Lección 5.1.

Introducción al Módulo 5

Biología molecular. Bases y aplicaciones

Módulo 5. Aplicaciones de la biología
molecular en biomedicina

Sergi Maicas Prieto

Departamento de Microbiología y Ecología
Universitat de València
Bloque I. Bases de la Biología Molecular

• Módulo 1. Bases en Biología Molecular

• Módulo 2. Técnicas en Biología Molecular (I)
• Módulo 3. Técnicas en Biología Molecular (II)
• Módulo 4. Organismos modelo

Bloque II. Aplicaciones de la Biología Molecular

• Módulo 5. Biomedicina
• Módulo 6. Agricultura
• Módulo 7. Alimentación
• Módulo 8. Otras aplicaciones
¿Qué es la biomedicina? Definición, concepto y objetivos

• estudio de los aspectos biológicos de la medicina

• investigar los mecanismos
moleculares
bioquímicos
celulares
genéticos de las enfermedades humanas.
• La investigación biomédica se centra en distintas áreas temáticas:
• inmunología
• biología celular
• microbiología
• farmacología molecular
• biología molecular

• Objetivo principal: desarrollo de nuevos fármacos y de nuevas técnicas

para ayudar al tratamiento de enfermedades.
 Parasitología
• Los avances tecnológicos en biología molecular han supuesto una
revolución en el estudio de los parásitos a nivel subcelular

• Electroforesis
• Ómicas
• Secuenciación
• Hibridaciones
• PCR
 Citometría de flujo
• En lecciones precedentes de este curso (Módulos II y III) hemos visto algunas
de las técnicas más interesantes en Biología Molecular como:
• Secuenciación de genomas
• PCR
• CRISPR

• En este módulo veremos algunas aplicaciones de estas técnicas en el estudio

de diferentes aspectos relacionados con la biomedicina.
• En una de las lecciones profundizaremos en diferentes aplicaciones de la
citometría de flujo como:
• inmunofenotipado
• medida de la apoptosis celular
• capacidad fagocítica
 Cáncer
• Necesitamos comprender las bases
moleculares de las distintas patologías,
como las enfermedades infecciosas,
inmunes, neurodegenerativas o el
cáncer.

• Tendremos una lección dedicada a esta

última patología, en el que se describirá
• qué es el cáncer
• cuales son sus implicaciones
genéticas

• últimos avances en el diseño de

estrategias terapéuticas para
combatirlo
 Venómica

• Entre las enfermedades desatendidas la OMS incluye el envenenamiento

por mordedura de serpiente.
• El tratamiento efectivo, la administración de un suero antiofídico, es
conocido desde hace más de 120 años
• La escasa producción y distribución de antivenenos eficaces y a la vez
asequibles a las economías de los países afectados, no evita las más de
125.000 muertes anuales y un número mucho más elevado de víctimas
con secuelas físicas o psíquicas permanentes.
• Los venenos de los vipéridos poseen un arsenal de proteínas capaces de
degradar la matriz extracelular e interferir en la cascada de coagulación,
el sistema hemostático y la reparación de tejidos.
• En una de las lecciones de este módulo profundizaremos en esta área.
 Matriz extracelular

• Matriz extracelular: guía de la morfogénesis de tejidos y también en su

reparación y regeneración.

Técnicas de análisis: Microscopía de

Fuerza Atómica, sustratos generados
por microimpresión, sustratos de
diferente rigidez…
 Biología molecular. Bases y aplicaciones

• 5.2. Parasitología molecular

• 5.3. Aplicaciones de la citometría de flujo
• 5.4. Biología molecular del cáncer
• 5.5. Venómica
• 5.6. Adhesión celular y matriz extracelular

Imágenes tomadas de [Link], [Link] y [Link]

Lección 5.2. Parasitología molecular

Biología molecular. Bases y aplicaciones

Módulo 5. Aplicaciones de la biología
molecular en biomedicina
Antonio Marcilla Díaz
Departamento de Farmacia y Tecnología Farmacéutica y
Parasitología Universitat de València
Unidad Mixta de Endocrinología, Nutrición y Dietética
Clínica, Instituto de Investigación Sanitaria La Fe
 Introducción
Gracias a los grandes avances tecnológicos en biología
molecular, ha habido una revolución en el estudio de los
parásitos a nivel subcelular, originando nuevas oportunidades.

