaces covalentes que
unan tales moléculas con los grupos químicos de la membrana de eritrocitos. En
cualquier caso los glóbulos rojos que están recubiertos con un antígeno, se les
llama eritrocitos sensibilizados.
Mediante este método se han podido ampliar enormemente las posibilidades de
determinación de anticuerpos que se encuentran en cantidades muy pequeñas
(hasta 0,02 – 0,04 µg de anticuerpos).
Otro soporte usado para estas reacciones es el látex. El látex es una suspensión
coloidal de partículas esféricas de poliestireno de 0,8 a 1,1 µm de diámetro cuyas
superficies están cargadas negativamente. En condiciones adecuadas estas
partículas son capaces de adsorber substancias químicas, particularmente
proteínas. El uso de partículas de látex como soporte de antígenos en pruebas de
aglutinación pasiva, con respecto al uso de eritrocitos, tiene la ventaja de ser un
método que consume menos tiempo, que permite una lectura muy rápida y que
proporciona reactivos que permanecen estables por mucho más tiempo.
Factor reumatoide
Objetivo: Identificar la presencia del Factor reumatoide.
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En el suero de personas con ciertos padecimientos (artritis reumatoide, fiebre
reumática y en general procesos inflamatorios) aparecen anticuerpos dirigidos
contra las propias inmunoglobulinas, principalmente IgG. A estos anticuerpos se
los conoce como factor reumatoide y los más abundantes en estado libre en el
suero pertenecen a la clase IgM. La determinación de factor reumatoide se lleva a
cabo con partículas de látex recubiertas con IgG.
Material
Suero problema,
Placa de vidrio oscuro,
Palillos,
Pipetas automáticas y puntas,
Pipetas Pasteur,
Bulbos de hule,
Solución salina-amortiguador de glicina 0,1 M pH 8,2,
Reactivos de látex-globulina gamma.
Procedimiento
- Prepare una dilución 1:20 del suero problema en la solución salina-
amortiguador de glicina.
- En una división de la placa coloque una gota del suero diluído 1:20.
- Añada una gota del reactivo de látex-globulina gamma.
- Con un palillo mezcle ambas gotas.
- Agite la placa con un movimiento oscilante.
- Busque la presencia de aglutinación de las partículas de látex.
La prueba negativa deberá presentar una suspensión uniforme y en la prueba
positiva deberán aparecer grumos.
Diagrama de flujo del procedimiento (Realizarlo en la página anterior)
Resultados y observaciones
Discusión y conclusiones
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Proteína C-reactiva
Objetivo: Determinar la presencia de proteína C-reactiva.
Esta es una proteína que aparece en el plasma a consecuencia de distintos
procesos patológicos donde se presenten inflamación o necrosis, por ejemplo,
durante la fase aguda de infecciones bacterianas. La aparición de esta proteína
puede descubrirse a las 18 a 24 horas después del inicio de la enfermedad,
alcanza un máximo durante la fase aguda y disminuye simultáneamente con la
severidad de la enfermedad.
La presencia de la proteína C-reactiva se puede determinar con partículas de látex
recubiertas con anti-PCR.
Material
Baño maría a 56 ºC,
Placa de vidrio oscuro,
Palillos,
Pipetas automáticas y puntas,
Pipetas Pasteur,
Bulbos de hule,
Solución salina-amortiguador de glicina 0,1 M pH 8,2,
Reactivo de látex-anti-PCR,
Suero problema.
Procedimiento
- Descomplemente el suero problema mediante incubación en baño maría a 56
ºC por 30 minutos.
- Prepare diluciones 1:5 y 1:50 del suero inactivado, usando como diluyente la
solución salina-amortiguador de glicina.
- En una división de la placa coloque una gota de la dilución 1:5 de suero y en
otra división una gota de la dilución 1:50.
- A cada gota añada una gota del reactivo de látex-anti-PCR.
