UNIVERSIDAD DE CARABOBO

FACULTAD DE CIENCIAS Y TECNOLOGÍA

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

DESARROLLO DE UN MÉTODO DE CUANTIFICACIÓN PARA LA

DETERMINACIÓN DE RIBOFLAVINA EN PREMEZCLAS DE ALIMENTOS
PARA ANIMALES

Valencia, diciembre de 2018

 UNIVERSIDAD DE CARABOBO

FACULTAD DE CIENCIAS Y TECNOLOGÍA

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

DESARROLLO DE UN MÉTODO DE CUANTIFICACIÓN PARA LA

DETERMINACIÓN DE RIBOFLAVINA EN PREMEZCLAS DE ALIMENTOS
PARA ANIMALES

AUTOR: Jorge L. Romero L.

TUTOR ACADÉMICO: Dra. Ygmar Jiménez

TUTOR EMPRESARIAL: Ing. Miguel Marquez

Valencia, diciembre de 2018

2
 UNIVERSIDAD DE CARABOBO

FACULTAD DE CIENCIAS Y TECNOLOGÍA

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

“Desarrollo de un método de cuantificación para la determinación de riboflavina en premezclas

de alimentos para animales”.

AUTOR: Jorge Romero

TUTOR ACADÉMICO: Dra. Ygmar Jiménez

TUTOR EMPRESARIAL: Ing. Miguel Márquez

RESUMEN

Se desarrolló y validó un método analítico, basado en espectrofotometría UV-Visible, para

la cuantificación de riboflavina en tres tipos de premezclas de alimentación para animales (Blend
pollo engorde (BPE), Blend gallina postura RP (BGR) y Blend gallina cría RP (BGC)), dentro de
una empresa agroindustrial. El tratamiento de las muestras se realizó utilizando hidróxido de potasio
8% p/v y ácido acético glacial; la detección se realizó a una longitud de onda de 444 nm
empleándose un detector de doble fotodiódico de silicio. Fue posible emplear una sola curva de
calibración para los tres productos en el intervalo de 50-150% (con respecto a la concentración
declarada de cada producto), el ANOVA realizado indica el ajuste de la curva de calibración a un
modelo lineal. Se obtuvo como límite de detección (LOD) 0,12 ppm y como límite de
cuantificación (LOQ) 0,38 ppm; la precisión evaluada en términos de repetibilidad y precisión
intermedia con coeficientes de variación de 1,11% para BPE, 1,87% para BGR, 1,46 % para
BGC, los cuales cumplen con los criterios de aceptación establecidos en el trabajo. Se verificó la
robustez del método, con respecto a pequeñas variaciones en el volumen de hidróxido de potasio,
volumen de ácido acético y estabilidad, mediante la aplicación de un diseño de experimentos
factorial 23. La incertidumbre del método ratificó que éste es apropiado para determinar si las
cantidades de activo están dentro de las especificaciones establecidas para su aprobación. Se
concluyó que el método desarrollado satisface los requerimientos establecidos en el protocolo
interno de la empresa, siendo éste idóneo para la cuantificación de riboflavina.

3
 UNIVERSIDAD DE CARABOBO

FACULTAD DE CIENCIAS Y TECNOLOGÍA

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

“Desarrollo de un método de cuantificación para la determinación de riboflavina en premezclas

de alimentos para animales”.

AUTOR: Jorge Romero

TUTOR ACADÉMICO: Dra. Ygmar Jiménez

TUTOR EMPRESARIAL: Ing. Miguel Márquez

ABSTRACT

An analytical method was developed and validated, based on UV-Visible

spectrophotometry, for the quantification of riboflavin in three types of feed premixes for animals
(Blended Chicken Blend (BPE), Posture Blended Breed RP (BGR) and Breeding Fowl Blend RP
(BGC), within an agroindustrial company. The treatment of the samples was carried out using 8%
w/v potassium hydroxide and glacial acetic acid; the detection was carried out at a wavelength of
444 nm using a double photodiodic silicon detector. It was possible to use a single calibration curve
for the three products in the range of 50-150% (with respect to the declared concentration of each
product), the ANOVA performed indicates the adjustment of the calibration curve to a linear model.
The detection limit (LOD) was 0.12 ppm and the limit of quantification (LOQ) was 0.38 ppm; the
precision evaluated in terms of repeatability and intermediate accuracy with coefficients of variation
of 1.11% for BPE, 1.87% for BGR, 1.46% for BGC, which meet the acceptance criteria established
in the work. The robustness of the method was verified, with respect to small variations in the
volume of potassium hydroxide, volume of acetic acid and stability, by means of the application of
a factorial 23 designs. The uncertainty of the method confirmed that it is appropriate to determine if
the amounts of assets are within the specifications established for approval. It was concluded that
the developed method satisfies the requirements established in the internal protocol of the company,
being this one suitable for the quantification of riboflavin.

4
 DEDICATORIA

Para la mujer que me guio y enseñó a leer, escribir, tomar mis propias decisiones y me
apoyó desde el principio hasta el final. Doris Isorinda Lopez Vargas, mi mamá.

5
 AGRADECIMIENTOS

Primeramente a Dios, por permitirme culminar esta meta personal y profesional.

A mi madre, por estar siempre a mi lado, por enseñarme que no hay mejor forma de vivir, que con
el corazón lleno de bondad y humildad, gracias infinitas.

A mi tutora Dra. Ygmar Jiménez, por su paciencia y dedicación para impartir sus conocimientos y
orientarme durante el desarrollo de este trabajo especial de grado.

A la empresa ADD & TECH C.A. por abrirme sus puertas para la realización de este trabajo
especial de grado y por todo su apoyo.

A mi tutor empresarial Miguel Márquez, por darme todas las herramientas que necesitaba y su
experiencia en el área.

Al equipo del laboratorio de Química General y Analítica de FACYT, por recibirme con los brazos
abiertos, ser una segunda familia en mis años de estudios y llevar mis días con mucho ánimo y
entusiasmo, gracias a todos ustedes (Dioleidy, Andreina, Maria Alexandra, Dulce, Jesús, Mely,
Deurman, Adriana, Juan y María Fernanda).

A cada uno de mis compañeros de estudio, por su amistad incondicional, por ayudarme y apoyarme
en mis estudios y enseñarme que la vida se debe tomar con mucha calma y que todo va a salir bien
siempre (Vanessa, Yaniret, Roselvic, Mhihalay, Keivys, Steffany, Danny, Carmelo, Carolina, Clara,
Katherine, Geraldine).

A Stephanie, más que una prima es una hermana, a pesar de la distancia geográfica que nos separa,
siempre estás presente en mi mente y en mi corazón.

A Libia y Alfredo, por su gran amistad y los momentos que hemos compartidos juntos.

A mi familia, que de alguna manera siempre estuvieron brindándome su apoyo para poder lograr
esta meta.

A mis profesores de FACYT que a lo largo de la carrera transmitieron sus conocimientos,

dedicación y constancia en mi formación académica quienes marcaron mi vida profesional.

6
Contenido
Contenido ................................................................................................................................ 7
INTRODUCCIÓN ...................................................................................................................... 12
Capítulo 1. EL PROBLEMA ....................................................................................................... 14
1.1 Planteamiento y justificación del problema ..................................................................... 14
1.2 Objetivo General ............................................................................................................... 16
1.2.1 Objetivos específicos ................................................................................................. 16
1.3 Alcance y limitaciones ....................................................................................................... 16
1.4 Antecedentes .................................................................................................................... 17
Capítulo 2. MARCO TEÓRICO. .................................................................................................. 18
2.1 Fundamentos de la espectrofotometría .............................................................................. 18
2.2 Espectroscopia UV-Visible ............................................................................................... 18
2.3 Ley de Lambert-Beer. ....................................................................................................... 18
2.4 Validación de métodos analíticos ...................................................................................... 20
2.5 Parámetros de validación .................................................................................................. 21
2.6.1 Especificidad ............................................................................................................. 22
2.6.2 Linealidad .................................................................................................................. 22
2.6.3 Límites de detección y de cuantificación .................................................................. 24
2.6.4 Exactitud.................................................................................................................... 24
[Link] Veracidad .................................................................................................................. 25
[Link] Precisión .................................................................................................................... 26
[Link] Incertidumbre ............................................................................................................ 27
2.6.5 Robustez .................................................................................................................... 29
2.6.6 Estabilidad ................................................................................................................. 29
2.6.7 Aplicabilidad ............................................................................................................. 30
2.7 ANOVA ............................................................................................................................ 30
2.7.1 Verificación de los supuestos ANOVA..................................................................... 33
Normalidad................................................................................................................................ 34
Prueba de Shapiro-Wilks para normalidad ............................................................................... 34
Varianza constante .................................................................................................................... 35
Prueba de Bartlett para homogeneidad de varianzas .............................................................. 36

7
 Independencia ........................................................................................................................... 37
Prueba de Durbin-Watson para comprobar independencia..................................................... 37
3.1 Esquema General de la metodología ................................................................................ 41
3.2 Equipos .............................................................................................................................. 41
3.3 Reactivos ........................................................................................................................... 41
3.4 ETAPA (1): AJUSTE DEL MÉTODO ...................................................................................... 42
3.4.1 Tratamiento de la muestra........................................................................................ 42
3.5 ETAPA (2): DETERMINACIÓN DE LOS PARÁMETROS DE VALIDACIÓN .............................. 42
3.5.1 Especificidad .............................................................................................................. 42
3.5.2 Linealidad .................................................................................................................. 43
3.5.3 Límites de Detección (LOD) y Cuantificación (LOQ) .................................................. 44
3.5.4 Exactitud. ................................................................................................................... 44
[Link] Veracidad: ................................................................................................................. 44
[Link] Repetibilidad: ............................................................................................................ 44
[Link] Precisión intermedia: ................................................................................................ 45
3.5.5 Evaluación de la robustez .......................................................................................... 45
Capítulo 4. DISCUSIÓN DE RESULTADOS. ................................................................................. 47
4.1 Especificidad ...................................................................................................................... 47
4.2 Linealidad .......................................................................................................................... 49
4.3 Límites de Detección (LOD) y Cuantificación (LOQ) .......................................................... 52
4.4 Precisión ............................................................................................................................ 53
4.5 Veracidad .......................................................................................................................... 54
4.6 Determinación de la Incertidumbre .................................................................................. 56
4.7 Robustez ............................................................................................................................ 57
4.7.1 Blend pollo engorde. ................................................................................................. 57
4.7.2 Blend postura RP. ...................................................................................................... 60
4.7.3 Blend Gallina Cria RP. ................................................................................................ 62
Capítulo 5. CONCLUSIONES .............................................................................................................. 65
APENDICE ............................................................................................................................... 66
BIBLIOGRAFÍA......................................................................................................................... 75

8
Índice de tablas

Tabla 2.1. Parámetros de validación a evaluarse dependiendo del típo de método ......................... 21
Tabla 3.1. Productos que maneja la empresa AD & TECH C.A. que contienen vitamina B2. ......... 43
Tabla 3.2. Esquema metodológico del ensayo de linealidad............................................................. 43
Tabla 3.3. Esquema metodológico del ensayo de veracidad y repetibilidad. ................................... 45
Tabla 3.4. Condiciones a modificar al método analítico en el ensayo de robustez .......................... 46
Tabla 4.1. Absorbancias obtenidas a 444 nm de las muestras en el estudio de la especificidad...... 49
Tabla 4.2. Parámetros estadísticos obtenidos en el estudio de la linealidad del método para la
determinación de riboflavina en premezcla de alimentos para animales. ........................................ 50
Tabla 4.3 Resultados de las pruebas estadísticas de Shapiro-Wilk y Bartlett para los supuestos de
normalidad y varianza constante respectivamente. .......................................................................... 52
Tabla 4.4 Límites de detección y cuantificación para el método de determinación riboflavina por
Espectrofotometría UV-Visible. ........................................................................................................ 52
Tabla 4.5. Repetibilidad y precisión intermedia del método para la determinación de riboflavina
por Espectrofotometría UV-Visible. .................................................................................................. 53
Tabla 4.6 Estudio de la exactitud del método para la determinación de riboflavina por
Espectrofotometría UV-Visible. ........................................................................................................ 55
Tabla 4.7. Concentraciones de riboflavina obtenidas al aplicar el diseño de experimentos para
evaluar la robustez del método para el Blend pollo engorde. .......................................................... 57
Tabla 4.8. Coeficiente de determinación del modelo ajustado en el estudio de riboflavina por
espectrofotometría UV visible para el Blend pollo engorde. ............................................................ 59
Tabla 4.9. Concentraciones de riboflavina obtenidas al aplicar el diseño de experimentos para
evaluar la robustez del método para el Blend postura RP. ............................................................... 60
Tabla 4.10. Coeficiente de determinación del modelo ajustado en el estudio de riboflavina por
espectrofotometría UV visible para el Blend postura RP. ................................................................ 61
Tabla 4.11. Concentraciones de riboflavina obtenidas al aplicar el diseño de experimentos para
evaluar la robustez del método para el Blend Gallina Cria RP. ...................................................... 62
Tabla 4.12. Coeficiente de determinación del modelo ajustado en el estudio de riboflavina por
espectrofotometría UV visible para el Blend pollo engorde. ............................................................ 64
Tabla A.1: Datos empleados para el estudio de la linealidad del método........................................ 66
Tabla A.2. Concentración de riboflavina obtenida durante el ensayo de repetibilidad de cada
producto. ........................................................................................................................................... 66
Tabla A.3. Concentración de riboflavina obtenida durante el ensayo de precisión intermedia de
cada producto.................................................................................................................................... 67
Tabla A.4. Datos empleados para el estudio de la veracidad del método. ....................................... 68

9
Tabla A.5. ANOVA del modelo ajustado en el estudio de la robustez del método............................ 69

Índice de figuras

Figura 2.1. Regiones del espectro electromagnético al absorber la luz. El espectro visible va desde
380 a 780 nm. (Carmen, 2001) .......................................................................................................... 18
Figura 2.2. Experimento espectrofotométrico de haz simple. Po, irradiancia del haz que entra en la
muestra. P, irradiancia del haz que sale de la muestra. B, longitud del camino óptico a través de la
muestra (Arenas Sosa & López Sánchez, 2004) ................................................................................. 19
Figura 2.3. Comportamiento de la energía transmitida con la concentración y la distancia b.
(Arenas Sosa & López Sánchez, 2004) ............................................................................................... 19
Figura 2.4. Ley de Lambert-Beer. Recta de calibrado. (Serrano Martínez, 2007) ............................. 20
Tabla 2.1. Parámetros de validación a evaluarse dependiendo del típo de método ........................ 21
Figura 2.5. Estructura química de riboflavina (Vitamina B2). (Bueno-Solano, y otros, 2009) .......... 39
Figura 2.6. Espectro de absorción de la Riboflavina 5 X 10-5 M pH 7.0 (Buffer de fosfato). (Ahmad,
Fasihullah, & H.M. Vaid, 2006).......................................................................................................... 40
Figura 3.1. Esquema general de la metodología............................................................................... 41
Figura 3.2. Esquema de preparación de muestras que contiene riboflavina y solución estándar de
riboflavina a emplear durante el desarrollo del método analítico para la cuantificación de
riboflavina por Espectroscopia UV-Visible. ....................................................................................... 42
Figura 4.1. Espectro de absorción ultravioleta de la riboflavina obtenida durante el desarrollo del
método analítico. .............................................................................................................................. 47
Figura 4.2. Espectros de absorción ultravioleta de riboflavina estándar, en la matriz y blanco. (a)
Blend Gallina cria. (b) Blend pollo engorde. (c) Blend Gallina postura RP. ....................................... 49
Figura 4.3 Curva de calibración para la determinación de riboflavina en premezclas de alimentos
para animales. ................................................................................................................................... 50
Figura 4.4. Gráfico de residuos vs número de filas para verificar el supuesto de independencia en el
modelo lineal propuesto para la curva de calibración. ..................................................................... 51
Figura 4.5. Diagrama de Pareto de los efectos en el estudio de la robustez del método para la
cuantificación de riboflavina por espectrofotometría UV-Visible en Blend pollo engorde. .............. 58
Figura 4.6. Diagrama de Pareto de los efectos en el estudio de la robustez del método para la
cuantificación de riboflavina por espectrofotometría UV-Visible en Blend postura RP. ................... 61
Figura 4.7. Diagrama de Pareto de los efectos en el estudio de la robustez del método para la
cuantificación de riboflavina por espectrofotometría UV-Visible en Blend Gallina Cria RP.............. 63
Figura A.1. Gráfico de residuos vs predichos para el supuesto de varianza constante para la
cuantificación de riboflavina por espectrofotometría UV-Visible en Blend pollo engorde. ............. 70
10
Figura A.2. Gráfico de probabilidad normal para residuos para el supuesto de normalidad para la
cuantificación de riboflavina por espectrofotometría UV-Visible en Blend pollo engorde. .............. 70
Figura A.3. Gráfico de residuos vs orden de ejecución para el supuesto de independencia para la
cuantificación de riboflavina por espectrofotometría UV-Visible en Blend pollo engorde. ............. 71
Figura A.4. Gráfico de probabilidad normal para residuos para el supuesto de normalidad para la
cuantificación de riboflavina por espectrofotometría UV-Visible en Blend Postura RP. ................... 71
Figura A.5. Gráfico de residuos vs predichos para el supuesto de varianza constante para la
cuantificación de riboflavina por espectrofotometría UV-Visible en Blend postura RP. ................... 72
Figura A.6. Gráfico de residuos vs orden de ejecución para el supuesto de independencia para la
cuantificación de riboflavina por espectrofotometría UV-Visible en Blend Postura RP. ................... 72
Figura A.8. Gráfico de probabilidad normal para residuos para el supuesto de normalidad para la
cuantificación de riboflavina por espectrofotometría UV-Visible en Blend Gallina Cria RP.............. 73
Figura A.9. Gráfico de residuos vs predichos para el supuesto de varianza constante para la
cuantificación de riboflavina por espectrofotometría UV-Visible en Blend Gallina Cria RP.............. 73
Figura A.10. Gráfico de residuos vs orden de ejecución para el supuesto de independencia para la
cuantificación de riboflavina por espectrofotometría UV-Visible en Blend Gallina Cria RP.............. 74

11
 INTRODUCCIÓN

La elaboración de alimentos balanceados para animales es de vital importancia, debido a

que suministrar las cantidades correctas de nutrientes en las diferentes etapas de crecimiento,
garantiza una buena producción, eficiencia y eficacia. (Maya Henao, 2016)

Los piensos desempeñan un papel líder en la industria global de alimentos, al permitir la

producción económica de productos de origen animal en todo el mundo. Los piensos fabricados en
plantas se utilizan para desarrollar y mantener animales destinados a alimento para consumo
humano, animales que producen lana y cuero, y de otros productos bajo una amplia gama de
condiciones de producción.