Aplicaciones en Parasitología:
• Amplificación DNA: Genética de parásitos a niveles
nunca antes imaginados, utilidad taxonómica, filogenética y
desarrollo de nuevos sistemas de diagnóstico.
• Estudio de rutas metabólicas: conocimientos básicos
sobre diferencias entre seres parásitos y de vida libre para
desarrollar nuevas herramientas terapéuticas.
• Técnicas –ómicas y vacunología reversa: identificación
de nuevas dianas de control (diagnóstico, vacunación y
tratamiento).
• Estudio de respuesta inmunitaria: nuevas visiones de
[Link]
relaciones parásito-hospedador, con aplicaciones clínicas, ab_science.html
no solo en enfermedades parasitarias.
Secuenciación de genomas de parásitos
El desarrollo de las técnicas de biología molecular, y en especial las de secuenciación
masiva (NGS) ha permitido la secuenciación de genomas de numerosos parásitos. Ello ha
sido una revolución en su estudio a nivel de:
• Estructura del genoma (habitualmente más reducidos que en sus hospedadores)
• Variación antigénica (genes localizados en zonas subteloméricas)

[Link]
• Estudios filogenéticos (conocer eventos evolutivos y 0.1

diferencias entre similares)

T. picturata
62
• Genómica de poblaciones (genómica + genética de 72 T. longipennis (Zacatecas)

poblaciones para conocer origen epidemias) 62 T. longipennis (Jalisco)

100 T. pallidipennis

T. phyllosoma
99
• Rutas metabólicas y dianas terapéuticas (información 100 T. mazzottii

genómica + bioquímica + farmacológica: identificar dianas T. dimidiata (Honduras)

100
T. dimidiata (Nicaragua)
específicas, y las bases de generación de resistencias a 49
47
T. dimidiata (Oaxaca)
100

tratamientos) 100
T. dimidiata (Veracruz)

D. maxima

T. infestans
100 64

P. megistus

100 R. stali var. oscura

100

R. stali var. clara

R. prolixus

P. tertius

Árbol filogenético vectores Enfermedad de Chagas

Técnicas moleculares de diagnóstico
M Fh Fg Fh Fg Fh Fg M

Con ÁCIDOS NUCLÉICOS:

• Hibridaciones (Southern blot, northern blot)

• PCR y variantes (RFLP, nested, multiplex; PCR a tiempo real)

• LAMP (Loop-mediated isothermal amplification)

Digest: no AvaII DraII
• Luminex®

[Link]
=10.1371/[Link].0166957
 Técnicas moleculares de diagnóstico
Con PROTEÍNAS:

• Técnicas inmunológicas:

Aglutinación

Ensayos inmunoenzimáticos (ELISA,

Inmunofluorescencia, etc.)

Electroforesis y Western Blotting

Ensayos rápidos
(inmunocromatografía)

• Luminex®
Técnicas moleculares en vacunas

Secuencias genomas
(Bases de datos)

Secuencias genes
Despacho
Predicciones:
(Por ortólogos
Localización subcelular
Estructura 3D
Genómica funcional Epítopos) Búsqueda bibliografía
(-ómicas) (genes anotados)

Candidatos vacunas

Clonaje, expresión y purificación

Test inmunogenicidad en animales

Ensayos clínicos
Laboratorio
 Técnicas moleculares en tratamientos

1. Identificar molécula diana

2. Caracterizarla por técnicas bioquímicas y DNA

recombinante (-ómicas)

3. Purificarla y cristalizarla

4. Diseño de inhibidores (in silico)

5. Ensayos in vitro e in vivo en animales

6. Ensayos clínicos

[Link]
_prizes/medicine/laureates/2015/
Perspectivas futuras
En los últimos años se están
estudiando moléculas y
estructuras:

-RNA pequeños (sRNA, como

microRNAs)
-Vesículas extracelulares

Aplicaciones en el control de enfermedades,

incluyendo parasitarias:
-Diagnóstico y pronóstico (biomarcadores): biopsia líquida
-Vacunación
-Nuevos tratamientos (vehículos específicos)
 Referencias bibliográficas y enlaces