- Con un aplicador mezcle ambas gotas.
- Agite con movimiento oscilante
- Busque la presencia de aglutinación de las partículas de látex.
La prueba negativa presentará una suspensión uniforme, mientras que la positiva
debe presentar grumos.
Diagrama de flujo del procedimiento (Realizarlo en la página anterior)
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Resultados y observaciones
Discusión y conclusiones
Diagnóstico precoz de embarazo
Objetivo: Identificar la presencia de la gonadotropina coriónica humana (GCH).
La gonadotropina coriónica humana (GCH) es una hormona que aparece en la
orina de mujeres embarazadas o en ciertos tipos de procesos neoplásicos. La
determinación de GCH se puede realizar inmunológicamente mediante una prueba
de inhibición de la aglutinación pasiva. La orina problema se incuba con un
antisuero anti-GCH y después se agregan partículas de látex o eritrocitos fijados
recubiertos con GCH. La sensibilidad de esta prueba es mayor que la resultante
del uso de otros métodos no inmunológicos, por lo que en casos de embarazo, es
de utilidad desde 13 días después de la fecha en que debiera haberse presentado
la menstruación. La persistencia de GCH en niveles altos es sugerente de un
proceso neoplásico.
Material
Orina problema,
Placa de vidrio oscuro,
Palillos,
Pipetas Pasteur,
Bulbo de hule,
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Suero anti-GCH,
Reactivo de látex-GCH.
Procedimiento
- En una de las divisiones de la lámina coloque una gota de suero anti-GCH
- Agregue una gota de la orina problema.
- Mezcle las gotas con un palillo.
- Agregue dos gotas del reactivo de látex-GCH.
- Mezcle con un palillo.
- Mueva la placa con movimiento oscilante.
- Busque la presencia de aglutinación de las partículas de látex.
Si no hay aglutinación, se debe a que en la orina hay GCH la cual se combinó con
los anticuerpos específicos y éstos ya no fueron capaces de aglutinar las
partículas recubiertas con GCH. Si en la orina no hay GCH, se presentará por lo
tanto aglutinación.
Diagrama de flujo del procedimiento (Realizarlo en la página anterior)
Resultados y observaciones
Discusión y conclusiones
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Cuestionario
1. Mencione 5 pruebas clínicas más, en las que se usen los anticuerpos.
Explique con esquemas su fundamento.
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Bibliografía Consultada
PRÁCTICA 7
ANTIESTREPTOLISINAS
Objetivo. Determinar el título de anticuerpos antiestreptolisina, utilizando una
prueba antígeno–anticuerpo en la que la estreptolisina O que se usa para la
titulación por la hemólisis que produce, sirva como indicador del título del
anticuerpo.
Fundamento
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El estreptococo ß-hemolítico grupo A elabora dos hemolisinas: las
estreptolisinas O y S. Todd identificó la estreptolisina O en 1932 y se diferenció
serológicamente varios años más tarde la etreptolisina S. La estreptolisina S es el
factor responsable de las zonas hemolíticas que rodean a las colonias de
estreptococo en placas de agar sangre. Esta estreptolisina no es antigénica.
La estreptolisina O es una proteína (P.M. 60 000 Da) con actividad enzimática que
es producida por casi todas las cepas de estreptococos grupo A y unas pocas
cepas de los grupos C y G. Tiene la capacidad de lisar eritrocitos y leucocitos. Es
destruida a 55 ºC en dos minutos y es irreversiblemente inactivada por
substancias oxidantes tales como peróxido de hidrógeno, yodo, óxido cuproso,
iodoacetamida y aloxano, y reactivada por cisteína o ditionita.
La estreptolisina O se prepara creciendo cualquier cepa de estreptococo grupo A
recientemente aislada que no produzca hemólisis bajo condiciones aeróbicas. La
preparación de estreptolisina O puede ser usada en forma líquida como se
prepara, pero pierde su actividad hemolítica después de 7 a 60 días a 4 ºC. Sin
embargo la estreptolisina liofilizada puede ser estable por dos años.