La producción intensiva y eficiente de leche, carne, huevos y otros alimentos requiere de

piensos mezclados. Los piensos inocuos permiten que las granjas garanticen la inocuidad
alimentaria, reduzcan los costos de producción, mantengan o aumenten la calidad y la consistencia
del alimento, y mejoren la salud animal y bienestar al brindar una nutrición adecuada en cada fase
de crecimiento y producción. (FAO PRODUCCIÓN Y SANIDAD ANIMAL, 2014)

Las vitaminas y minerales son sumamente importantes en la adición en piensos por

considerarse micro-nutrientes esenciales, por lo que su ausencia, deficiencia o pobre utilización
pueden causar: enfermedades, depresión del crecimiento, infertilidad y baja producción, que son
equivalentes a pérdidas. (SALAZAR TORRES, 2011) Los ingredientes naturales de las raciones
para animales son normalmente deficientes en varios minerales y vitaminas, por lo que se hace
preciso su suplementación externa. De este modo, la premezcla puede contener todas aquellas
vitaminas y los minerales que no son aportados en suficiente cantidad mediante las materias primas
que componen la ración, como aportar, conjuntamente, determinados aditivos considerados
necesarios para mejorar los resultados zootécnicos de los animales. El uso de premezclas facilita la
dinámica de las fábricas de pienso y asegura una óptima distribución en la mezcla final de aquellos
ingredientes que entran en cantidades pequeñas.

Para formular correctores es importante conocer las necesidades del animal y la

disponibilidad de los macro y micronutrientes tanto de las materias primas del pienso, como de las
fuentes externas utilizadas. Cuando se habla de “correctores” en Nutrición Animal no se está
hablando de realizar ninguna “corrección” en la fórmula del pienso, sino de cubrir las deficiencias
vitamínicas y minerales que los componentes de ésta presentan y que su no suplementación
supondría algún tipo de alteración en los parámetros productivos o sanitarios de los animales.
(Fernández Oller, 2014) Se sabe que los componentes nutricionales, como las vitaminas, se
degradan durante la preparación, la preservación y el almacenamiento. Estos problemas surgen a
través de fallas causadas por la variación en las condiciones ambientales, pH, humedad y
temperatura.

Un problema para las empresas es la necesidad de monitorear y controlar los niveles de

micronutrientes (premezclas) agregados durante la producción de alimentos, para cumplir con los
requisitos de etiquetado, calidad y seguridad. (O. KADARA, D. HAGGETT, & J. BIRCH, 2006)
12
Los métodos analíticos son ampliamente utilizados en la industria para la identificación y
cuantificación de los componentes activos, impurezas y productos de degradación en materias
primas y formas terminadas, así como para la determinación de propiedades específicas que
influyen en la acción del producto.

La validación de un método analítico provoca mayor fiabilidad y aceptación de los datos

generados, estando estas en proporción con la calidad del proceso de obtención de los mismos. Se
han venido formulando diferentes programas y parámetros por varias instituciones para asegurar la
confiabilidad de los métodos analíticos. Entre los entes reguladores más importante tenemos la
Food and Drug Administration (FDA), la International Conferenceon Amonization (ICH), la
National Association of Testing Authorities (NATA) quienes aseguran la calidad de los productos.
Su realización es una tarea que puede ser tediosa, pero las consecuencias de no hacerlo, son una
pérdida de tiempo, dinero y recursos. (Garcia Quispe, 2016)

Los métodos para los análisis, en los casos más favorables son verdaderamente específicos.
En consecuencia, la separación del analito de las posibles interferencias es a menudo una etapa de
vital importancia en los procedimientos analíticos. Sin duda, uno de los métodos más comúnmente
utilizado para realizar cuantificaciones analíticas es la espectrofotometría UV - visible.

El laboratorio analítico y su personal tienen una clara responsabilidad de cumplir con las
regulaciones y corresponder a la confianza del cliente, asegurando la respuesta correcta a la parte
analítica del problema. En este afán de garantizar productos de calidad para el consumidor, surgió la
idea de proponer este trabajo especial de grado en la empresa ADD & TECH C.A.; titulado:
"DESARROLLO DE UN MÉTODO DE CUANTIFICACIÓN PARA LA DETERMINACIÓN DE
RIBOFLAVINA EN PREMEZCLAS DE ALIMENTOS PARA ANIMALES".

13
Capítulo 1. EL PROBLEMA

1.1 Planteamiento y justificación del problema

ADD & TECH C.A. es una empresa que proporciona aditivos nutritivos, no nutritivos y
materia prima al sector agroindustrial a nivel nacional. Desde 2008 la empresa ha ofrecido
suplementos que son efectivos y seguros, diseñados para un desempeño óptimo en el alimento con
los más altos estándares de calidad, eficiencia y competitividad para satisfacer las necesidades de
los clientes, contribuyendo al desarrollo socioeconómico del país.

La empresa siempre busca mantener sus estándares de calidad por lo cual se encarga de
evaluar periódicamente las materias primas para la fabricación y valoración de sus productos ya
terminados, con el fin de que estos cumplan con las especificaciones de calidad establecidas.
Actualmente ADD & TECH C.A. se encuentra trabajando junto a otra empresa privada para el
desarrollo de una nueva línea de premezclas (Blend) para la producción de alimentos para aves de
corral, cerdos y camarones.

Uno de los activos más importantes que se encuentra en esta nueva línea, es la vitamina B2
(riboflavina), una vitamina hidrosoluble importante para el crecimiento del cuerpo y la producción
de glóbulos rojos, también ayuda en la liberación de energía de las proteínas. La riboflavina la
pueden sintetizar todos los vegetales y muchos microorganismos, pero no los animales. La
Vitamina B2 es necesaria para el metabolismo de todos los animales, también como parte de
muchas enzimas esenciales para la utilización de los carbohidratos, las grasas y las proteínas.

Un problema para las empresas que fabrican alimentos enriquecidos es la necesidad de

controlar los niveles añadidos de premezclas durante la producción de alimentos, para cumplir con
los requisitos de etiquetado, calidad y seguridad. Se sabe que los componentes nutricionales, como
las vitaminas, se degradan durante la preparación, la preservación y el almacenamiento. Estos
problemas surgen a través de fallas causadas por la variación en las condiciones ambientales, pH,
humedad y temperatura.

La Organización de las naciones unidas para la agricultura y la Alimentación (FAO)

propone, como estrategia para lograr la producción de alimentos sanos y seguros (inocuos), el
enfoque relativo a la calidad e inocuidad de los alimentos basado en la cadena alimentaria. Este,
parte del principio de que todos los que intervienen en la cadena alimentaria comparten la
responsabilidad del suministro de alimentos inocuos, sanos y nutritivos.

Sin embargo, la falta de responsabilidad sobre los métodos de procesamiento y mecanismos

de control en el manejo de los alimentos pueden potenciar los riesgos sobre la salud. Es
precisamente en la industria de piensos o alimentos para animales, donde se han detectado la
mayoría de los problemas de inocuidad que han afectado tanto la salud animal como la humana.
Todo éste entorno mundial de producción y comercialización de alimentos para animales debe ser
regulado y normalizado para maximizar el objetivo de seguridad alimentaria de la FAO.

14
 Para seguir cumpliendo la política y los objetivos que tiene la empresa, entre los cuales está
mantener la excelencia de los productos, existe una necesidad urgente de tener un procedimiento
rápido para el análisis cuantitativo de premezclas, en especial la cantidad de vitaminas que deben
contener las mismas y es sumamente importante que los métodos analíticos estén validados.

Es debido a esto que se debe desarrollar un método que sea viable y confiable para la
cuantificación de riboflavina en las diferentes premezclas que se encuentra manejando la empresa
actualmente, siendo una buena alternativa un método por espectroscopia UV-Visible, debido a que
tiene un tratamiento de la muestra sencillo, reproducibilidad entre análisis y rápido tiempo de
respuesta, además se dispone en el laboratorio el equipo necesario para su aplicación.

15
 1.2 Objetivo General

Desarrollar un método analítico para la cuantificación de riboflavina (vitamina B2)

contenido en diferentes premezclas para alimentos de animal por espectroscopia UV-Visible.

1.2.1 Objetivos específicos

1. Identificar todos los requisitos necesarios para desarrollar el método.

2. Ajustar las condiciones experimentales del método, estableciendo el procedimiento de

trabajo.

3. Establecer los parámetros analíticos de validación y sus criterios de aceptabilidad.

4. Evaluar que los resultados obtenidos en la validación del método analítico cumplen los
criterios establecidos.

1.3 Alcance y limitaciones

El presente trabajo está enfocado a determinar los parámetros de validación especificados

en la Farmacopea de los Estados Unidos de América (Farmacopea de los Estados Unidos de
América 35, 2011).

•Especificidad

•Linealidad

•Exactitud

•Precisión

•Robustez

Respecto a la precisión, se determinó únicamente la repetibilidad y la precisión intermedia

(distintos días y distinto analista dentro del mismo laboratorio), dejando por fuera la
reproducibilidad que requiere el apoyo de otros laboratorios de ensayo con los que no es posible
contar para este trabajo.

Debido a larga línea de premezclas que contiene la empresa, la validación se enfocó solamente
en tres productos: Blend pollo engorde, Blend gallina postura RP y Blend gallina cría RP

Por último, no es posible contar con un patrón primario del principio activo y componentes
de la matriz, sin embargo, se dispone de patrones secundarios con concentraciones certificadas por
cada proveedor.

16
 1.4 Antecedentes

(Weimar & Heims, 1975)

Presentaron aspectos seleccionados de las propiedades químicas y físicas de las flavinas,

entre ellas, la biosíntesis de la riboflavina. Determinaron los efectos que tiene diferentes solventes
en el espectro de la riboflavina, donde observaron que el espectro UV-visible en solución acuosa
consiste en cuatro bandas principales centradas alrededor de 220, 266, 375 y 447 nm. La banda de
375 nm es la que más se ve afectada por el disolvente, generalmente cambiando a longitudes de
onda más cortas (desplazamiento azul) con una polaridad decreciente del disolvente. Observaron
que la posición de la banda visible a 445 nm no se ve muy afectada al utilizar diferentes solventes.
De este trabajo se tomó el solvente utilizado para la riboflavina y la longitud de onda más estable
del compuesto como punto de partida para el desarrollo del método.

(Ahmad; Fasihullah & Vaid, 2005)

Estudiaron el efecto de la intensidad de la luz y las longitudes de onda en las reacciones de

fotodegradación de las soluciones de riboflavina, en presencia de un tampón de fosfato utilizando
tres fuentes de radiación UV y visible. Observaron que las velocidades y la magnitud de las dos
principales reacciones de fotodegradación de la riboflavina en el tampón fosfato; fotoadicción y
fotorreducción dependen de la intensidad de la luz así como de las longitudes de onda de la
irradiación. La fotoadición se ve facilitada por la radiación UV y produce ciclodehidroriboflavina,
mientras que la fotorreducción da como resultado la fotólisis normal y produce el lumicromo y la
lumiflavina. Las relaciones de los fotoproductos de las dos reacciones a diferentes concentraciones
varían con la fuente de radiación y son más altas con la radiación UV que las de la radiación visible.
La velocidad es mucho más rápida con la radiación UV que causa una degradación del 25% de una
solución de riboflavina a 10-5 M en 7,5 minutos en comparación con las radiaciones visibles que
ocurre en 150-330 minutos. De este trabajo se tomaron las sugerencias al cuantificar la riboflavina,
el efecto que puede ocurrir al estar presente en luz UV-Visible.

(Garcia, 2016)

Planteó y desarrolló la validación de la técnica analítica por espectrofotometria UV-Visible

para la cuantificación e identificación de riboflavina en materia prima para la preparación de
medicamentos, evaluándose parámetros como: Especificidad o Selectividad, Linealidad, Precisión y
exactitud. Para la preparación de las muestras utilizó como reactivos solución de Hidróxido de
Sodio diluido, ácido acético glacial y acetato de sodio 14g/L. Una vez definida las condiciones de
trabajo, realizó los respectivos análisis para la evaluación de los parámetros de validación. La
linealidad, obtuvo en el intervalo de 80-120% un coeficiente de correlación de 0,999 determinando
con esto que el método es lineal. Verificó la exactitud obteniendo un 99,4% de recuperación, los
coeficientes de variación de la precisión y reproducibilidad adecuada fueron de 0,37 y 0,05%
respectivamente. Cabe mencionar que el tratamiento de la muestra y el protocolo de validación
utilizado por este autor han sido empleados como punto de partida, para el desarrollo del método.

17
Capítulo 2. MARCO TEÓRICO.

2.1 Fundamentos de la espectrofotometría

El término espectrofotometría hace referencia a una serie de técnicas analíticas que se

fundamentan en la espectroscopia atómica y molecular. Permiten obtener información a partir del
análisis de las distintas interacciones de las radiaciones electromagnéticas con la materia. (UBA,
2016)

En la química analítica, una manera práctica y precisa de conocer la concentración de una

solución consiste en medir el efecto que dicha concentración tiene sobre la intensidad de un haz de
radiación que incide sobre ella. (UBA, 2016)

Debido a la existencia de diferentes tipos de energía: de los electrones en sí, de los

movimientos vibracionales de las moléculas, de la rotación de las mismas, entre otras, las
moléculas pueden interaccionar con radiaciones electromagnéticas de un rango muy amplio de
longitudes de onda, dando lugar a distintos tipos de espectroscopias según las diferentes regiones.
Un esquema podría ser el siguiente. (Carmen, 2001)

Figura 2.1. Regiones del espectro electromagnético al absorber la luz. El espectro visible va desde
380 a 780 nm.

2.2 Espectroscopia UV-Visible

La espectroscopia visible es una de las técnicas empleadas en el análisis químico. Para que
una substancia sea activa en el visible debe ser colorida: el que una substancia tenga color, es
debido a que absorbe ciertas frecuencias o longitudes de onda del espectro visible y transmite otras
más. (Universidad de Chihuahua, 2005)

2.3 Ley de Lambert-Beer.

La cantidad de radiación electromagnética absorbida por un analito se puede relacionar

cuantitativamente con la concentración de dichas sustancias en solución. La transmitancia (T) se
18
define como la fracción de radiación incidente trasmitida por la disolución. Si la potencia radiante
que incide sobre la disolución es Po y P la potencia radiante que sale, entonces. (Arenas Sosa &
López Sánchez, 2004)

Figura 2.2. Experimento espectrofotométrico de haz simple. Po, irradiancia del haz que entra en la
muestra. P, irradiancia del haz que sale de la muestra. B, longitud del camino óptico a través de la
muestra.