Links:
Grupo de Matthew Berriman en Sanger Institute (UK), genomas de parásitos:
[Link]
Centers for Disease Control and Prevention (CDC), USA: [Link]
Sociedad Española de Parasitología (SOCEPA): [Link]
Jóvenes Investigadores en Parasitología: [Link]
(En Facebook: [Link]
Parasitolog%C3%ADaResearchers-in-Parasitology/179109838830580)
Geivex: [Link]
Rediex: [Link]

Videos:
Como hacerse Parasitólogo: [Link]
Step_Career_Guide.html
Serie “Parásitos Asesinos”: [Link]
Tropical Disease Research and training (TDR, OMS):
[Link]
Wellcome Trust (UK): [Link]
[Link]
[Link]
Lección 5.3. Aplicaciones de la citometría de
flujo

Biología molecular. Bases y aplicaciones

Módulo 5. Aplicaciones de la biología
molecular en biomedicina

María Luisa Gil

Departamento de Microbiología y Ecología
Estructura de Recerca Interdisciplinar en Biotecnologia i Biomedicina
(ERI BIOTECMED)
Universitat de València
Aplicaciones de la citometría de flujo

1. Inmunofenotipado (análisis por multifluorescencia)

2. Medida de la viabilidad celular

3. Estudio del ciclo celular

4. Medida de la apoptosis celular

5. Medida de la capacidad fagocítica

1. Inmunofenotipado

Inmunofenotipado: se trata de la identificación y cuantificación de distintas poblaciones

celulares en base a la expresión diferencial de marcadores de superficie o intracelulares.

Se realiza utilizando anticuerpos específicos frente a diferentes moléculas marcadoras

simultáneamente (cada anticuerpos está marcado con un fluorocromo diferente:
multifluorescencia).

Por inmunofenotipado podremos realizar:

• Identificación de poblaciones celulares desconocidas

• Identificación de poblaciones celulares conocidas
• Análisis de las posibles alteraciones en poblaciones celulares conocidas asociadas a
diferentes patologías (aplicaciones clínicas).
• Identificar diferentes estados de diferenciación y/o activación
• Analizar modificaciones en la expresión de los marcadores como consecuencia de
diferentes tratamientos, etc.
1. Inmunofenotipado

Poblaciones linfocitarias y sus marcadores de superficie

Tipo celular CD3 CD4 CD8 CD19 CD56

T colaborador + + - - -
T citotóxico + - + - -
B - - - + -
NK - - - - +
NKT + - - - +

Enfermedades inmunológicas primarias o secundarias, así como diferentes infecciones,

alteran la población linfocitaria
1. Inmunofenotipado

Principales aplicaciones clínicas

CANCER
Diagnostico de leucemias y otro tipo de tumores.
Monitorización tras tratamiento de leucemias

INMUNODEFICIENCIAS
Diagnóstico de inmunodeficiencias primarias.
Monitorización y diagnóstico de enfermos de SIDA.

TERAPIA CELULAR Y TRASPLANTE

Estudios de histocompatibilidad para elegir el donante adecuado para trasplantes de médula
ósea y órgano solido.
4. Medida de la viabilidad celular

Algunos fluorocromos con afinidad

por el DNA, como el yoduro de
propidio (PI) y el
7Aminoactinomicin-D (7-AAD) nos
permiten excluir células muertas o
cuantificar las células vivas, ya que
no son capaces de atravesar la
membrana plasmática, cuando la
célula está viable.
 3. Estudio del ciclo celular

Existen fluorocromos que tienen afinidad por el

DNA, y se unen a este de una forma G0/G1
proporcional (lineal), lo cual nos va a permitir S
M1 G2/M
cuantificarlo por citometría de flujo. M3
M2

Utilizando uno de estos fluorocromos, como el

ioduro de propidio, podemos cuantificar las
células que están en las diferentes etapas del
ciclo celular. Por citometría podemos distinguir
células con tres cantidades de DNA, que DNA content
corresponden a las etapas G1, S y G2/M En el ejemplo se muestra el análisis con
(células normales diploides en reposo, las que yoduro de propidio (antes del marcaje
están sintetizando activamente el DNA, y las hay que permeabilizar las células para
que están premitóticas o en mitosis, que el ioduro pueda entrar).
respectivamente).
4. Medida de la apoptosis celular