La prueba está basada en que la estreptolisina se combina cuantitativamente con
la antiestreptolisina, un anticuerpo que aparece en humanos después de la
infección con cualquier estreptococo que produzca estreptolisina O. La base de la
prueba es la neutralización de la actividad hemolítica de la toxina estreptolisina O
en eritrocitos por anticuerpos específicos en suero.
Todas las preparaciones de estreptolisina O son probadas por métodos
serológicos para medir sus actividades hemolíticas y de combinación contra un
antisuero estándar. El suero antiestreptolisina O (ASO) estándar o suero estándar
Todd es el equivalente del estándar internacional de la Organización Mu ndial de la
Salud y contiene 20 000 unidades de ASO por mililitro. Para los propósitos de este
estándar, una dosis mínima hemolítica fue definida como el volumen de
preparación de estreptolisina O que neutraliza 1 U de ASO. Puesto que la unidad
de combinación se ha encontrado que es más constante que la unidad hemolítica,
la fuerza de la preparación de la estreptolisina O generalmente se expresa en
términos de unidades de combinación. Los resultados son reportados en unidades
Todd o unidades internacionales.
Ninguna prueba de anticuerpos es considerada como diagnóstico de un proceso
tal como fiebre reumática aguda o glomerulonefritis aguda. Los títulos de
anticuerpos específicos deberán ser usados sólo como ayuda serológica en el
diagnóstico de infecciones estreptocócicas. No ha sido establecido un título normal
de ASO, puesto que existen muchas variables. Entre los factores que determinan
el título de ASO se incluyen: edad, estado de salud, severidad de la infección,
frecuencia de exposición a infecciones estreptocócicas y la capacidad del
individuo para responder inmunológicamente a la estreptolisina O produciendo
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ASO. Algunos problemas de la prueba son: i) bajos títulos asociados con
infecciones de la piel y sus secuelas, ii) títulos falsos positivos asociados con
enfermedades hepáticas, iii) títulos falsos positivos causados por el crecimiento de
ciertas bacterias en el suero y iv) títulos falsos positivos causados por la oxidaci ón
del reactivo estreptolisina O.
La estreptolisina comercial ha sido preparada y estandarizada para la
determinación del título de antiestreptolisina en el suero problema de personas
con infecciones por estreptococo del grupo A. Este reactivo se presenta en forma
oxidada que es estable pero no es activa.
Desarrollo
Material
Tubos de ensaye de 10 mm x 75 mm,
Pipetas automáticas y puntas,
Gradilla,
Reactivos comerciales para antiestreptolisinas,
Matraz aforado de l litro,
Jeringa,
Solución salina,
Suero problema.
Procedimiento
Activación de la estreptolisina
- Reconstituye con agua destilada con el volumen indicado en la etiqueta del
frasco.
- Para cada 5 ml de la estreptolisina recon stituída adiciona el hidrosulfito de
sodio contenido en uno de los tubos capilares que se adjuntan.
- Agita por inversión hasta que se disuelva, encontrándose ahora en su forma
activa. Una vez añadido el hidrosulfito, la estreptolisina debe ser empleada de
inmediato, ya que al reoxidarse ésta se inactiva. La estreptolisina reconstituida
mientras no sea reducida puede conservarse en congelación sin que su
potencia se altere por períodos hasta de un mes.
Las diluciones del suero problema y la suspensión de glóbulos rojos debes
prepararlas con solución amortiguadora de pH 6,5 - 6,7.
La solución amortiguadora puede prepararse disolviendo 7,4 g de NaCl, 3,7 g de
KH2PO4 y 1,81 g de Na2HPO4 en 1 000 ml de agua destilada ajustándose el pH a
6,5 - 6,7 con solución de NaOH 0,1 N.
Suspensión de glóbulos rojos
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