𝑷
𝑻= Ecuación 2.1
𝑷𝒐

Además, se observa que la potencia de la energía trasmitida disminuye geométricamente

(exponencialmente) con la concentración C y con la distancia b recorrida a través de la disolución.

Figura 2.3. Comportamiento de la energía transmitida con la concentración y la distancia b.

Donde k y k´ son constantes de proporcionalidad y combinando ambas queda así:

T = 10– εbc Ecuación 2.2

Aplicando logaritmos la formula queda así. (Arenas Sosa & López Sánchez, 2004)

19
 -Log (T)= εbc Ecuación 2.3

La absorbancia se define como. (Harris, 2007)

𝑷𝒐
𝑨 = 𝑳𝒐𝒈( 𝑷 ) = −𝑳𝒐𝒈(𝑻) Ecuación 2.4

Al combinar la ecuación 2.6 y la ecuación 2.7, obtenemos la siguiente ecuación

A = εbc Ecuación 2.5

Que es la expresión matemática de la Ley de Beer y que indica la relación directa entre la
absorbancia de un analito y su concentración en disolución. Cuando se usan unidades molares se
llama absortividad molar (ε) y se expresa en L/mol*cm. La probabilidad de absorción en una
longitud de onda está caracterizada por el coeficiente de absorción molar a esa longitud de onda. Si
la luz de intensidad I0 pasa a través de una sustancia de espesor b (en cm) y concentración molar c,
la intensidad de la luz transmitida obedece la Ley de Lambert-Beer. (Arenas Sosa & López
Sánchez, 2004)

Figura 2.4. Ley de Lambert-Beer. Recta de calibrado.

2.4 Validación de métodos analíticos

La validación se define como el establecimiento de pruebas de laboratorio, debidamente

documentadas, que aportan un alto grado de seguridad de que un proceso planificado se efectuará
uniformemente en conformidad con los resultados previstos especificados, es decir, que dicho
proceso será apropiado para el uso propuesto. Los estudios de validación son aplicables a los
20
métodos analíticos no codificados en las Farmacopeas, a los equipos tanto de producción como
analíticos, a las computadoras, programas y sistemas, así como a los servicios del establecimiento y
a los procesos. (Volonté & Quiroga, 2013)

Los objetivos de una validación son otorgar Confiabilidad, Seguridad y Efectividad al proceso que
se está validando. (Volonté & Quiroga, 2013)

Las validaciones pueden ser retrospectivas cuando combinan nuevos criterios con la experiencia
adquirida anteriormente o prospectivas cuando se inicia desde un comienzo una validación. La
revalidación se realiza cuando procedimientos o métodos ya validados han sufrido alguna
modificación o cambios en la droga o en la composición del producto y por lo tanto se deben volver
a validar. También se debe realizar cuando la matriz o la concentración de analito son distintas a las
originalmente analizadas. (Volonté & Quiroga, 2013)

2.5 Parámetros de validación

Todos los ensayos o mediciones realizadas en la validación son con el fin de poder realizar
las pruebas de parámetros de validación los cuales son la selectividad, linealidad, sensibilidad,
limites, exactitud, precisión, robustez y aplicabilidad, en la Tabla 2.1 se muestra que parámetros
deben evaluarse dependiendo del tipo de método. (Instituto de Salud Pública Chile, 2010)

Tabla 2.1. Parámetros de validación a evaluarse dependiendo del típo de método

Parámetro a Método Método cuantitativo

evaluar cualitativo Normalizado Modificado Nuevo
Especificidad Si No Si Si
Linealidad No Si Si Si
Sensibilidad No Si o No Si Si
Limites Si Si o No Si Si
Precisión No Si Si Si
Veracidad No Si o No Si o No Si
Robustez No No Si o No Si
Aplicabilidad Si Si Si Si
(Instituto de Salud Pública Chile, 2010)

21
 2.6.1 Especificidad
La especificidad es la capacidad de evaluar inequívocamente el analito en presencia de
componentes, que se puede esperar que estén presentes. Típicamente, éstas pueden incluir
impurezas, productos de degradación, matriz, etc. (Jimidar, Heylen, & De Smet, 2007)

Una prueba de especificidad comúnmente utilizada, consiste en analizar un mínimo de tres

testigos reactivos, tres blancos de matriz y tres muestras o estándares de concentración conocida del
analito de interés. Se deben comparar las lecturas (señales de medición) obtenidas para cada caso, y
observar si existen variaciones entre los testigos reactivos, blancos de matrices y estándares o
muestras con analito. Si se encuentran diferencias significativas deberán ser identificadas y en lo
posible eliminadas. (Instituto de Salud Pública Chile, 2010)

La falta de especificidad puede ser compensada por otros métodos analíticos de apoyo, pero
finalmente el método o métodos de ensayo deben ser capaces de asegurar la identidad de un analito
(métodos para pruebas de identificación), asegurarse de que el método permite una declaración
exacta del contenido de impurezas (métodos para prueba de pureza), proporcionan un resultado
exacto, que permite una declaración precisa sobre el contenido o la potencia del analito en la
muestra (métodos para cuantificación de contenido). (Jimidar, Heylen, & De Smet, 2007)

2.6.2 Linealidad
La linealidad de un método analítico es su capacidad de producir resultados directamente
proporcionales a la concentración de analito, dentro de un intervalo de concentración. En algunos
casos puede ser necesaria la aplicación de transformaciones matemáticas para obtener una recta. El
intervalo se refiere al rango de concentraciones de analito que pueden ser determinadas con
precisión y exactitud. Normalmente se expresa con las mismas unidades que los resultados del
ensayo. (Volonté & Quiroga, 2013)

La linealidad debe establecerse a lo largo del intervalo de concentraciones del método

analítico. Se debe establecer por medio de un método estadístico adecuado, por ejemplo regresión
por mínimos cuadrados. Deben informarse el coeficiente de correlación (r), el coeficiente de
determinación (r2) la ordenada al origen (a) y la pendiente (b) de la recta de regresión. (Volonté &
Quiroga, 2013)

Se recomienda considerar los siguientes intervalos (Volonté & Quiroga, 2013):

22
  Para la Valoración de una sustancia (o producto farmacéutico): 80-120% de la
concentración de ensayo. Para la determinación de Impurezas: LC (límite de
cuantificación)-120% de la especificación.
 Para la determinación de Uniformidad de contenido: 70-130% de la concentración del
ensayo a menos que se justifique otro intervalo de acuerdo a la naturaleza de la forma
farmacéutica.
 Para ensayos de Disolución: ± 20% del intervalo especificado
 Para estudios de estabilidad: 40-120% de la concentración de ensayo
Con los resultados obtenidos se evalúa la linealidad por el método de regresión de los
cuadrados mínimos, de tal manera de obtener la ecuación de una recta:

𝒚 = 𝒂 + 𝒃𝒙 Ecuación 2.6

La ordenada (a) es el punto de intersección en el que la recta corta el eje vertical o eje y. si
hay errores aleatorios, la recta no pasa por cero. (Volonté & Quiroga, 2013)

∑ 𝒚𝒊 −𝒃 ∑ 𝒙𝒊
𝒂= 𝒏
Ecuación 2.7

La pendiente (b) evalúa la sensibilidad del método. (Volonté & Quiroga, 2013)

∑ 𝒙𝒊 ∑ 𝒚𝒊
∑ 𝒙𝒊 𝒚𝒊 −
𝒃= 𝒏
𝟐 Ecuación 2.8
𝟐 (∑ 𝒙𝒊 )
∑ 𝒙𝒊 −
𝒏

El coeficiente de regresión lineal (r) mide el ajuste al modelo lineal. (Volonté & Quiroga,
2013)

∑ 𝒙𝒊 ∑ 𝒚𝒊
∑ 𝒙𝒊 𝒚𝒊 −
𝒓= 𝒏
Ecuación 2.9
𝟐 𝟐
(∑ 𝒙𝒊 ) (∑ 𝒚𝒊 )
√(∑ 𝒙𝟐𝒊 − )(∑ 𝒚𝟐𝒊 − )
𝒏 𝒏

El valor r=1 indica una recta perfectamente lineal, un valor r=0 indica la no correlación
entre x e y. (Volonté & Quiroga, 2013)

Una medición sobre la calidad del ajuste de un modelo lo da el error estándar de estimación,
que es una estimación de la desviación estándar del error, σ. En el caso de la regresión lineal
simple, está dado por: (Gutiérrez Pulido & de la Vara Salazar, 2008)

23
 𝑺𝑪𝒆
𝝈 = √𝒏−𝟐 Ecuación 2.10

Donde SCe es la suma de cuadrados del error. Otra forma de medir la calidad del ajuste es
a través de la media del valor absoluto de los residuos, es decir: (Gutiérrez Pulido & de la Vara
Salazar, 2008)

∑𝒏
𝒊=𝟏 |𝒆𝒊|
𝒎𝒆𝒂 = 𝒏
Ecuación 2.11

Donde ei, son los residuos. Es claro que mientras mejor sea el ajuste, los residuos serán más
pequeños y, en consecuencia, también la mea tenderá a ser más pequeña. (Gutiérrez Pulido & de la
Vara Salazar, 2008)

Un análisis adecuado de los residuos proporciona información adicional sobre la calidad del
ajuste del modelo de regresión y de esa manera es posible verificar si el modelo es adecuado.
(Gutiérrez Pulido & de la Vara Salazar, 2008)

2.6.3 Límites de detección y de cuantificación

El límite de detección (LOD) es la cantidad más pequeña de analito en una muestra que
puede ser detectada por una única medición, con un nivel de confianza determinado, pero no
necesariamente cuantificada con un valor exacto. (Control metrológico , 2014)

El lımite de cuantificación (LOQ) es la cantidad más pequeña del analito en una muestra
que puede ser cuantitativamente determinada con exactitud aceptable. Es un parámetro del análisis
cuantitativo para niveles bajos de analitos en matrices de muestra y se usa particularmente para
impurezas y productos de degradación. (Control metrológico , 2014)

La determinación LOQ o LOD sólo se requiere para los métodos de alta sensibilidad que
implican componentes de trazas tales como métodos de impureza o métodos de validación de
limpieza. (Dong, 2006)

2.6.4 Exactitud

La ‘exactitud’ de medición expresa la proximidad de un único resultado a un valor de

referencia. La validación de métodos trata de investigar la exactitud de los resultados evaluando los
efectos sistemáticos y aleatorios sobre resultados individuales. Por lo tanto, normalmente la

24
exactitud se estudia como dos componentes: ‘veracidad’ y ‘precisión’. Además, una expresión cada
vez más común de exactitud es "incertidumbre de medición', la cual proporciona un solo valor.
(Morillas & colaboradores, 2016)

[Link] Veracidad

La veracidad de medición es una expresión de la proximidad de la media de un número

infinito de resultados producidos con el método a un valor de referencia. Puesto que no es posible
realizar un número infinito de mediciones, no se puede medir la veracidad. Sin embargo, podemos
realizar una evaluación práctica de la veracidad. Por lo general, esta evaluación se expresa
cuantitativamente en términos de 'sesgo'. (Morillas & colaboradores, 2016)

Una determinación práctica del sesgo se basa en la comparación de la media de los

resultados(x) del método candidato con un valor de referencia adecuado (xref). (Morillas &
colaboradores, 2016)

El sesgo puede expresarse en términos absolutos

𝒃 = 𝒙 − 𝒙𝒓𝒆𝒇 Ecuación 2.12

O en términos relativos en porcentaje

𝒙−𝒙𝒓𝒆𝒇
𝒃(%) = 𝒙𝒓𝒆𝒇
𝟏𝟎𝟎 Ecuación 2.13

O como recuperación relativa o aparente

𝒙
𝑹(%) = 𝒙 𝟏𝟎𝟎 Ecuación 2.14
𝒓𝒆𝒇

Los sesgo deben ser tan pequeños como sea posible para que el valor medio experimental se
aproxime al de referencia o verdadero, si no fuera así y según su significancia los aceptaremos o
reformularemos el protocolo de aplicación del método, para minimizarlos o adaptarlos a los
requerimientos exigidos para cada método analítico, en lo que a errores se refiere. (Volonté &
Quiroga, 2013)

La exactitud debe evaluarse mediante el diseño que emplea un mínimo de nueve

determinaciones sobre un mínimo de tres niveles de concentración que cubran el intervalo
especificado para linealidad, por ejemplo tres concentraciones al 70, 100 y 130% del valor
esperado, al que se le agregan los excipientes del producto, ensayo de recuperación, con tres
25
repeticiones completas del método para cada una de las concentraciones. Puede utilizarse un test t
de Student, efectuando varias determinaciones de la muestra de concentración conocida y
calculando el t experimental, tob, que se compara con el t de tabla para (n-1) grados de libertad en el
nivel de confianza escogido, generalmente p = 0,05. (Volonté & Quiroga, 2013)

H0: no hay error sistemático o el sesgo no es significativo

|𝒙−𝒙𝒓𝒆𝒇 |
𝒕𝒐𝒃 = 𝑺 Ecuación 2.15
√𝒏

Siendo S la desviación estándar y n el número de mediciones independientes. (Volonté &

Quiroga, 2013)

[Link] Precisión

La precisión de un método es el grado de cercanía entre los resultados de pruebas

independientes y se suele expresar en términos de desviación estándar. Generalmente depende de la
concentración del analito, y esta dependencia debe ser determinada y documentada. Se puede
expresar de diferentes maneras dependiendo de las condiciones en que se calcula. (CITAC and
EURACHEM, 2002)

La repetibilidad es un tipo de precisión relacionado con mediciones realizadas en

condiciones repetibles, es decir el mismo método, mismo material, mismo operador mismo
laboratorio, periodo de tiempo corto entre mediciones. (CITAC and EURACHEM, 2002)

La reproducibilidad es un concepto de precisión relativo a mediciones realizadas en

condiciones reproducibles, es decir el mismo método, operador diferente, diferentes laboratorios,
equipos diferentes, período de tiempo largo entre mediciones. (CITAC and EURACHEM, 2002)

Nótese que estas afirmaciones de precisión se refieren al análisis cuantitativo. El análisis

cualitativo puede ser tratado de una manera ligeramente diferente. El análisis cualitativo es
efectivamente una medición de sí / no a un valor límite de un analito determinado. (CITAC and
EURACHEM, 2002)

La razón de Horwitz (HorRat) es un parámetro de rendimiento normalizado que indica la

aceptabilidad de los métodos de análisis con respecto a la precisión entre laboratorios
(reproducibilidad) e inter laboratorio (precisión). Es más o menos independiente del analito, matriz,

26
método y tiempo de publicación. Actualmente es uno de los criterios de aceptabilidad de muchos de
los métodos químicos de análisis recientemente adoptados por AOAC INTERNATIONAL, la
Unión Europea y otras organizaciones europeas que se ocupan del análisis de alimentos como el
Comité Europeo de Normalización y el Comité Nórdico Analítico. Es la proporción de la
desviación estándar relativa observada calculada a partir de los datos reales de rendimiento, RSDR
(%), a la correspondiente desviación estándar relativa prevista calculada a partir de la ecuación de
Horwitz (Horwitz & Albert, 2006)

PRSDR(%) = 2C-0,15 Ecuación 2.16

Donde C es la concentración encontrada o añadida, expresado como una fracción de masa.