El marcaje doble con anexina-FITC y con yoduro de propidio,

permite identificar las células viables que no se tiñen con
anexina y excluyen el PI, las células en apoptosis temprana,
que se tiñen con anexina, pero siguen excluyendo el PI, y las
células en apoptosis tardía o necrosis, que se tiñen con PI
(ya que la membrana ya ha perdido su integridad).
 5. Medida de la capacidad fagocítica

Los protocolos consisten en co-cultivar los fagocitos

con los microorganismos ya marcados con algún
fluorocromo un tiempo determinado a 37ºC.

El analisis por citometría nos permite detectar el

porcentaje de células que han internalizado algún
microorganismo (porcentaje de fagocitosis).
Además, la intensidad de la fluorescencia también
CD14 CD15
nos indicará cuantos microorganismos ha ingerido
cada fagocito.

29,8 % 36,0 %
En el ejemplo se ensaya la capacidad fagocítica de FMI= 2276 FMI= 3005

monocitos y neutrofilos sanguíneos frente a

Staphylococcus aureus marcado con CFDA.
CFDA CFDA
Lección 5.4. Biología molecular del cáncer

Biología molecular. Bases y aplicaciones

Módulo 5. Aplicaciones de la biología
molecular en biomedicina

Rosa Farràs Rivera

Bases Moleculares de Patologías Humanas
Centro de Investigación Príncipe Felipe
¿Qué es el cáncer?

• El cáncer es un conjunto de enfermedades que

se caracterizan por el desarrollo de células
anormales, que se dividen sin detenerse
invadiendo a veces otros tejidos.
• Las células cancerosas pueden propagarse a
otras partes del cuerpo a través del sistema
sanguíneo y linfático.
Artwork by Jeanne Kelly. © 2004.

• Pueden definirse tantos tipos de cánceres como

enfermos, cada uno con sus alteraciones
moleculares y celulares específicas, pero de
forma sintética se agrupan por el tejido u órgano
en el que se ha originado

Artwork by Jeanne Kelly. © 2004.

El cáncer es una enfermedad genética
Proto-oncogenes
• El cáncer es causado por alteraciones en los genes
que controlan la división y el crecimiento de las
células.
G2 M
• Estos cambios génicos pueden causar que las Ciclo celular
(división y
células evadan los controles normales de proliferación)
S G1
crecimiento y adquieran ventajas selectivas que
favorecen su propagación.
• El fenotipo maligno es resultado de lesiones
genéticas de tipo dominante y/o recesivo que Genes supresores de
pueden ser heredadas o adquirirse durante la vida tumores
de una persona
El cáncer es una enfermedad genética

La lesión genética afecta principalmente a:

• protooncogenes
• genes supresores tumorales
• genes reguladores de la muerte celular programada
• genes de reparación del DNA

La lesión genética puede ser causada por:

• errores fortuitos de duplicación el DNA
• radiaciones
• rayos ultravioletas
• virus
• carcinógenos
Base molecular del cáncer: Acumulación de mutaciones

• El cáncer es un proceso de múltiples etapas resultante de la acumulación de

mutaciones somáticas (oncogenes, genes supresores, genes de susceptibilidad)
• El cáncer es un proceso de selección clonal, produciendo clones más agresivos,
dando lugar a la progresión tumoral

STUDYBLUE INC. © 2017

Protooncogenes y Oncogenes

• Los protooncogenes son reguladores fisiológicos

de la proliferación y diferenciación celular
• Las formas mutadas de los protooncogenes,
llamadas oncogenes tienen la capacidad de facilitar
el crecimiento celular en ausencia de señales
mitogénicas normales oncoproteína

• Las oncoproteínas son productos de los oncogenes

y están desprovistas de elementos reguladores
normales

Oncogenes
(según la función de la proteína codificada)

factores de crecimiento
receptores de factores de crecimiento y
hormonales
péptidos de señalización intracelular
factores de transcripción
Supresores de tumores

