CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA La columna se encuentra dentro del horno (corazón de

técnica de separación analítica CG).

Se introduce una muestra con gran cantidad de El detector está conectado a una pc.
analitos a la columna y van a interactuar con la fase Medidor de caudal - controla que el caudal de salida
estacionaria y/o con la fase móvil, dependiendo de esa sea el mismo que el de ingreso.
interacción y de sus propiedades los analitos van a
eluir en diferentes tiempos y se van a separar. Al  Gas portador o Carrier
finalizar se obtiene una respuesta del detector que Transporta los componentes de la muestra (FM), pero
identifica los picos del espectro según los analitos de no interacciona con la muestra (gas inerte) y también
trabajo. crea una matriz adecuada para el detector.
Para la aplicación cualitativa de esta técnica se eluye Suele ser H2, N2, He o mezcla de gases (Ar – metano). La
un analito en su forma pura y se obtiene su tiempo de elección dependerá de la FE y de las características del
retención, que después es comparado con el del detector a utilizar.
analito de trabajo y por coincidencia se lo puede ¿Qué tanto influye la elección del gas? En el caso de
identificar. Dependiendo del detector se puede que se puedan elegir varias opciones.
identificar un analito por un espectro característico de
masa, absorbancia, etc.
Para cuantificar un analito se usa el parámetro del área
debajo de su espectro; por cada analito se debe
realizar una curva de calibración.

CROMATOGRAFÍA DE GASES
gas – líquido gas – sólido
La fase móvil es un gas y la fase estacionaria es un
sólido o un líquido adsorbido sobre un soporte sólido.
Requisitos para este tipo de cromatografía:
1. Los gases, líquidos y sólidos deben ser
volátiles, (alta presión de vapor) sino se
Con He se obtiene buena resolución y un tiempo de
implementa una previa reacción de
corrida bajo. Con N2 el tiempo de corrida es mayor.
derivatización.
2. Deben ser estables a la temperatura de
La curva de Van Deemter sirve para encontrar el punto
trabajo, que suelen ser muy altas.
mínimo donde la altura del plato teórico es mínima y
3. No adsorbibles por el soporte sólido.
por ende se tiene mayor eficacia en la separación y se
4. Detectables a la salida.
necesita saber a qué velocidad se encuentra el punto
(asegura de trabajar en las mejores condiciones
CROMATÓGRAFO
posibles).

N2 hay un solo punto en 10 cm/s (mayores

restricciones), en cambio para He y H2 hay mayor
amplitud (intervalo) donde se puede encontrar el flujo
Elementos (punto) óptimo para el trabajo, pero el H2 es peligroso
Gas de arrastre - fase móvil (FM) y el He es caro.
Manómetro - regular la presión
Inyector- lugar donde se inyecta la muestra
 Cuando se inyecta la muestra ingresa a la columna, que
se encuentra ubicada en el horno.
 Inyector El horno controla la temperatura a la que se lleva a
La inyección puede ser: cabo la cromatografía.
Manual – la muestra se introduce mediante una
jeringa Hamilton de punta biselada. K: factor de retención del analito
Automática - vial donde se introduce directamente la (Es inversamente proporcional a la temperatura) si
muestra. Mayor precisión y rapidez aumenta T disminuye k y se puede sacar al analito más
rápido, sin embargo, hay que tener en cuenta de que
Las muestras pueden ser sólidas, liquidas o gaseosas, se puede ir con el frente de fase móvil. No todos los
pero ¿cómo levanto un sólido con la jeringa? Se toma analitos se comportan igual, depende de la naturaleza
el espacio de cabeza (headspace) entre la muestra y la del analito y de la matriz de trabajo
tapa del recipiente (gas - analito muy volátil).
Se puede trabajar a T constante (isotérmico).
Purga y trampa: cuando el analito está en baja
concentración en la muestra, antes de pasarlo por el
cromatógrafo se necesita concentrarlo, por lo que se
arma un dispositivo donde se atrapa al analito, se
espera determinado tiempo a que se acumule y luego
se realiza la inyección.

Dependiendo de la cantidad presente del analito en la

muestra se trabaja con modo split o splitless
Split - de la cantidad de muestra que ingresa, una
parte va a la columna y otra a desecho. Sirve para
analitos de alta concentración en la muestra, para no
saturar la columna.
Splitless - Todo lo que ingresa va a al a columna. Se Al aumentar la T, se disminuye el tiempo de retención.
trabaja de este modo cuando el analito está en baja Pero se debe tener en cuenta de que hay casos que al
concentración en la muestra (concentraciones traza). aumentar T se afectan los perfiles y no se pueden
resolver los analitos.
El verdadero valor de temperatura de trabajo del
inyector se puede determinar cuando se conozcan los
analitos que debemos separa: el inyector debe estar
por 50 °C por encima del punto de ebullición del
componente menos volátil de la muestra (el que más
tardará en llegar a su punto de ebullición). De esa
manera se asegura de que todos los analitos ingresen a
la columna en fase vapor.
El inyector está sellado por una junta de goma o
septum que dura 100 inyecciones aprox., la punta
biselada de la jeringa lo va desgastando y puede llegar
a ser ineficiente en cierto número de inyecciones por
lo que se debe cambiar regularmente (si la separación También se puede trabajar con temperatura
es ineficiente, se debe prestar atención al desgaste del programada, es decir que durante ciertos periodos de
septum como primera medida). tiempo el horno está a una determinada temperatura y
luego a otra, de esta manera se proporcionan las
 Horno mejores condiciones para cada analito.
 Columna
Es la única parte del equipo que interacciona con el
analito y es corazón del equipo. No interacciona con el
gas portador.