(Horwitz & Albert, 2006)

𝑹𝑺𝑫
𝑯𝒐𝒓𝑹𝒂𝒕 = 𝑷𝑹𝑺𝑫𝑹 Ecuación 2.17
𝑹

Transforma la RSD encontrada en una fracción de la RSD esperada por la aplicación de la

ecuación exponencial a la concentración, por lo tanto la precisión encontrada es expresada como
una fracción de la precisión calculada a partir de las estimaciones de la concentración experimental,
esta es igual a 1 para correspondencia exacta, la precisión es mejor de lo esperado si la relación es
menor que 1 y más pobre si es mayor que 1, el rango aceptable empírico es de 0,5 a 2,0. (Horwitz &
Albert, 2006)

Las desviaciones consistentes de la relación en el lado bajo (valores <0,5) pueden indicar un
promedio no declarado o una excelente formación y experiencia, las desviaciones consistentes en el
lado alto (valores> 2) pueden indicar la no homogeneidad de las muestras de ensayo, la necesidad
de optimización adicional del método o entrenamiento, operando por debajo del límite de
determinación, o un método insatisfactorio. (Horwitz & Albert, 2006)

[Link] Incertidumbre

Es un parámetro, asociado con el resultado de una medición, que caracteriza la dispersión

de los valores que podrían atribuirse razonablemente al mensurando, este parámetro puede ser, por
ejemplo, una desviación estándar o un múltiplo dado de ella, o la mitad de ancho de un intervalo
que tenga un nivel de confianza establecido. (ISO/TC 69/SC 6, 2002)

La incertidumbre de la medición comprende, en general, muchos componentes. Algunos de

estos componentes pueden evaluarse a partir de la distribución estadística de los resultados de una
27
serie de mediciones y pueden caracterizarse por desviaciones estándar experimentales. Los otros
componentes, que también pueden caracterizarse por desviaciones estándar, se evalúan a partir de
distribuciones de probabilidad supuestas basadas en la experiencia u otra información. (ISO/TC
69/SC 6, 2002)

Es posible estimar la incertidumbre de una determinación química a partir de los resultados

obtenidos para la repetibilidad, reproducibilidad y veracidad, el modelo estadístico utilizado es el
siguiente: (ISO/TC 69/SC 6, 2002)

𝒚 = 𝜹 + 𝒄𝒙 + 𝒆 Ecuación 2.18

Donde y es la concentración relativa del analito, 𝛿 representa el sesgo intrínseco del

𝑑𝑦
método, e el término del error, x el área del pico del analito y c el coeficiente lineal ⁄𝑑𝑥, el cual

puede ser estimado del estudio de linealidad. (ISO/TC 69/SC 6, 2002)

Teniendo el modelo de la ecuación 2.21, la incertidumbre estándar combinada u(y) asociada

con una observación puede ser estimada como: (ISO/TC 69/SC 6, 2002)

𝒖(𝒚)𝟐 = 𝑺𝟐𝑹 + 𝒖(𝝁

̂ )𝟐 + 𝒄𝟐 𝒖(𝒙)𝟐 Ecuación 2.19

Donde S2R es la desviación estándar observada en el ensayo de reproducibilidad, u(μ ̂) la

incertidumbre de la estimación de δ, la cual puede ser determinada como la desviación estándar
observada en el ensayo de veracidad y u(x) la incertidumbre sobre el valor de x, (ISO/TC 69/SC 6,
2002).

El factor de cobertura (k) es un multiplicador elegido sobre la base del nivel de confianza
deseado que se asociará con el intervalo definido por (Desimoni & Brunetti, 2011)

𝑼 = 𝒌𝒖(𝒚) Ecuación 2.20

Donde U es la incertidumbre expandida, con frecuencia, k está en el rango de 2 a 3. Cuando

se aplica la distribución normal y u(y) es una estimación confiable de la desviación estándar del
mensurando, un valor de k igual a 2 define un intervalo que tiene un nivel de confianza de
aproximadamente el 95% (más exactamente, un nivel de confianza del 95,45%), y k igual a 3 define
un intervalo que tiene un nivel de confianza de aproximadamente el 99% (más exactamente, un
nivel de confianza de 99.73%. (Desimoni & Brunetti, 2011)

28
 Cuanto mayor sea el valor de U mayor será la proporción de las muestras que se juzgará
incorrectamente. Cuanto menor sea el valor de U, en general, mayor será el costo del análisis. Por lo
tanto, lo ideal es que se elija para minimizar los costos de análisis más los costos de las decisiones.
Sin embargo, la información necesaria para hacer esto rara vez está disponible. En algunos casos,
donde la especificación establece límites superior e inferior, el tamaño máximo permitido de U se
da como una fracción de la diferencia entre estos límites. (EURACHEM/CITAC, 2007)

2.6.5 Robustez

La robustez de un método analítico es la resistencia al cambio en los resultados producidos

por un método analítico cuando se hacen pequeñas variaciones de las condiciones experimentales
descritas en el procedimiento. Los límites para los parámetros experimentales deben ser prescritos
en el protocolo del método, y tales desviaciones permisibles, por separado o en cualquier
combinación, no deben producir ningún cambio significativo en los resultados producidos. Los
aspectos del método que son susceptibles de afectar los resultados deben ser identificados y su
influencia en el rendimiento del método evaluado por medio pruebas de robustez. (THOMPSON,
ELLISON, & WOOD, 2002)

Para evaluar la robustez primero se identifican las variables que podrían tener un efecto
significativo en el desempeño del método, por medio de un diseño de experimentos se evalúa el
efecto de cada cambio de condición en los resultados de la medida, se clasifican las variables según
el mayor efecto sobre el desempeño del método, se realizan pruebas de significación para
determinar si los efectos observados son estadísticamente significativos. (Morillas & colaboradores,
2016)

2.6.6 Estabilidad

Para validar un método debe demostrarse en qué medida los analitos se mantienen estables
durante todo el procedimiento de análisis, incluido su almacenamiento antes y después de éste. En
general, la medición se hace comparando patrones recién preparados con una concentración
conocida con patrones similares almacenados durante diferentes períodos de tiempo y en diferentes
condiciones. (Oficina de las Naciones Unidas contra la Droga y el Delito, 2010)

29
2.6.7 Aplicabilidad

La aplicabilidad consiste en una declaración de las especificaciones del rendimiento del

método, que se entrega en el informe de validación y que normalmente incluye la identidad de la
sustancia analizada, el intervalo de concentraciones cubierto por la validación, una especificación
de la gama de las matrices del material de prueba cubierto por la validación, la aplicación prevista y
de sus requisitos de incertidumbre críticos. (Instituto de Salud Pública Chile, 2010)

2.7 ANOVA

El análisis de varianza (ANOVA) es la técnica central en el análisis de datos

experimentales. La idea general de esta técnica es separar la variación total en las partes con las que
contribuye cada fuente de variación en el experimento. (Gutiérrez Pulido & de la Vara Salazar,
2008)

Para ejecutar un ANOVA, se debe tener una variable de respuesta continua y al menos un
factor categórico con dos o más niveles. Los análisis ANOVA requieren datos de poblaciones que
sigan una distribución aproximadamente normal con varianzas iguales entre los niveles de factores.
Sin embargo, los procedimientos de ANOVA funcionan bastante bien incluso cuando se viola el
supuesto de normalidad, a menos que una o más de las distribuciones sean muy asimétricas o si las
varianzas son bastante diferentes. Las transformaciones del conjunto de datos original pueden
corregir estas violaciones. (Minitab, 2017)

Notación de puntos

Sirve para representar de manera abreviada cantidades numéricas que se pueden calcular a
partir de los datos experimentales, donde 𝑌𝑖𝑗 representa la j-ésima observación en el tratamiento i,
con i = 1, 2,…, k y j = 1, 2,…, ni. Las cantidades de interés son las siguientes: (Gutiérrez Pulido &
de la Vara Salazar, 2008)

𝑌𝑖• = Suma de las observaciones del tratamiento i.

𝑌̅𝑖• = Media de las observaciones del i-ésimo tratamiento.

𝑌•• = Suma total de las N = n1 + n2 +…+ nk mediciones.

30
 𝑌̅•• = Media global o promedio de todas las observaciones.

El punto indica la suma sobre el correspondiente subíndice. Así, algunas relaciones válidas
son, (Gutiérrez Pulido & de la Vara Salazar, 2008)

𝒏
𝒀𝒊• = ∑𝒋=𝟏
𝒊
𝒀𝒊𝒋 Ecuación 2.21
𝒏𝒊 𝒀
∑𝒋=𝟏 𝒊𝒋
̅ 𝒊• =
𝒀 Ecuación 2.22
𝒏𝒊

𝒏
𝒀•• = ∑𝒌𝒊=𝟏 ∑𝒋=𝒊
𝒊
𝒀𝒊𝒋 Ecuación 2.23

̅ •• = 𝒀••
𝒀 Ecuación 2.24
𝑵

Donde 𝑁 = ∑𝑘𝑖=1 𝑛𝑖 es el total de las observaciones.

El objetivo del análisis de varianza es probar la hipótesis de igualdad de los tratamientos

con respecto a la media de la correspondiente variable de respuesta: (Gutiérrez Pulido & de la Vara
Salazar, 2008)

𝑯𝟎 : 𝝁𝟏 = 𝝁𝟐 = ⋯ = 𝝁𝒌 = 𝝁 Ecuación 2.25

𝑯𝑨 : 𝝁𝒊 ≠ 𝝁𝒋 para algún 𝒊 ≠ 𝒋 Ecuación 2.26

La cual se puede escribir en forma equivalente como:

𝑯𝟎 : 𝝉𝟏 = 𝝉𝟐 = ⋯ = 𝝉𝒌 = 𝟎 donde 𝝉𝒊 = 𝝁𝒊 − 𝝁 Ecuación 2.27

𝑯𝑨 : 𝝉𝒊 ≠ 𝟎 para algún i Ecuación 2.28

Donde 𝜏𝑖 es el efecto del tratamiento i sobre la variable de respuesta. Si se acepta H0 se

confirma que los efectos sobre la respuesta de los k tratamientos son estadísticamente nulos, iguales
a cero, y en caso de rechazar se estaría concluyendo que al menos un efecto es diferente de cero.
(Gutiérrez Pulido & de la Vara Salazar, 2008)

Para probar la hipótesis dada mediante la técnica de ANOVA, lo primero es descomponer la

variabilidad total de los datos en sus dos componentes: la variabilidad debida a tratamientos y la que
corresponde al error aleatorio. (Gutiérrez Pulido & de la Vara Salazar, 2008)

Una medida de la variabilidad total presente en las observaciones es la suma total de

cuadrados (SCT) dada por (Gutiérrez Pulido & de la Vara Salazar, 2008)

31
 𝒏𝒊
𝑺𝑪𝑻 = ∑𝒌𝒊=𝟏 ∑𝒋=𝟏 ̅ •• )𝟐
(𝒀𝒊𝒋 − 𝒀 Ecuación 2.29

𝒏 𝟐
̅ 𝒊• − 𝒀
𝑺𝑪𝑻 = ∑𝒌𝒊=𝟏 𝒏𝒊 (𝒀 ̅ •• )𝟐 + ∑𝒌𝒊=𝟏 ∑𝒋=𝟏
𝒊 ̅ 𝒊• )
(𝒀𝒊𝒋 − 𝒀 Ecuación 2.30

Donde el primer componente de la ecuación 2.20 es la suma de cuadrados de tratamientos

(SCTRAT) y el segundo es la suma de cuadrados del error (SCE). Al observar con detalle estas sumas
de cuadrados se aprecia que la SCTRAT mide la variación o diferencias entre tratamientos, ya que si
éstos son muy diferentes entre sí, entonces la diferencia 𝑌̅𝑖• − 𝑌̅•• tenderá a ser grande en valor
absoluto, y con ello también será grande la SCTRAT. Mientras que la SCE mide la variación dentro de
tratamientos, ya que si hay mucha variación entre las observaciones de cada tratamiento entonces
𝑌𝑖𝑗 − 𝑌̅𝑖• tenderá a ser grande en valor absoluto. En forma abreviada, esta descomposición de la
suma total de cuadrados se puede escribir como: (Gutiérrez Pulido & de la Vara Salazar, 2008)

𝑺𝑪𝑻 = 𝑺𝑪𝑻𝑹𝑨𝑻 + 𝑺𝑪𝑬 Ecuación 2.31

𝑛𝑖
Como hay un total de 𝑁 = ∑𝑖=1 𝑛𝑖 observaciones, la SCT tiene N – 1 grados de libertad,
hay k tratamientos o niveles del factor de interés, así que SCTRAT tiene k – 1 grados de libertad,
mientras que la SCE tiene N – k. Los grados de libertad que corresponden a los términos de la
ecuación 2.11 cumplen una relación similar dada por: (Gutiérrez Pulido & de la Vara Salazar, 2008)

𝑵 − 𝟏 = (𝒌 − 𝟏) + (𝑵 − 𝒌) Ecuación 2.32

Las sumas de cuadrados divididas entre sus respectivos grados de libertad se llaman
cuadrados medios. Los dos que más interesan son el cuadrado medio de tratamientos y el cuadrado
medio del error, que se denotan por (Gutiérrez Pulido & de la Vara Salazar, 2008)

𝑺𝑪𝑻𝑹𝑨𝑻
𝑪𝑴𝑻𝑹𝑨𝑻 = 𝒌−𝟏
Ecuación 2.33

𝑬 𝑺𝑪
𝑪𝑴𝑬 = 𝑵−𝒌 Ecuación 2.34

Los valores esperados de los cuadrados medios están dados por

𝑬(𝑪𝑴𝑬 ) = 𝝈𝟐 Ecuación 2.35

∑𝒌𝒊=𝟏 𝒏𝒊 𝝉𝒊
𝑬(𝑪𝑴𝑻𝑹𝑨𝑻 ) = 𝝈𝟐 + 𝑵−𝒌
Ecuación 2.36

En estas expresiones se aprecia que cuando la hipótesis nula es verdadera, ambos cuadrados
medios estiman la varianza 𝜎 2 , ya que el segundo término de la expresión para el E(CMTRAT) sería
igual a cero. Con base en este hecho se construye el estadístico de prueba como sigue: se sabe que
32
SCE y SCTRAT son independientes, por lo que SCE /𝜎 2 y SCTRAT /𝜎 2 son dos variables aleatorias
independientes con distribución ji-cuadrada con N – k y k – 1 grados de libertad, respectivamente.
Entonces, bajo el supuesto de que la hipótesis H0 es verdadera, el estadístico (Gutiérrez Pulido & de
la Vara Salazar, 2008)

𝑪𝑴𝑻𝑹𝑨𝑻
𝑭𝟎 = Ecuación 2.37
𝑪𝑴𝑬

Sigue una distribución F con (k – 1) grados de libertad en el numerador y (N – k) grados de

libertad en el denominador. (Gutiérrez Pulido & de la Vara Salazar, 2008)

Así, para un nivel de significancia 𝛼 prefijado, se rechaza H0 si 𝐹0 > 𝐹𝛼,𝑘−1,𝑁−𝑘 , donde

𝐹𝛼,𝑘−1,𝑁−𝑘 es el percentil (1 − 𝛼)100 de la distribución F. También se rechaza H0 si el valor-p < 𝛼,
donde el valor-p es el área bajo la distribución 𝐹𝛼,𝑘−1,𝑁−𝑘 a la derecha del estadístico F0, es decir,
el valor-p = P(F > F0). (Gutiérrez Pulido & de la Vara Salazar, 2008)

2.7.1 Verificación de los supuestos ANOVA

La validez de los resultados obtenidos en cualquier análisis de varianza queda supeditada a
que los supuestos del modelo se cumplan. Estos supuestos son: normalidad, varianza constante
(igual varianza de los tratamientos) e independencia. Esto es, la respuesta (Y) se debe distribuir de
manera normal, con la misma varianza en cada tratamiento y las mediciones deben ser
independientes. Estos supuestos sobre Y se traducen en supuestos sobre el término error (e) en el
modelo. (Gutiérrez Pulido & de la Vara Salazar, 2008)

Es una práctica común utilizar la muestra de residuos para comprobar los supuestos del
modelo, ya que si los supuestos se cumplen, los residuos o residuales se pueden ver como una
muestra aleatoria de una distribución normal con media cero y varianza constante. Los residuos
(𝑒𝑖𝑗 ) se definen como la diferencia entre la respuesta observada (𝑌𝑖𝑗 ) y la respuesta predicha por el
modelo (𝑌̂𝑖𝑗 ), lo cual permite hacer un diagnóstico más directo de la calidad del modelo, ya que su
magnitud señala qué tan bien describe a los datos el modelo. (Gutiérrez Pulido & de la Vara
Salazar, 2008)

̂ 𝒊𝒋 = 𝒀𝒊𝒋 − 𝒀
𝒆𝒊𝒋 = 𝒀𝒊𝒋 − 𝒀 ̅ 𝒊• Ecuación 2.38

Los supuestos del modelo en términos de los residuos, son:

1. Los 𝑒𝑖𝑗 siguen una distribución normal con media cero.

33
 2. Los 𝑒𝑖𝑗 son independientes entre sí.