• Los genes supresores de tumores se encuentran en

las células normales y generalmente inhiben la
proliferación celular excesiva y regulan la apoptosis.
• Una mutación o una deleción de un gen supresor
tumoral, aumentará la probabilidad de que se
produzca un tumor, al perder su función.

supresores de tumores
(según la función de la proteína codificada)

factores de transcripción
inhibidores del ciclo celular
péptidos de señalización intracelular
receptores de la superficie celular
reguladores de las respuestas celulares al
daño del DNA
Redes de señalización alteradas

• Las vías de transducción de señales una

vez llegan al núcleo activan genes que
orquestan el avance ordenado de la célula
a través del ciclo celular
• Las proteínas codificadas por los
oncogenes y genes supresores son
componentes de redes de señalización
que controlan la proliferación, la
diferenciación o la muerte celular
• La mutación en estos genes ocasiona
redes de señalización alteradas que
pueden desencadenar el desarrollo
tumoral
Identidad del cáncer

Las células cancerosas adquieren un serie de

capacidades que determinan el fenotipo neoplásico:
• Autosuficiencia en las señales de crecimiento
• Falta de sensibilidad a las señales inhibidoras del
crecimiento
• Evasión de la muerte celular programada
• Potencial replicativo ilimitado
• Angiogénesis sostenida
• Promoción de invasión y metástasis tisular
• Alteración del metabolismo celular
• Microambiente inflamatorio
• Evasión de la destrucción mediada por el sistema
inmune
Alteraciones moleculares y nuevas terapias

• Las alteraciones moleculares en las células son detectables mucho antes que las
manifestaciones clínicas
• El conocimiento de las alteraciones moleculares permite el diseño de nuevas estrategias
terapéuticas

Cell 2011 144, 646-674DOI:

(10.1016/[Link].2011.02.013)
Lección 5.5. Venómica

Biología molecular. Bases y aplicaciones

Módulo 5. Aplicaciones de la biología
molecular en biomedicina

Jordi Durban i Sanchez

Laboratorio de Venómica Estructural y Funcional
Instituto de Biomedicina de València (CSIC)
¿Qué es la venómica?

Llamamos venómica a la estrategia combinada de técnicas de proteómica y

transcriptómica para la caracterización global de la composición cualitativa y cuantitativa
del veneno de las serpientes.

NTx_1
NTx_6
NTx_56.4% 2.3%
6.4% NTx_2
NTx_4 10.1%
11.8%

NTx_4
22.5% NTx_3
35.5%
¿Por qué el veneno de las serpientes?

Biology/Natural History Antivenoms/Serotherapy

Venoms

Pathophysiology of
Toxins as molecular tools
envenomings
¿Por qué el veneno de las serpientes? : Envenenamiento

Según datos de la OMS, la incidencia global de accidentes por mordedura de serpiente se

estima en 5 millones de casos anuales, de los cuales 2,5 millones resultan en
envenenamiento con más de 125,000 muertes.
¿Porqué el veneno de las serpientes? : Fármacos

Zamenis
longissimus

El Captopril ® es un fármaco inhibidor de la

enzima convertidora de angiotensina
prescrito para el tratamiento de la
hipertensión arterial, inicialmente aislado de
péptidos potenciadores de la bradiquinina
aislados de Bothrops jararaca.
Venómica: Técnicas proteómicas

Técnicas de separación de alta resolución: (lección 3.1)

• Electroforesis bidimensional
• Cromatografía

Técnicas de identificación y caracterización:

• Espectrometría de masas
Venómica: Técnicas proteómicas

Técnicas de separación de alta resolución: (lección 3.1)

• Electroforesis bidimensional
• Cromatografía Gradiente de pH

Técnicas de identificación y caracterización:

• Espectrometría de masas

Tamaño
La Electroforesis bidimensional es una técnica de separación de proteínas
basada en dos propiedades físicas de éstas: el punto iosoeléctrico y su tamaño.
Venómica: Técnicas proteómicas

Técnicas de separación de alta resolución: (lección 3.1)

• Electroforesis bidimensional
• Cromatografía

Técnicas de identificación y caracterización:

• Espectrometría de masas

La Cromatografía es un método físico de separación de los distintos

componentes de una mezcla compleja basada en la interacción de los distintos
componentes de ésta con otra substancia.
Venómica: Técnicas proteómicas