3. Los residuos de cada tratamiento tienen la misma varianza 𝜎 2 .

Para comprobar cada supuesto existen pruebas analíticas y gráficas, por sencillez, muchas
veces se prefieren las pruebas gráficas, aunque estas tienen el inconveniente de que no son
“exactas”, pero aun así, en la mayoría de las situaciones prácticas proporcionan la evidencia
suficiente en contra o a favor de los supuestos. El uso de las pruebas gráficas requiere una fuerte
evidencia visual para concluir que el supuesto en cuestión no se cumple, ya que se requiere que la
evidencia en contra de un supuesto esté soportada por más de dos puntos. Cuando son uno o dos los
puntos que se salen del comportamiento esperado de las gráficas se puede tratar de un problema de
puntos aberrantes, no de violación del supuesto en cuestión. Se puede utilizar una prueba analítica
para subsanar las ambigüedades que surjan en la interpretación visual de las gráficas. (Gutiérrez
Pulido & de la Vara Salazar, 2008)

Normalidad

Un procedimiento gráfico para verificar el cumplimiento del supuesto de normalidad de los

residuos consiste en graficar los residuos en papel o en la gráfica de probabilidad normal, esta
gráfica del tipo X-Y tiene las escalas de tal manera que si los residuos siguen una distribución
normal, al graficarlos tienden a quedar alineados en una línea recta; por lo tanto, si claramente no se
alinean se concluye que el supuesto de normalidad no es correcto. (Gutiérrez Pulido & de la Vara
Salazar, 2008)

Cabe enfatizar el hecho de que el ajuste de los puntos a una recta no tiene que ser perfecto,
dado que el análisis de varianza resiste pequeñas y moderadas desviaciones al supuesto de
normalidad. (Gutiérrez Pulido & de la Vara Salazar, 2008)

Prueba de Shapiro-Wilks para normalidad

Consideremos una muestra aleatoria de datos x1, x2,…, xn que proceden de cierta
distribución desconocida denotada por F(x). Se quiere verificar si dichos datos fueron generados por
un proceso normal, mediante las hipótesis estadísticas: (Gutiérrez Pulido & de la Vara Salazar,
2008)

H0: Los datos proceden de una distribución normal (F(x) es normal)

34
 HA: Los datos no proceden de una distribución normal (F(x) no es normal)

Los pasos para la prueba de Shapiro-Wilks son: 1) Se ordenan los datos de menor a mayor.
Denotemos los datos ordenados por X(1), X(2), …, X(n). 2) De tablas para este procedimiento se
obtienen los coeficientes a1, a2, …, ak, donde k es aproximadamente n/2. 3) Se calcula el estadístico
W definido como: (Gutiérrez Pulido & de la Vara Salazar, 2008)

𝟏 𝟐
𝑾 = (𝒏−𝟏)𝑺𝟐 [∑𝒌𝒊=𝟏 𝒂𝒊 (𝑿(𝒏−𝒊+𝟏) − 𝑿(𝒊) )] Ecuación 2.39

Donde S2 es la varianza muestral. 4) Por último, si el valor del estadístico es mayor que su
valor crítico al nivel 𝛼 seleccionado, se rechaza la normalidad de los datos. (Gutiérrez Pulido & de
la Vara Salazar, 2008)

Varianza constante

Una forma de verificar el supuesto de varianza constante (o que los tratamientos tienen la
misma varianza) es graficando los predichos contra los residuos (𝑌̂𝑖𝑗 vs. 𝑒𝑖𝑗 ), por lo general 𝑌̂𝑖𝑗 va
en el eje horizontal y los residuos en el eje vertical. Si los puntos en esta gráfica se distribuyen de
manera aleatoria en una banda horizontal, sin ningún patrón claro y contundente, entonces es señal
de que se cumple el supuesto de que los tratamientos tienen igual varianza. Por el contrario, si se
distribuyen con algún patrón claro y contundente, como por ejemplo una forma de “corneta o
embudo”, entonces es señal de que no se está cumpliendo el supuesto de varianza constante. Un
claro embudo en los residuales indicará que el error de pronóstico del modelo tiene una relación
directa (positiva o negativa) con la magnitud del pronóstico (predicho). (Gutiérrez Pulido & de la
Vara Salazar, 2008)

Otra gráfica que ayuda a verificar el supuesto es la gráfica de niveles de factor contra
residuos. En el eje X de esta gráfica se ponen los tratamientos o los niveles de un factor, y en el eje
vertical se agregan los residuos correspondientes a cada tratamiento o nivel de factor. Si se cumple
el supuesto de varianza constante, se espera que la amplitud de la dispersión de los puntos en cada
nivel de factor tenderá a ser similar; y no se cumplirá el supuesto si hay diferencias fuertes en esta
amplitud, En la interpretación de estas gráficas debe considerarse que, en estadística, las pequeñas
diferencias por lo general no son significativas, y también debe tomarse en cuenta la cantidad de
observaciones hechas en cada nivel del factor, puesto que este hecho puede impactar la dispersión
aparente en cada tratamiento. (Gutiérrez Pulido & de la Vara Salazar, 2008)

35
 Otra interpretación de la gráfica de factor contra residuos es que cuando los tratamientos o
niveles muestran una dispersión diferente de sus residuales correspondientes, es que el factor o los
tratamientos tienen un efecto significativo sobre la variabilidad de la respuesta. (Gutiérrez Pulido &
de la Vara Salazar, 2008)

Prueba de Bartlett para homogeneidad de varianzas

Supongamos que se tienen k poblaciones o tratamientos independientes, cada uno con

distribución normal (𝑁(𝜇𝑖 , 𝜎𝑖2 ), i = 1, 2,…, k), donde las varianzas son desconocidas. Se quiere
probar la hipótesis de igualdad de varianzas dada por: (Gutiérrez Pulido & de la Vara Salazar, 2008)

𝑯𝟎 : 𝝈𝟐𝟏 = 𝝈𝟐𝟐 = ⋯ = 𝝈𝟐𝒌 = 𝝈𝟐 Ecuación 2.40

𝑯𝑨 : 𝝈𝟐𝒊 ≠ 𝝈𝟐𝒋 para algún 𝒊 ≠ 𝒋 Ecuación 2.41

Mediante un diseño completamente al azar se obtienen k muestras aleatorias de tamaños n i

(i = 1, 2,…, k) de dichas poblaciones, de modo que el total de mediciones es N = n 1 + n2 + … + nk.
El estadístico de prueba para la hipótesis está dado por (Gutiérrez Pulido & de la Vara Salazar,
2008)

𝒒
ℵ𝟐𝟎 = 𝟐, 𝟑𝟎𝟐𝟔 𝒄 Ecuación 2.42

Donde

𝒒 = (𝑵 − 𝒌)𝒍𝒐𝒈𝟏𝟎 𝑺𝟐𝒑 − ∑𝒌𝒊=𝟏(𝒏𝒊 − 𝟏)𝒍𝒐𝒈𝟏𝟎 𝑺𝟐𝒊 Ecuación 2.43

𝟏
𝒄 = 𝟏 + 𝟑(𝒌−𝟏) (∑𝒌𝒊=𝟏(𝒏𝒊 − 𝟏)−𝟏 − (𝑵 − 𝒌)−𝟏 ) Ecuación 2.44

∑𝒌𝒊=𝟏(𝒏𝒊 −𝟏)𝑺𝟐𝒊
𝑺𝟐𝒑 = 𝑵−𝒌
Ecuación 2.45

Donde 𝑆𝑖2 es la varianza muestral del tratamiento i. Bajo la hipótesis nula de igualdad de
varianza, el estadístico ℵ20 sigue una distribución ji-cuadrada con k – 1 grados de libertad, por lo que
se rechaza H0 cuando ℵ20 es más grande que ℵ2(𝛼,𝑘−1). Observe que el estadístico q, en el numerador
del estadístico ℵ20 , es grande en la medida de que las varianzas muestrales 𝑆𝑖2 son diferentes y es
igual a cero cuando éstas son iguales. (Gutiérrez Pulido & de la Vara Salazar, 2008)

La prueba de Bartlett es sensible a la falta de normalidad de las poblaciones de interés, por

lo que debe comprobarse el cumplimiento de este supuesto. (Gutiérrez Pulido & de la Vara Salazar,
2008)
36
Independencia

La suposición de independencia en los residuos puede verificarse si se grafica el orden en

que se colectó un dato contra el residuo correspondiente. De esta manera, si al graficar en el eje
horizontal el tiempo (orden de corrida) y en el eje vertical los residuos, se detecta una tendencia o
patrón no aleatorio claramente definido, esto es evidencia de que existe una correlación entre los
errores y, por lo tanto, el supuesto de independencia no se cumple. Si el comportamiento de los
puntos es aleatorio dentro de una banda horizontal, el supuesto se está cumpliendo. (Gutiérrez
Pulido & de la Vara Salazar, 2008)

La violación de este supuesto generalmente indica deficiencias en la planeación y ejecución

del experimento; asimismo, puede ser un indicador de que no se aplicó en forma correcta el
principio de aleatorización, o de que conforme se fueron realizando las pruebas experimentales
aparecieron factores que afectaron la respuesta observada. Por ello, en caso de tener problemas con
este supuesto, las conclusiones que se obtienen del análisis son endebles y por ello es mejor revisar
lo hecho y tratar de investigar por qué no se cumplió con ese supuesto de independencia, a fin de
reconsiderar la situación. (Gutiérrez Pulido & de la Vara Salazar, 2008)

Prueba de Durbin-Watson para comprobar independencia

Esta prueba permite diagnosticar la presencia de correlación (auto correlación) entre los
residuos consecutivos (ordenados en el tiempo), que es una posible manifestación de la falta de
independencia. La auto correlación se presenta en experimentos en los cuales cada medición tiene
alguna contaminación de la medición inmediata anterior, lo cual contradice el supuesto de
independencia. (Gutiérrez Pulido & de la Vara Salazar, 2008)

Sea 𝜌 el parámetro que representa la correlación entre residuos consecutivos

𝑪𝒐𝒓𝒓(𝒆𝒕 , 𝒆𝒕−𝟏 ) = 𝝆; 𝒕 = 𝟏, 𝟐, 𝟑, … , 𝒏 Ecuación 2.46

La hipótesis en la prueba de Durbin-Watson es:

𝑯𝟎 : 𝝆 = 𝟎 Ecuación 2.47

𝑯𝑨 : 𝝆 > 𝟎 Ecuación 2.48

Donde la alternativa se toma en el sentido mayor (>) porque la auto correlación positiva es
la más frecuente en la práctica. El estadístico de Durbin-Watson es:

37
 ∑𝒏
𝒊=𝟐(𝒆𝒊 −𝒆𝒊−𝟏 )
𝟐
𝒅= ∑𝒏 (𝒆 ) 𝟐 Ecuación 2.49
𝒊=𝟏 𝒊

Donde los 𝑒𝑖 , i = 1, 2, ..., n, son los residuos ordenados en el tiempo. La decisión sobre la
hipótesis, consiste en la siguiente regla:

Si 𝒅 < 𝒅𝑳 se rechaza H0 Ecuación 2.50

Si 𝒅 > 𝒅𝑼 no se rechaza H0 Ecuación 2.51

Si 𝒅𝑳 ≤ 𝒅 ≤ 𝒅𝑼 Sin decisión Ecuación 2.52

Donde dL y dU son cotas que se leen en tablas. Para entrar a las tablas se requiere el número
de residuos n, el nivel de significancia prefijado 𝛼 y el número de variables explicativas o
regresoras en el modelo, p. (Gutiérrez Pulido & de la Vara Salazar, 2008)

En caso de interesar la hipótesis de auto correlación negativa (𝐻𝐴 : 𝜌 < 0) secutiliza el

estadístico d’ = 4 – d, donde d se calcula con la ecuación 2.29. En caso de interesar la hipótesis
bilateral con alternativa 𝐻𝐴 : 𝜌 ≠ 0, se combinan las dos pruebas unilaterales de tamaño a de manera
que la prueba bilateral tenga el tamaño deseado 2𝛼. (Gutiérrez Pulido & de la Vara Salazar, 2008)

2.8 Riboflavina (Vitamina B2)

La vitamina B2, también llamada riboflavina, es una de las vitaminas hidrosolubles

más extendida. La riboflavina químicamente es 7,8-Dimetil-10 - [(2S, 3S, 4R) -2,3,4,5-
tetrahidroxipentil] benzo [g] pteridina-2,4-diona, también 7,8 -dimetil- (N-10-ribil) isoalloxazina y
tiene un peso molecular de 376.36 g/mol con una solubilidad en agua a temperatura ambiente de
aproximadamente 12 mg / dL. En la literatura más antigua, la riboflavina se conoce como vitamina
G debido a sus propiedades fluorescentes verdes en la luz ultravioleta. (Pinto & Rivlin, 2013). En la
figura 2.5 se muestra la estructura química de la riboflavina.

38
 Figura 2.5. Estructura química de riboflavina (Vitamina B2).

Aunque la riboflavina puede ser sintetizada por plantas, levaduras y células procariotas, los
mamíferos necesitan obtener riboflavina mediante el consumo de alimentos a base de plantas o, si
es necesario, fuentes suplementarias. La riboflavina es el precursor de las coenzimas, flavin
mononucleotido (FMN) y flavin adenina dinucleotido (FAD). (Pinto & Rivlin, 2013)

Es una vitamina muy sensible a la radiación ultravioleta y la irradiación. Las soluciones de

riboflavina exhiben cuatro bandas características de absorción espectral UV / visible (ver Figura
2.6) centradas alrededor de 220, 266, 375 y 447 nm. La riboflavina se puede ensayar
convenientemente usando sus espectros de fluorescencia amarillo-verde natural. Se obtiene una
ventaja notable de la alta absortividad molar (12.2 × 103 cm2 M-1) y la banda de absorción
(excitación) a 447 nm más estable en solvente, que da como resultado un máximo de emisión
intenso a 530 nm. (Pinto & Rivlin, 2013)

39
Figura 2.6. Espectro de absorción de la Riboflavina 5 X 10-5 M pH 7.0 (Buffer de fosfato).
(Ahmad, Fasihullah, & H.M. Vaid, 2006)

La riboflavina también está implicada en la liberación de energía de hidratos de carbono,

grasas y proteínas. Por ello, sus necesidades dependen también del contenido calórico de la dieta
(0.6 mg/1000 kcal). Otras funciones están relacionadas con el mantenimiento de una adecuada salud
ocular y de la piel. Su deficiencia (arriboflavinosis), muy rara, se manifiesta por una serie de
síntomas cutáneo-mucosos (úlceras en las comisuras de los labios), nerviosos y oculares (fotofobia).
Pueden producirse desnutriciones subclínicas o marginales (sin manifestaciones clínicas) en
alcohólicos crónicos, en las personas mayores con una alimentación inadecuada o en los
vegetarianos estrictos. (Carbajal Azcona, 2017)

40
Capítulo 3. MARCO METODOLOGICO.

3.1 Esquema General de la metodología

Etapa 1:Ajuste del método

Etapa 2: Determinación de los
parámetros de validación

-Tratamiento de la muestra - Especificidad

- Linealidad
-Preparación de los estandares - Veracidad
- Presición
- Repetibilidad
- Robustez
- Incertidumbre

Figura 3.1. Esquema general de la metodología

3.2 Equipos

Para el desarrollo de este método, se emplearon los siguientes equipos:

Un espectrofotómetro UV-Visible Thermo Scientific Serie GENESYS 10S. El cual consta de

una lámpara de flash de Xénon y un detector de doble fotodiodo de silicio, también se empleará una
balanza analítica Metler Toledo AE-200 de precisión ±0,0001 g.

3.3 Reactivos

Para la preparación de patrones de validación, se utilizaron patrones de pureza certificada del

principio activo riboflavina (vitamina B2) (marca MICROVIT B2 SUPRA 80 Lote: UQ70308080.
Concentración: 81.4 %), se trabajó con los reactivos ácido acético glacial (marca: EMSURE
concentración: 99.8%), Hidróxido de potasio (marca: EMSURE concentración: 85%). Para la
aplicación y evaluación del método se utilizó agua desionizada.

41
 3.4 ETAPA (1): AJUSTE DEL MÉTODO

3.4.1 Tratamiento de la muestra

La preparación de las muestras empleadas en el desarrollo del método analítico para la

cuantificación de vitamina B2, es la que se muestra en la figura 3.2

Blend Estandar

Pesar aproximadamente 1 g de
muestra Blend Pesar 10 mg de riboflavina

Agregar 5 mL de agua
Agregar 5 mL de agua destilada destilada

Añadir 5 mL de KOH al 8,5 % y

Añadir 5 mL de KOH al 8,5 % y agitar agitar durante 1 minuto
durante 1 minuto.
Añadir 2,5 mL de ácido
acético glacial y agitar
Agregar 2,5 mL de ácido acético durante 1 minuto
glacial y agitar durante 1 minuto
Trasvasar a un balón de 200
mL
Filtrar la solución a un balón aforado
de 200 mL
Tapar y homogenizar

Tapar y homogenizar Solución Estandar de

riboflavina 40,7 ppm

Figura 3.2. Esquema de preparación de muestras que contiene riboflavina y solución estándar de
riboflavina a emplear durante el desarrollo del método analítico para la cuantificación de riboflavina
por Espectroscopia UV-Visible.

3.5 ETAPA (2): DETERMINACIÓN DE LOS PARÁMETROS DE VALIDACIÓN

3.5.1 Especificidad

Para probar la especificidad de la riboflavina, se preparó una muestra testigo, un blanco de matriz y
la muestra patrón conocida de riboflavina. Los productos donde se determinó la vitamina B2 son los
siguientes:

42
 Tabla 3.1. Productos que maneja la empresa AD & TECH C.A. que contienen riboflavina.

Concentración de Riboflafina Concentración de

Pre-mezclas (ppm) muestra patrón de
riboflavina (ppm)
Blend pollo engorde 4,50 – 5,50 5,00
Blend Gallina Postura RP 5,50 – 6,50 6,00
Blend Gallina Cría RP 4,50 – 5,50 5,00

El criterio de aceptación según protocolo de validación de NATA (NATA , 2013) es el siguiente:

 La matriz no debe presentar ningún tipo de señal que interfiera con la señal que se
encuentra para el estándar.

3.5.2 Linealidad

Se determinó la linealidad del método en un intervalo que va desde 50% hasta 150% del
valor declarado del principio activo de los 3 productos (Tabla 3.1), se trabajó con una sola curva de
calibración aplicando el método a 5 patrones preparados en ese rango de concentración, se realizó
por triplicado la medición de las muestras, como se detalla en la Tabla 3.2

Tabla 3.2. Esquema metodológico del ensayo de linealidad.

Rango en que
prepararon las Determinaciones
Muestra Réplicas Criterio de aceptación
Concentraciones por réplica
del activo (ppm)

2,50 *1. Existe una correlación lineal

significativa (r2≥0,99)
3,75 *2. La varianza es constante
para todas las concentraciones.
*3. Distribución aleatoria de los
Riboflavina 5,00 3 1
residuos (coeficiente de Durbin
Watson > 0,05).
6,25 **4. Cumple con test estadístico
de Student (t) para regresión
7,50 lineal.

*Criterios de aceptación según protocolo de validación del ICH Q2 (R1) (INTERNATIONAL

CONFERENCE ON HARMONISATION, 2005)

43
**Criterio de aceptación según protocolo (Instituto de Salud Pública Chile, 2010)

3.5.3 Límites de Detección (LOD) y Cuantificación (LOQ)

Para la determinación de LOD y LOQ, se prepararon 6 blanco matriz de cada uno de los
productos (Tabla 3.1).

Con los ensayos a diferentes concentraciones empleados para determinar la linealidad del método,
se obtuvo el valor de la regresión lineal para el cálculo de LOD y LOQ según el protocolo de
validación de la ICH (INTERNATIONAL CONFERENCE ON HARMONISATION, 2005) que se
expresan a continuación:

 Límite de Detección (LOD): (3,3*𝜎)/𝑚

 Límite de Cuantificación (LOQ): (10*𝜎)/𝑚

Donde σ, es la desviación estándar de la respuesta del blanco y m, la pendiente de la curva de

calibración.

Se realizaron seis mediciones de blanco matriz para hacer los cálculos.

3.5.4 Exactitud.

[Link] Veracidad:

Para los estudios de veracidad se prepararon las soluciones manteniendo constante la

cantidad de muestra tomada y se agregó cantidades variables del estándar.
Se prepararon de manera independiente 3 soluciones de cada Blend cargado con el patrón
de vitamina B2, distribuidos de la siguiente manera: 80%, 100% y 120%.
Se analizó cada solución en el espectrofotómetro de UV-Visible, y se verificó que cumplan
los criterios de aceptación que se muestra en la Tabla 3.3.

[Link] Repetibilidad:

Se determinó la repetibilidad del método para el principio activo contenido en los distintos
productos en términos del coeficiente de variación aplicando el método seis veces el mismo día, por
el mismo analista y utilizando el mismo equipo.

44
Tabla 3.3. Esquema metodológico del ensayo de veracidad y repetibilidad.

Solución Conc Determinación Criterio de Prueba

Parámetro Réplicas
muestra (%)* por réplica aceptación** estadística
80 3 1 %

100 3 1 recuperación t-Student

Veracidad Riboflavina
(98,0-102,0)%
120 3 1
CV≤2,0%
Prueba F y
Repetibilidad Riboflavina 100 6 1 CV≤2,0%
t-Student

* Concentración de los productos con respecto al valor declarado en la tabla 3.1.

**Criterio de aceptación según protocolo de validación (Instituto de Salud Pública Chile, 2010)
CV: Coeficiente de variación

[Link] Precisión intermedia:

Se determinó la precisión intermedia del método para el principio activo dentro del
laboratorio en términos del coeficiente de variación aplicando el método tres veces a los productos
terminados, por analistas distintos y diferentes días.

 Criterio de aceptación (Instituto de Salud Pública de Chile, 2010) se hará en base al

coeficiente de variación de Horwitz :

CVh %= 2(1−0,5)∗𝑙𝑜𝑔𝐶
Dónde:

 C= valor nominal del analito expresado en potencia de 10-6

 Para la repetibilidad, el CVr % obtenido debe ser < (CVh %/2).
 Para la precisión intermedia, el CVRi % < (2CVh%/3).

3.5.5 Evaluación de la robustez

La determinación de la robustez del método analítico se realizó modificando el volumen de

hidróxido de potasio, el volumen de ácido acético y la variación del tiempo que transcurre desde
que se prepara las soluciones hasta que se realiza la medición (estabilidad). Estás modificaciones se
muestran en la Tabla 3.4.

45
Tabla 3.4. Condiciones a modificar al método analítico en el ensayo de robustez

Condición modificada Nivel

Volumen de KOH (mL) 4,8 5,2

Volumen de CH3COOH (mL) 2,3 2,7
Estabilidad (min) 0 30

Se empleará un diseño de experimento factorial 23.

Criterio de aceptación (Morillas & colaboradores, 2016)

 Verificar mediante el ANOVA si existen o no efectos significativos

 Comprobar el cumplimiento de los supuestos del modelo

3.5.6 Incertidumbre

La incertidumbre se determinó a partir de los datos de la validación obtenidos de la

repetibilidad, reproducibilidad y veracidad, utilizando las ecuaciones 2.19 y 2.20 con un nivel de
confianza de 95 %.

46
Capítulo 4. DISCUSIÓN DE RESULTADOS.

Se elaboró un estudio de validación para la determinación cuantitativa de vitamina B2 por

espectrofotometría UV-Visible en pre mezclas de alimentación animal, donde se puede observar el
desarrollo y cumplimiento de los parámetros de desempeño detallados en el protocolo de validación
que se describe en el apartado 3.5 del Capítulo 3, obteniendo resultados los cuales se realizaron e
interpretaron valiéndose de técnicas estadísticas, y así, establecer al final el cumplimiento de cada
uno de los parámetros estudiados.

4.1 Especificidad

Inicialmente se determinó el espectro ultravioleta de la muestra estándar de riboflavina para

obtener la longitud de onda de máxima absorbancia, se realizó un barrido en la región ultravioleta,
en el rango de 310 a 500 nm, definiéndose que la λmax para la riboflavina en estudio es de 444 nm
(ver figura 4.1).

0.35
0.3
0.25
0.2
Absorbancia

0.15
0.1
0.05
0
-0.05 310 360 410 460

-0.1
-0.15
Longitud de onda

Figura 4.1. Espectro de absorción UV-Visible de la riboflavina (9 ppm) obtenida durante el

desarrollo del método analítico.

Para evaluar la selectividad del sistema, observando su capacidad para detectar el analito de
forma inequívoca sin interferencias de otro compuesto o sustancias que puedan estar presentes en la
misma muestra, se realizó un barrido obteniendo los espectros de cada uno de los productos a
validar (ver Tabla 3.1 del capítulo 3) y se compararon con la muestra estándar de riboflavina a la
misma concentración del producto y con la matriz sin la presencia de la misma.

47
 De acuerdo a la figura 4.1, se puede observar los cambios espectrofotométricos de
absorción de la riboflavina ante la presencia de las diferentes matrices que se encuentran en los
productos, sin embargo, no hay una variación significativa entre la región de 420 nm a 500 nm del
espectro al compararlo con el patrón de riboflavina.

Blend G. Cria RP
1.8
1.6
1.4
1.2 Riboflavina con la
Absorbancia

1 presencia de la matriz
0.8 Matriz sin la presencia
0.6 de riboflavina
0.4 Riboflavina
0.2
0
-0.2 300 350 400 450 500
Longitud de onda (nm)

(a)

Blend engorde
2

1.5
Riboflavina con la
Absorbancia

1 presencia de la matriz
Matriz sin la presencia
0.5 de riboflavina
Riboflavina
0
320 370 420 470
-0.5
Longitud de onda (nm)

(b)

48
 (c)

Figura 4.2. Espectros de absorción ultravioleta de riboflavina estándar, en la matriz y blanco. (a)
Blend Gallina cria. (b) Blend pollo engorde. (c) Blend Gallina postura RP.

En la Tabla 4.1, se puede observar los resultados de la absorbancia a 444 nm, se concluye
que la matriz no presenta ningún tipo de señal que interfiera con el analito en la región de interés.

Tabla 4.1. Absorbancias obtenidas a 444 nm de las muestras en el estudio de la especificidad.

Absorbancia del Absorbancia del Absorbancia del

Producto
producto patrón de Riboflavina blanco
Blend G. Cria Rp 0,253 0,260 0,028
Blend pollo engorde 0,199 0,184 0,019
Blend G. postura Rp 0,300 0,287 0,036

4.2 Linealidad

La linealidad se llevó a cabo a través de la metodología mostrada en la Sección 3.5.2 del

Capítulo 3, en donde se realizaron tres mediciones de cada solución en distintos días. Los resultados
se muestran en la Tabla 4.2

49
Tabla 4.2. Parámetros estadísticos obtenidos en el estudio de la linealidad del método para la
determinación de riboflavina en premezcla de alimentos para animales.

Coeficiente de correlación
Coeficiente de correlación Estadístico Durbin-Watson
ajustado
0,9995 99.8912 0,0617

El coeficiente de correlación nos indica que hay una fuerte relación entre la absorbancia y el
contenido del activo. Un coeficiente de correlación ajustado que explica el 99,9022% de la
variabilidad en la absorbancia. En la figura 4.3 se presenta la curva de calibración y el modelo
ajustado, la cual muestra que los puntos experimentales se aproximan a un ajuste lineal, también se
indica la ecuación de la recta, con su respectiva pendiente e intercepto.

Figura 4.3 Curva de calibración para la determinación de riboflavina en premezclas de alimentos

para animales.

50
 El supuesto de independencia se verificó por medio del estadístico de Durbin-Watson (tabla
4.2) que examina los residuos para determinar si hay alguna correlación significativa basada en el
orden en el que se presentan los datos. Puesto que el valor P es mayor que 0,05; nos indica que no
hay relación significativa con un nivel de confianza del 95% entre el orden en que se presentan los
datos con los residuos en el análisis de regresión, esto mismo se pueden observar en el gráfico de
residuos vs número de fila (figura 4.4), donde se observa una ligera tendencia, pero el estadístico
dice que no es significativo al 95% de confianza.

Gráfico de Residuos
Absorbancia = 0,003713 + 0,0306682*ppm

2,5
Rediduo Estudentizado

1,5

0,5

-0,5

-1,5

-2,5
0 3 6 9 12 15
número de fila

Figura 4.4. Gráfico de residuos vs número de filas para verificar el supuesto de independencia en el
modelo lineal propuesto para la curva de calibración.

El supuesto de normalidad se pudo comprobar con el estudio estadístico de Shapiro-Wilk.

Debido a que el valor-P de las pruebas realizadas es mayor a 0,05, los datos se ajustan a una
distribución normal con un nivel del 95,0% de confianza. En la Tabla 4.3 pueden observarse los
resultados de esta prueba

51
Tabla 4.3 Resultados de las pruebas estadísticas de Shapiro-Wilk y Bartlett para los supuestos de
normalidad y varianza constante respectivamente.

Prueba Valor-P
Estadístico W de Shapiro-Wilk 0,0695
Estadístico de Bartlett 0,9997

La Tabla 4.3 también presenta el resultado de la prueba de Bartlett, estadístico con el cual se
puede verificar el supuesto de varianza constante. Puesto que el valor-P es mayor a 0,05; no existe
una diferencia estadísticamente significativa entre las desviaciones estándar con un nivel del 95,0%
de confianza, verificando así el supuesto de varianza constante.

Estos resultados satisfacen los criterios establecidos en la Tabla 3.2 del Capítulo 3. Se concluye
que el método desarrollado es lineal en el intervalo de concentraciones relativas (con respecto al
valor declarado) que va desde el 50% al 150%, la varianza es constante para todas las
concentraciones y la distribución de los residuos es aleatoria.

4.3 Límites de Detección (LOD) y Cuantificación (LOQ)

Basados en la especificación detallada en el apartado 3.5.3 del Capítulo 3 se realizó el cálculo

de ambos parámetros, obteniendo los resultados que se muestran en la Tabla 4.4.

Tabla 4.4 Límites de detección y cuantificación para el método de determinación riboflavina por
Espectrofotometría UV-Visible.

Desviación Límite de detección Límite de

Producto estándar (S) (LOD) cuantificación (LOQ)
ppm ppm ppm
Blend pollo engorde 0,0012 0,12 0,38
Blend Postura RP 0,0012 0,12 0,38
Blend Gallina Cría RP 0,0013 0,12 0,38

Los resultados anteriores demuestran que el método analítico es capaz de detectar y cuantificar
cantidades pequeñas y concentraciones muchos menores al valor declarado (Tabla 3.1) en las
muestras en estudio del compuesto de interés (riboflavina).

52
 4.4 Precisión

La precisión se evaluó en función de la repetibilidad y la precisión intermedia (ver Sección

3.5.4 del Capítulo 3), expresadas a través del coeficiente de variación. Los resultados se
muestran en la Tabla 4.5.

Tabla 4.5. Repetibilidad y precisión intermedia del método para la determinación de riboflavina
por Espectrofotometría UV-Visible.

Repetibilidad Precisión intermedia

Prueba de
Producto CRP CRP
S CV t student S CV Fisher (F)
(%) (%)
Blend
Pollo 0,096 0,001 1,11 1,42 0,095 0,003 2,83 0,113
engorde
Blend
Postura 0,122 0,002 1,87 1,74 0,122 0,003 2,20 0,588
RP
Blend
Gallina 0,100 0,001 1,46 0,827 0,099 0,002 1,94 0,833
Cria RP
CRP: Concentración relativa promedio
CV: Coeficiente de variación

Se realizó la prueba t student para verificar que no hay diferencia estadísticamente

significativa con el valor verdadero de cada producto. Al comparar el t calculado (Tabla 4.5) con
el t crítico (2,57) con un nivel de confianza del 95%, se concluye que no existe diferencias
significativas para los tres productos, mp hay evidencia de que haya errores sistemáticos en el
análisis.

Adicionalmente, se realizó la prueba F de igualdad de varianzas para verficar que no existe

una diferencia significativa, mediante la siguiente hipótesis estadística:

𝐻0, : 𝜎𝑥2 = 𝜎𝑦2 (ℎ𝑖𝑝ó𝑡𝑒𝑠𝑖𝑠 𝑛𝑢𝑙𝑎)

𝐻𝐴, : 𝜎𝑥2 ≠ 𝜎𝑦2 (ℎ𝑖𝑝ó𝑡𝑒𝑠𝑖𝑠 𝑎𝑙𝑡𝑒𝑟𝑛𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎)

El valor obtenido de cada producto en la prueba de Fisher entre los resultados referentes a
repetibilidad y precisión intermedia es menor al valor crítico de F (5,050), se acepta la hipótesis
nula con un nivel de confianza del 95 % por lo que se puede concluir que las dos varianzas no son
significativamente diferentes. Esto indica que las condiciones del laboratorio son suficientemente
estables y no agregan variabilidad a los resultados del análisis.

53
 Además, los resultados en la precisión intermedia obedecen la ley de Horwitz ya que el
coeficiente de variación de Horwitz (8%) es mayor que el coeficiente de variación obtenido. Por lo
cual se cumple el criterio de aceptabilidad establecido.