Técnicas de separación de alta resolución: (lección 3.1)

• Electroforesis bidimensional
• Cromatografía

Técnicas de identificación y caracterización:

• Espectrometría de masas

La Espectrometría de Masa es una técnica que permite determinar la masa de

moléculas por medio de la medida de la relación masa/carga (m/z) de
compuestos ionizados.
Venómica: Técnicas transcriptómicas

Técnicas de secuenciación: (lección 2.2)

SECUENCIACIÓN

RNA-Seq: estudio del

transcriptoma en una
muestra en un momento
determinado.
Bioinformática

TRANSCRIPTOMA
Venómica: Visión general

Separation and relative cuantification of the venom components

Venom collection
RP-HPLC separation SDS-PAGE (lección 3.2)

Tryptic digestion

Identification of the venom components

Mass profiling de novo MS/MS sequencing Transcriptomics

Relative abundance of
venom components
Referencias bibliográficas y enlaces

• Documental de la Global Snakebite Initiative acerca de la problemática del

envenenamiento por mordedura de serpiente:

[Link]

• Publicación descriptiva de la venómica y su aplicación en biomedicina:

[Link]
Lección 5.6. Adhesión celular y matriz
extracelular

Biología molecular. Bases y aplicaciones

Módulo 5. Aplicaciones de la biología
molecular en biomedicina

Mercedes Costell Rosselló

Departament de Bioquímica i Biologia Molecular
Universitat de València
 Las matrices extracelulares (ECM)

• Las ECM forman entramados moleculares cuya composición y rigidez determinan el

comportamiento celular

• La biomecánica estudia cómo las fuerzas físicas procedentes de la ECM afectan a la

función celular

Técnicas de análisis: Microscopía de

Fuerza Atómica, sustratos generados
por microimpresión, sustratos de
diferente rigidez…
Adhesión celular

• Las células se unen a las proteínas de la

Actin ECM mediante receptores especializados,
Paxillin
formando agrupaciones denominadas
Adhesiones Focales (FA).

• Estos receptores son de dos tipos

• Sindecanos
• Integrinas
Sindecanos

ECM
• Su dominio extracelular

HS lleva largas cadenas de

heparan sulfato (HS) que
Syndecan
unen proteínas de la ECM

• Transducen señales que

Célula modifican la expresión de
Actina genes y la estructura del

Miosina citoesqueleto de actina

P

Núcleo
 Integrinas

MECANOTRANSDUCCIÓN

ECM BIDIRECCIONAL

 Señalización
dentro‐fuera

P
Señalización
fuera-dentro
INACTIVA ACTIVA
Actina

• Son receptores diméricos (subunidades αβ). Su parte citosólica une proteína-quinasas,

proteínas adaptadoras y nucleadores de filamentos de actina.
• Tienen dos estados conformacionales: inactivo y activo. El control dinámico de estos dos
estados permite la migración celular y regular la forma de la célula
 La matriz extracelular es una red de proteoglicanos y
glicoproteínas
• Las propias células secretan y ensamblan esta red fibrilar
Fibronectin
• La ECM es un almacén de factores solubles (factores de
Actin
crecimiento, citocinas…) Paxillin
• Sus proteínas contienen dominios desplegables que les DAPI
confieren una gran elasticidad por las fuerzas de tracción de
las integrinas

GF
 La matriz extracelular dirige el comportamiento de la célula
mediante dos tipos de señales
• Señales Mecánicas derivadas de la mayor o menor rigidez de la matriz y de los
movimientos del citoesqueleto

• Señales Químicas que son liberadas o potenciadas por los movimientos elásticos de
la ECM

GF
P
P
La fuerza de las señales
P P
P GFR
mecánicas libera factores
P
P
solubles que contribuyen de
P
P forma cooperativa al proceso
P
de señalización celular
Conclusiones

• Las ECM son esenciales para guiar la morfogénesis y la regeneración de los tejidos

• Los cambios en la composición o rigidez de las ECM potencian distintas

enfermedades:

– Procesos de fibrosis, como la fibrosis pulmonar

– Tumores malignos sólidos, como el cáncer de mama

– La formación de placas de ateroma