Estos resultados satisfacen los criterios de aceptación establecidos en la Tabla 3.3 cumpliendo
con el protocolo de validación del Instituto de salud pública de Chile (Instituto de Salud Pública
Chile, 2010)

4.5 Veracidad
La veracidad se estudió, según la Sección [Link] del Capítulo 3, en los extremos de la
linealidad y el 100% de la misma, los resultados se muestran en la Tabla 4.5. Donde se evidencia
que tanto él %R como el CV satisfacen los criterios de aceptación establecidos en la Tabla 3.3.
Además, se evaluaron los resultados a través de las siguientes hipótesis estadísticas:

H_0: X ̅=μ (hipótesis nula)

H_a: X ̅≠μ (hipótesis alternativa)

En la Tabla 4.6 se puede observar los valores de p obtenidos son superiores a 0,05, razón por la
cual se acepta la hipótesis nula (H_0) con un nivel de significancia del 5%. La veracidad del método
es adecuada porque no existe diferencia significativa entre el valor esperado y el valor obtenido.

54
Tabla 4.6 Estudio de la exactitud del método para la determinación de riboflavina por
Espectrofotometría UV-Visible.

Concentración
Producto relativa a la %R ̅̅̅̅̅
%𝐑 CV 𝐩𝐂𝐚𝐥𝐜𝐮𝐥𝐚𝐝𝐨 *
declarada
100,27
80% 100,17 99,57 1,14 0,0842
98,26
101,19
Blend pollo engorde 100% 102,11 101,24 0,83 0,8972
100,43
100,65
120% 98,93 99,74 0,87 0,8017
99,63
103,44
80% 99,57 101,53 1,90 0,9495
101,59
99,06
Blend postura RP 100% 100,49 99,15 1,31 0,8898
97,90
99,25
120% 97,51 99,22 1,71 0,9726
100,90
99,66
80% 98,17 99,51 1,28 0,8069
100,70
100,69
Blend Gallina Cria
100% 99,42 99,79 0,78 0,1929
RP
99,26
100,11
120% 98,29 98,95 1,02 0,1585
98,45
%𝑅: Porcentaje de recobro
𝛼 = 0.05*

55
 4.6 Determinación de la Incertidumbre

La incertidumbre del método se estimó por medio de las ecuaciones 2.22 y 2.23 con
respecto a la concentración relativa de los analitos, (ver Tabla 4.7): Se requiere un nivel de
confianza del 95%, por lo tanto el factor de cobertura (K) empleado fue 2. Se tiene una tolerancia de
20 %, debido a que la concentración relativa de los activos debe de encontrarse en el intervalo 90-
110% para que el producto sea aprobado. La relación T/2U recomendada debe encontrarse dentro
del intervalo 2<T/2U<10 (Sánchez Pérez, de Vicente, & Prieto Esteban, 2012) .

Tabla 4.7. Estimación de la incertidumbre del método para la determinación de la concentración

relativa de riboflavina en Blend pollo engorde, Postura Rp y Cria Rp mediante espectrofotometría
UV-Visible.

Blend pollo Blend G. postura Blend Gallina Cria

Producto
engorde RP Rp
Desviación estándar en
condiciones de
1,50 % 1,65 % 1,45%
reproducibilidad
Sr
Desviación estándar
observada en el ensayo de
1,15 % 1,86 % 0,97 %
veracidad
u(u)
Desviación estándar
observada en la señal 0,002 0,003 0,001
u(x)
Coeficiente lineal
0,0306682
C
Incertidumbre estándar
combinada 1,89 % 2,48 % 1,75 %
u(y)
Incertidumbre expandida
3,77 % 4,97 % 3,50 %
(U)
2,65 2,01 2,86
T/2U

Como se puede observar, la relación T/2U de cada producto se encuentra dentro del rango
de intervalo de aceptación, por lo que se puede concluir que el método es apropiado para determinar
las cantidades del activo dentro de las especificaciones establecidas para su aprobación.

56
 4.7 Robustez

La robustez se realizó para determinar bajo qué condiciones analíticas se puede obtener
resultados confiables. Esta se estudió, según la Sección 3.5.5 del Capítulo 3, bajo un diseño de
experimentos con arreglo factorial 23; variándose el volumen de ácido acético, la estabilidad y el
volumen de hidróxido de potasio para cada producto evaluado.

4.7.1 Blend pollo engorde.

La Tabla 4.8 muestra los experimentos realizados y los resultados obtenidos

(concentración de riboflavina) para el producto Blend pollo engorde.

Tabla 4.8. Concentraciones de riboflavina obtenidas al aplicar el diseño de experimentos para

evaluar la robustez del método para el Blend pollo engorde.

Factores
Concentración
Producto Experimentos Volumen de Volumen de de Riboflavina
Estabilidad
ácido acético hidróxido de (%)
(min)
(mL) potasio (mL)
1 2,7 5,2 30 0,107
2 2,3 5,2 30 0,092
3 2,7 4,8 30 0,097
Blend 4 2,3 4,8 0 0,099
pollo
engorde 5 2,3 5,2 0 0,100
6 2,3 4,8 30 0,096
7 2,7 5,2 0 0,096
8 2,7 4,8 0 0,103

La figura 4.5 muestra el diagrama de Pareto de los efectos, para observar las influencias de
cada factor, así como las interacciones de estos sobre el método analítico.

57
 Diagrama de Pareto Estandarizada para Porcentaje de riboflavina

AC +
-
A:Volumen de HA

BC

AB

C:Estabilidad

B:Volumen de OH

0 3 6 9 12 15
Efecto estandarizado

Figura 4.5. Diagrama de Pareto de los efectos en el estudio de la robustez del método para la
cuantificación de riboflavina por espectrofotometría UV-Visible en Blend pollo engorde.

Se puede observar que el método no es afectado significativamente por los cambios

realizados en las condiciones analíticas (volumen de ácido acético, la estabilidad y el volumen de
hidróxido de potasio) con un nivel de confianza del 95%.

Al evaluar la tabla ANOVA que se muestra en el Apéndice (Tabla A.5) del diseño de
experimentos, se observa que ningún factor tiene un efecto significativo, con un nivel de confianza
del 95%, al ser el valor P de este estadístico mayor a 0,05

En la Tabla 4.9 se puede observar el valor para el coeficiente de determinación del modelo
ajustado para el Blend pollo engorde, lo cual indica el 60,066% de la variabilidad en concentración
de riboflavina. El estadístico R cuadrado ajustado, que es más adecuado para comparar modelos
con diferente número de variables independientes, es de 0,0% de la variabilidad en la respuesta
(recobro), indicando un ajuste no adecuado del método, esto es debido a que la desviación de los
niveles escogidos de cada factor no tiene una contribución significativa a la variabilidad del
procedimiento, por lo que se puede inferir que se debe ajustar los niveles de cada factor para que
contribuya con la variabilidad total del método (esto corrobora la robustez del método ante la
variación de estos factores), sin embargo, para esta validación solo se está estudiando si el
procedimiento es robusto al cambiar los factores en proporciones razonables, y no se está buscando
los límites de los factores para que haya una variación en la incertidumbre.

58
Tabla 4.9. Coeficiente de determinación del modelo ajustado en el estudio de riboflavina por
espectrofotometría UV visible para el Blend pollo engorde.

Parámetro Resultados
R2 60,066 %
2
R Ajustado 0,0 %

Además del análisis estadístico por diseño de experimentos, se evaluaron los supuestos del
ANOVA, todas las gráficas de los supuestos se pueden observar en el Apéndice. Se observa en el
supuesto de Varianza constante (Figura A.1) una distribución aleatoria de los puntos a través de la
línea horizontal, cumpliéndose con esto el supuesto de varianza constante.

No existe un comportamiento lineal en el supuesto de normalidad debido a la falta de ajuste

que tiene los factores que no afectan y la variabilidad que se observa se debe al error aleatorio. Se
determinó la curtosis estandarizada para determinar si la muestra proviene de una distribución
normal, si los valores se encuentran fuera del rango de -2 a +2 indican desviaciones significativas
de la normalidad, lo que tendería a invalidar cualquier prueba estadística con referencia a la
desviación estándar. En este caso el valor de curtosis estandarizada se encuentra dentro del rango
esperado (-1,6566) por lo que se comprueba que existe una distribución normal en el estudio.

El supuesto de independencia se evaluó empleando el estadístico Durbin- Watson, para

determinar si hay alguna correlación significativa basada en el orden en que se presentan los datos,
se obtuvo un valor P de 2,0, el cual es mayor a 0,05 por lo que se concluye que no hay indicación de
autocorrelación serial en los residuos con un nivel de confianza del 95%.

Se concluye que el método es robusto para el Blend pollo engorde ya no es afectado por los
cambios realizados en las condiciones analíticas (Volumen de hidróxido de potasio, volumen de
ácido acético y estabilidad).

59
 4.7.2 Blend postura RP.

La Tabla 4.10 muestra los experimentos realizados y los resultados obtenidos

(concentración de riboflavina) para el producto Blend postura RP.

Tabla 4.10. Concentraciones de riboflavina obtenidas al aplicar el diseño de experimentos para

evaluar la robustez del método para el Blend postura RP.

Factores
Concentración
Producto Experimentos Volumen de Volumen de de Riboflavina
Estabilidad
ácido acético hidróxido de (%)
(min)
(mL) potasio (mL)
1 2,7 5,2 30 0,112
2 2,3 5,2 30 0,115
3 2,7 4,8 30 0,126
Blend 4 2,3 4,8 0 0,116
postura
5 2,3 5,2 0 0,125
RP
6 2,3 4,8 30 0,114
7 2,7 5,2 0 0,114
8 2,7 4,8 0 0,117

La Figura 4.6 muestra el diagrama de Pareto de los efectos, para observar las influencias de
cada factor, así como las interacciones de estos sobre el método analítico. Se puede observar que los
factores de manera individual y en las interacciones en el método no son afectados
significativamente con un nivel de confianza del 95 %. Al evaluar la tabla ANOVA que se muestra
en la tabla A.5 en el Apéndice del diseño, se observa que ningún factor tiene un efecto
significativo, con un nivel de confianza del 95%, al ser el valor P de este estadístico mayor a 0,05

60
 Diagrama de Pareto Estandarizada para Var_1

AB +
-

AC

BC

B:Volumen de OH

C:Estabilidad

A:Volumen de HA

0 3 6 9 12 15
Efecto estandarizado

Figura 4.6. Diagrama de Pareto de los efectos en el estudio de la robustez del método para la
cuantificación de riboflavina por espectrofotometría UV-Visible en Blend postura RP.

En la Tabla 4.11 se puede observar el valor para el coeficiente de determinación del

modelo ajustado para la determinación de riboflavina por espectrofotometría UV Visible del Blend
postura RP, lo cual indica que este modelo ajustado, explica el 99,4137% de la variabilidad en
Concentración de riboflavina. El estadístico R-cuadrada ajustada, que es más adecuado para
comparar modelos con diferente número de variables independientes, es 99,8958%, de la
variabilidad en la respuesta (recobro), indicando un ajuste adecuado del método.

Tabla 4.11. Coeficiente de determinación del modelo ajustado en el estudio de riboflavina por
espectrofotometría UV visible para el Blend postura RP.

Parámetro Resultados
R2 99,4137 %
2
R Ajustado 95,8958 %

Además del análisis estadístico por diseño de experimentos, se evaluaron los supuestos del
ANOVA. La prueba de curtosis estandarizada verificó que existe una distribución normal en la
muestra, ya que el valor obtenido se encuentra dentro del rango aceptado (-1,6166).

61
 El supuesto de varianza constante fue evaluado en la Figura A.5, donde se observa una
completa distribución aleatoria de los puntos a través de la línea horizontal, cumpliéndose con esto
el supuesto de varianza constante.

El supuesto de independencia se evaluó empleando el estadístico Durbin- Watson

obteniendo un valor P de 2,0, el cual es mayor a 0,05 por lo que se concluye que no hay indicación
de autocorrelación serial en los residuos con un nivel de confianza del 95%.

Se concluye que el método es robusto ya que no es afectado significativamente por los

cambios realizados en las condiciones analíticas (Volumen de hidróxido de potasio, volumen de
ácido acético y estabilidad) con un nivel de significancia del 5%.

4.7.3 Blend Gallina Cria RP.

La Tabla 4.12 muestra los experimentos realizados y los resultados obtenidos

(concentración de riboflavina) para el producto Blend Gallina Cria RP.

Tabla 4.12. Concentraciones de riboflavina obtenidas al aplicar el diseño de experimentos para

evaluar la robustez del método para el Blend Gallina Cria RP.

Factores
Concentración
Producto Experimentos Volumen de Volumen de de Riboflavina
Estabilidad
ácido acético hidróxido de (%)
(min)
(mL) potasio (mL)
1 2,7 5,2 30 0,106
2 2,3 5,2 30 0,105
3 2,7 4,8 30 0,107
Blend 4 2,3 4,8 0 0,104
Gallina
Cria RP 5 2,3 5,2 0 0,104
6 2,3 4,8 30 0,105
7 2,7 5,2 0 0,102
8 2,7 4,8 0 0,100

62
 La Figura 4.7 muestra el diagrama de Pareto de los efectos, para observar las influencias de
cada factor, así como las interacciones de estos sobre el método analítico. Se puede observar que el
método no es afectado significativamente por los cambios realizados en las condiciones analíticas
con un nivel de confianza del 95%. Al evaluar el efecto bloque en la tabla ANOVA del diseño, se
observa que ningún factor tiene un efecto significativo al ser el valor P de este estadístico mayor a
0,05

Diagrama de Pareto Estandarizada para Porcentaje de riboflavina

C:Estabilidad +
-
AC

BC

A:Volumen de HA

AB

B:Volumen de OH

0 3 6 9 12 15
Efecto estandarizado

Figura 4.7. Diagrama de Pareto de los efectos en el estudio de la robustez del método para la
cuantificación de riboflavina por espectrofotometría UV-Visible en Blend Gallina Cria RP.

Se puede observar que los factores de manera individual y en las interacciones en el método
no son afectados significativamente con un nivel de confianza del 95 %. Al evaluar el efecto bloque
en la tabla ANOVA que se muestra en la tabla A.5 en el apéndice del diseño, se observa que
ningún factor tiene un efecto significativo, con un nivel de confianza del 95%, al ser el valor P de
este estadístico mayor a 0,05

En la Tabla 4.13 se puede observar el valor para el coeficiente de determinación del

modelo ajustado para la determinación de riboflavina por espectrofotometría UV Visible del Blend
Gallina Cria RP, lo cual indica que este modelo ajustado, explica el 96,7742% de la variabilidad en
Concentración de riboflavina. El estadístico R-cuadrada ajustada, es de 77,4194 %, de la
variabilidad en la respuesta (recobro), indicando un ajuste adecuado del método.

63
Tabla 4.13. Coeficiente de determinación del modelo ajustado en el estudio de riboflavina por
espectrofotometría UV visible para el Blend pollo engorde.

Parámetro Resultados
R2 96,7742 %
2
R Ajustado 77,4194 %

Además del análisis estadístico por diseño de experimentos, se evaluaron los supuestos del
ANOVA. La prueba de curtosis estandarizada verificó que existe una distribución normal en la
muestra, ya que el valor obtenido se encuentra dentro del rango aceptado (-1,6166).

El supuesto de varianza constante (Figura A.8), existe una completa distribución aleatoria
de los puntos a través de la línea horizontal, cumpliéndose con esto el supuesto de varianza
constante.

El estadístico Durbin- Watson se obtuvo un valor P de 2,0, el cual es mayor a 0,05 por lo
que se concluye que no hay indicación de autocorrelación serial en los residuos con un nivel de
confianza del 95%.

Se concluye que el método no es afectado significativamente por los cambios realizados en

las condiciones analíticas con un nivel de significancia del 5%, de acuerdo a este estudio el método
es robusto.

64
Capítulo 5. CONCLUSIONES

En este estudio, se desarrolló un método analítico simple, selectivo y confiable para la

determinación de riboflavina en pre mezcla de alimentos para animales.

La simplicidad del método fue ilustrada por los requisitos mínimos de químicos, ya que el
hidróxido de potasio y el ácido acético son los únicos reactivos que se usaron en el procedimiento,
mientras que todas las soluciones de estándar y de muestra se prepararon en agua, esto sugiere que
el método propuesto es rentable y favorable al medio ambiente.

Se desarrolló un método analítico lineal en todo el intervalo de trabajo (50-150) % en

relación a la concentración de riboflavina contenida en tres productos distintos, con el cual fueron
evaluados diversos parámetros de validación.

La incertidumbre del método ratificó que la concentración del activo se encuentra dentro de
los intervalos establecidos para cada producto estudiado.

Según el estudio de robustez empleado los cambios realizados no afectan significativamente

para el Blend postura RP y Blend Gallina Cría, para el Blend pollo engorde los niveles tomados no
contribuyen significativamente al modelo estudiado siendo un método robusto.

De acuerdo a los resultados obtenidos durante la validación se puede considerar que el

método analítico desarrollado posee una precisión y exactitud adecuada para la determinación de
riboflavina en pre mezcla de alimentos para animales a través de la técnica espectrofotometría UV-
Visible.

65
APENDICE

A.1 Tablas

Tabla A.1: Datos empleados para el estudio de la linealidad del método.

Réplicas Concentración Absorbancia
50 % 0,078
75 % 0,100
1 100 % 0,139
125 % 0,189
150 % 0,239
50 % 0,080
75 % 0,103
2 100 % 0,143
125 % 0,193
150 % 0,241
50 % 0,079
75 % 0,103
3 100 % 0,145
125 % 0,192
150 % 0,241

Tabla A.2. Concentración de riboflavina obtenida durante el ensayo de repetibilidad de cada

producto.
Producto Concentración
0,097
0,097
0,096
Blend pollo engorde
0,096
0,095
0,095
0,121
0,119
0,119
Blend G. Postura RP
0,124
0,123
0,123
0,100
0,099
0,102
Blend G. Cria RP
0,100
0,100
0,097

66
Tabla A.3. Concentración de riboflavina obtenida durante el ensayo de precisión intermedia de
cada producto.

Producto Analista Concentración

0,097
1 0,093
0,099
Blend pollo engorde
0,095
2 0,097
0,092
0,120
1 0,126
0,121
Blend G. Postura RP
0,121
2 0,125
0,119
0,096
1 0,100
0,100
Blend G. Cria RP
0,098
2 0,099
0,101

67
Tabla A.4. Datos empleados para el estudio de la veracidad del método.

Concentración de
Producto % Recobro
riboflavina cargado (ppm)
100,27
4,07 100,17
98,26
101,19
Blend pollo engorde 5,16 102,11
100,43
100,65
6,15 98,93
99,63
103,44
5,00 99,57
101,59
99,06
Blend G. Postura RP 6,25 100,49
97,90
99,25
7,50 97,51
100,90
99,66
4,51 98,17
100,70
100,69
Blend G. Cria RP 5,01 99,42
99,26
100,11
5,51 98,29
98,45

68
Tabla A.5. ANOVA del modelo ajustado en el estudio de la robustez del método.

Suma de Cuadrado
Producto Fuente Gl Razón-F Valor-P
Cuadrados Medio
A: Volumen de
0,000032 1 0,000032 0,53 0,5997
HA
B: Volumen de
0,0 1 0,0 0,00 1,0000
OH
Blend pollo C Estabilidad 0,0000045 1 0,0000045 0,07 0,8305
engorde. AB 0,0000045 1 0,0000045 0,07 0,8305
AC 0,000032 1 0,000032 0,53 0,5997
BC 0,000018 1 0,000018 0,30 0,6821
Error total 0,0000605 1 0,0000605
Total (corr.) 0,0001515 7
A: Volumen de
1,25E-7 1 1,25E-7 0,11 0,7952
HA
B: Volumen de
0,000006125 1 0,000006125 5,44 0,2578
OH
Blend G. C: Estabilidad 0,000003125 1 0,000003125 2,78 0,3440
postura RP. AB 0,000091125 1 0,000091125 81,00 0,0704
AC 0,000045125 1 0,000045125 40,11 0,0997
BC 0,000045125 1 0,000045125 40,11 0,0997
Error total 0,000001125 1 0,000001125
Total (corr.) 0,000191875 7
A: Volumen de
0,000001125 1 0,000001125 1,00 0,5000
HA
B: Volumen de
1,25E-7 1 1,25E-7 0,11 0,7952
OH
Blend Gallina C: Estabilidad 0,000021125 1 0,000021125 18,78 0,1444
Cria RP AB 1,25E-7 1 1,25E-7 0,11 0,7952
AC 0,000010125 1 0,000010125 9,00 0,2048
BC 0,000001125 1 0,000001125 1,00 0,5000
Error total 0,000001125 1 0,000001125
Total (corr.) 0,000034875 7

69
 A.2 Supuestos

Figura A.1. Gráfico de residuos vs predichos para el supuesto de varianza constante para la
cuantificación de riboflavina por espectrofotometría UV-Visible en Blend pollo engorde.

Gráfica de Probabilidad Normal para Residuos

99,9

99
95

80
porcentaje

50

20

5
1

0,1
-28 -18 -8 2 12 22 32
(X 0,0001)
residuos

Figura A.2. Gráfico de probabilidad normal para residuos para el supuesto de normalidad para la
cuantificación de riboflavina por espectrofotometría UV-Visible en Blend pollo engorde.

70
Figura A.3. Gráfico de residuos vs orden de ejecución para el supuesto de independencia para la
cuantificación de riboflavina por espectrofotometría UV-Visible en Blend pollo engorde.

Figura A.4. Gráfico de probabilidad normal para residuos para el supuesto de normalidad para la
cuantificación de riboflavina por espectrofotometría UV-Visible en Blend Postura RP.

71
 Gráfica de Residuos para Porcentaje de riboflavina

(X 0,00001)
40

20

residuo 0

-20

-40
0,11 0,114 0,118 0,122 0,126
predichos

Figura A.5. Gráfico de residuos vs predichos para el supuesto de varianza constante para la
cuantificación de riboflavina por espectrofotometría UV-Visible en Blend postura RP.

Gráfica de Residuos para Porcentaje de riboflavina

(X 0,00001)
15

10

5
residuo

-5

-10

-15
0 2 4 6 8
número de ejecución

Figura A.6. Gráfico de residuos vs orden de ejecución para el supuesto de independencia para la
cuantificación de riboflavina por espectrofotometría UV-Visible en Blend Postura RP.

72
 Gráfica de Probabilidad Normal para Residuos

99,9

99
95

porcentaje 80

50

20

5
1

0,1
-40 -20 0 20 40
(X 0,00001)
residuos

Figura A.8. Gráfico de probabilidad normal para residuos para el supuesto de normalidad para la
cuantificación de riboflavina por espectrofotometría UV-Visible en Blend Gallina Cria RP.

Gráfica de Residuos para Porcentaje de riboflavina

(X 0,00001)
40

20
residuo

-20

-40
100 102 104 106 108
(X 0,001)
predichos

Figura A.9. Gráfico de residuos vs predichos para el supuesto de varianza constante para la
cuantificación de riboflavina por espectrofotometría UV-Visible en Blend Gallina Cria RP.

73
 Gráfica de Residuos para Porcentaje de riboflavina

(X 0,00001)
40

20

residuo
0

-20

-40
0 2 4 6 8
número de ejecución

Figura A.10. Gráfico de residuos vs orden de ejecución para el supuesto de independencia para la
cuantificación de riboflavina por espectrofotometría UV-Visible en Blend Gallina Cria RP.

74
BIBLIOGRAFÍA

Ahmad, I., Fasihullah, Q., & H.M. Vaid, F. (2006). Effect of light intensity and wavelengths on
photodegradation reactions of riboflavin in aqueous solution. ELSEVIER, 21-27.

Arenas Sosa, I., & López Sánchez, J. L. (2004). ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN. Cuernavaca:
Instituto de Biotecnología. Universidad Nacional Autónoma de México.

Belal, T., Shaalan, R., & Haggag, R. (2011). Gradient HPLC-Diode Array Detector Stability-Indicating
Determination of Lidocaine Hydrochloride and Cetylpyridinium Chloride in Two Combined
Oral Gel Dosage Forms. JOURNAL OF AOAC INTERNATIONAL, 503-512.

Bueno-Solano, C., Campas-Baypoli, O. N., Díaz-García, A. S., Izaguirre-Flores, E. I., Verdugo-

Zamorano, W., Estrada-Alvarado, M. I., y otros. (2009). CUANTIFICACIÓN DE RIBOFLAVINA
(VITAMINA B2) EN PRODUCTOS LÁCTEOS POR HPLC. Rev Chil Nutr, 136-142.

Carbajal Azcona, Á. (2017). Manual de Nutrición y Dietética. Universidad Complutense de Madrid.

Carmen. (2001). Universidad de Salamanca. Campus de excelencia internacional. Recuperado el 18

de 02 de 2018, de
[Link]

CITAC and EURACHEM. (2002). GUIDE TO QUALITY IN ANALYTICAL CHEMISTRY. CITAC and
Eurachem.

Control metrológico . (2014). Control metrológico. Recuperado el 2018 de Marzo de 03, de

[Link]

Desimoni, E., & Brunetti, B. (2011). Uncertainty of measurement and conformity assessment: a
review. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 1729-1741.

Dong, M. W. (2006). MODERN HPLC FOR PRACTICING SCIENTISTS. New Jersey: John Wiley & Sons.

Duque, D., Lara, R., & Perez, J. H. (29 de Junio de 2015). Política y Norma: Validación de métodos
analíticos. (CCQ-VA-025), 4.

EURACHEM. (2012). Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement. CITAC.

EURACHEM/CITAC. (2007). EURACHEM/CITAC Guide: Use of uncertainty information in compliance

assessment. EURACHEM/CITAC.

FAO PRODUCCIÓN Y SANIDAD ANIMAL. (2014). BUENAS PRÁCTICAS PARA LA INDUSTRIA DE

PIENSOS: Implementación del Código de Prácticas Sobre Buena Alimentación Animal.
Roma.

75
Farmacopeia de los Estados Unidos de América 35. (2011). 1, 967-971. Estados Unidos de América.

Fernández Oller, A. (22 de Julio de 2014). Nutrición animal. Obtenido de Nutrinews:

[Link]

Fuad, A.-R., & Maher, K. (Febrero de 2010). Analysis Azithromycin and Its Related Compounds by
RP-HPLC with UV Detection. Journal of Chromatography Science, 48, 86-90.

Garcia Quispe, J. C. (2016). Validación de la técnica analítica por espectrofotometria UV-Visible

para la cuantificación e identificación de ribofavina. Trujillo: Universidad Naciona de
Trujillo .

Ghari, T., Kobarfard, F., & Mortazavi, S. A. (Junio de 2013). Development of a Simple RP-HPLC-UV
Method determination of Azithromycin in Bulk and Pharmaceutical forms as an to the USP
Method. Iranian Journal of Pharmaceutical Research, 12, 57-63.

Gutiérrez Pulido, H., & de la Vara Salazar, R. (2008). ANÁLISIS Y DISEÑO DE EXPERIMENTOS.
Mexico: McGRAW-HILL/INTERAMERICANA EDITORES.

Harris, D. (2007). Análisis químico cuantitativo. New York: Reverté.

Horwitz, W., & Albert, R. (2006). The Horwitz Ratio (HorRat): AUseful Index of Method
Performance with Respect to Precision. JOURNAL OF AOAC INTERNATIONAL, 1095-1109.

Instituto de Salud Pública Chile. (2010). Validación de métodos y determinación de la

incertidumbre de la medición: “Aspectos generales sobre la validación de métodos”.
Santiago de Chile: Instituto de Salud Pública Chile.

Instituto de Salud Pública de Chile. (2010). Validación de métodos y determinación de la

incertidumbre de la medición: “Aspectos generales sobre la validación de métodos”.
Santiago de Chile.

INTERNATIONAL CONFERENCE ON HARMONISATION. (2005). VALIDATION OF ANALYTICAL

PROCEDURES: TEXT AND METHODOLOGY.

ISO/TC 69/SC 6. (2002). ISO/DTS 21748: Guide to the use of repeatability, reproducibility and
trueness estimates in measurement uncertainty estimation. ISO.

Jimidar, I., Heylen, P., & De Smet, M. (2007). 16: METHOD VALIDATION. En S. Ahuja, & H.
Rasmussen, HPLC METHOD DEVELOPMENT FOR PHARMACEUTICALS. Londres: Elsevier.

Maya Henao, S. (2016). Procesos de Producción de Alimentos balanceados. Caldas: Facultad

Ciencias Administrativas Agropecuarias. Corporación Universitaria Lasallista.

76
Minitab. (2017). Soporte de minitab. Recuperado el 22 de Octubre de 2018, de Support minitab:
[Link]
statistics/anova/supporting-topics/basics/what-is-anova/

Moldoveanu, S. C., & David, V. (2013). ESSENTIALS IN MODERN HPLC SEPARATIONS. Amsterdam:
Elsevier.

Morillas, & colaboradores. (2016). La Adecuación al Uso de los Métodos Analíticos Una Guía de
Laboratorio para Validación de Métodos y Temas Relacionados. España: Eurolab.

NATA . (2013). Guidelines for the validation and verification of quantitative and qualitative test
methods.

O. KADARA, R., D. HAGGETT, B., & J. BIRCH, B. (2006). Disposable Sensor for Measurement of
Vitamin B2 in Nutritional Premix, Cereal, and Milk Powder. Journal of Agricultural and
Food Chemistry, 4921-4924.

Oficina de las Naciones Unidas contra la Droga y el Delito. (2010). Directrices para la validación de
métodos analíticos y la calibración del equipo utilizado para el análisis de drogas ilícitas en
materiales incautados y especímenes biológicos. Nueva York: NACIONES UNIDAS.

PCHGS, P., [Link], & [Link]. (2013). VALIDATED GRADIENT STABILITY-

INDICATING UPLC METHOD FOR THE DETERMINATION OF LIDOCAINE AND ITS
DEGRADATION IMPURITIES IN PHARMACEUTICAL DOSAGE FORM. Prathyusha PCHGS*1,
P.Shanmugasundaram1, P.Y.Naidu2, 3(1), 01-10.

Pinto, J. T., & Rivlin, R. S. (2013). Riboflavin (Vitamin B2). Swinburne: Swinburne University of
Technology.

SALAZAR TORRES, C. A. (30 de Julio de 2011). EVALUACIÓN DE TRES CONCENTRACIONES DE

PREMEZCLAS DE VITAMINAS Y MINERALES EN ALIMENTO BALANCEADO Y SU RESPUESTA
EN LOS PARÁMETROS PRODUCTIVOS DE POLLOS BROILERS. Recuperado el 25 de 02 de
2018, de Universidad Centroccidental Lisandro:
[Link]

Sánchez Pérez, Á., de Vicente, J., & Prieto Esteban, E. (Julio de 2012). Metrología y enseñanza:
Errores, incertidumbres y evaluación de la conformidad. e-medida Revista Española de
Metrologia, 1(2), 93-103.

Serrano Martínez, J. L. (2007). EL ESPECTRO ELECTROMAGNÉTICO. ABSORCIÓN VISIBLE-

ULTRAVIOLETA . Cartagena: Universidad politécnica de Cartagena.

Sweetman, S. C. (2009). Martindale The Complete Drug Reference. Londres: Pharmaceutical Press.

77
THOMPSON, M., ELLISON, S. L., & WOOD, R. (2002). Harmonized guidelines for single-laboratory
validation of methods of analysis (IUPAC Technical Report). Pure Appl. Chem., 74(5), 835–
855.

UBA. (2016). Facultad de farmacia y bioquímica. Recuperado el 18 de 02 de 2018, de

[Link]
ESPECTROFOTOMETR%C3%8DA_V4.[Link]

Universidad de Chihuahua. (2005). Espectrometría visible y ultravioleta. Chihuahua .

Volonté, M. G., & Quiroga, P. (2013). Analisis farmaceutico. Buenos Aires: Editorial de la
Universidad de La Plata.

Wang, J., Lu, J., Zhang, L., & Hu, Y. (2003). Determination of cetylpyridinium chloride and
tetracaine hydrochloride in buccal tablets by RP-HPLC. Journal of Pharmaceutical and
Biomedical Analysis, 381-386.

Waters Corporation. (1996). Photodiode Detector: Peak Purity. Milford.

Weimar, W. R., & Neims, A. H. (1975). PHYSICAL AND CHEMICAL PROPERTIES OF FLAVINS; BINDING
OF FLAVINS TO PROTEIN AND CONFORMATIONAL EFFECTS; BIOSYNTHESIS OF RIBOFLAVIN.
New York: Plenum Press.

Williams, S. (2002). Ghost peaks in reversed-phase gradient HPLC: a review and update. Journal of
Chromatography A, 1-11.

78