Son más largas y con partículas de menor dd que las de

las empacadas (factores que intervienen directamente
en la separación) y hacen que la separación sea más
efectiva (tiempos más cortos), pero son más frágiles
porque normalmente pierden 5 cm de cada extremo
Columnas rellenas o empacadas en cada cambio.
dd de partícula = 50 – 250 μm
Longitud = 1 – 5 m

Columnas capilares
D.I. = 0,1 - 0,25 mm (megabore = 0,53 mm)
D.E. = 0,26 – 0,32 mm
Longitud = 15 – 100 m
 Rellenos de columna Conductividad Compuestos que 0,5 pg C/s
1. No polar - analito no polar eléctrica (Hall) contienen 2 pg S/s
halógenos, S o N. 4 pg N/s
Poli (5%-difenil-95%dimetilsiloxano)-DB-5
Fotoionización Compuestos 2 pg C/s
ionizables por
radiación UV.
Transformada Compuestos 0,5 – 40 ng
de Fourier IR orgánicos

Los 1ros tres son los más usados y están insertos en el

2. Semipolar - aumenta el % de fenil cromatógrafo (es decir, no acoplados). El más sensible
Poli(35%-difenil-65%-dimetilsiloxano)-DB-35 es el de captura electrónica, pero solo sirve para
compuestos halogenados (si o si se necesita que haya
un halógeno presente en el analito).

1. Detector de ionización en llama (FID)

3. Polar – analito polar

Poli(etilglicol)-DB-wax con gran % de -OH

SGE carbowax, siendo polar pero algunos de los -OH se

reemplazan por N, dándole mayor selectividad a la
separación.

- Es sensible a compuestos orgánicos (excepto a ácido

fórmico y metano).
- Diferencia entre un compuesto y otro de acuerdo al
nº de átomos en la cadena (aplicable a hidrocarburos),
Para fines específicos están las FE para separar elevada sensibilidad.
compuestos quirales o enantiómeros. - Rango dinámico lineal excepcionalmente alto
- Bajo ruido (cuanto menos ruido haya, se tiene vamos
 Detector más señal y más sensibilidad).
Los analitos provienen de la columna y llegan al - Temperatura límite de 400 °C.
detector. Un detector ideal tiene buena estabilidad y - Es destructivo de muestra. Se necesita de dos tubos
reproducibilidad, respuesta lineal en amplio intervalo de gas aparte del tubo de gas portador, uno de aire y
de C, intervalo de T desde T amb a 400 °C, tiempo de uno de H2 para poder prender la llama en el sistema de
respuesta corto e independiente del flujo, fácil, detección.
empleo, sensibilidad adecuada (10-8 – 10-15 g/s), no
deben ser destructivos. 2. Conductividad térmica

Tipo Muestras Límite de

aplicables detección
Conductividad Detector universal 500 pg/mL
térmica
Ionización de llama Hidrocarburos 0,2 pg/s
cCaptura electrónica Compuestos 5 fg/s
halogenados
Espectrómetro Ajustable a 0,25 – 100 pg
de masas cualquier especie
Termoiónico Compuestos con N 5 fg/s
y P.
- Permite el análisis de gases inorgánicos y orgánicos: 225 °C (3H), dependiendo del contenido de la muestra
O2, N2, CO, CO2, H2S, NO, hidrocarburos livianos. se determinará la T límite de trabajo.
- Respuesta lineal en un amplio intervalo. - No es destructivo
- Fácil de utilizar - Requiere licencia, muestras secas y electrómetro.
- No destructivo
- Casi exclusivo para columnas empacadas, no se CROMATOGRAFÍA LIQUIDA
emplea con columnas capilares por su largo. Este La FM que interviene en la separación es líquida y en
detector en particular se ve afectado por variaciones este caso SI interacciona con el analito. Ambos analitos
de caudal (al ser más largo el camino que debe interaccionan con el analito y influyen en el proceso de
recorrer la muestra, habrá más variaciones), así como separación. Hay muchas más posibilidades de
de T. interacción de la fase estacionaria con el analito que
- Es de baja sensibilidad 10-6 – 10-8 g). en CG.
- Temperatura limite 400 °C.
- Tiene respuesta universal, siempre que se sepa que
analito se coloca se va a poder cuantificar.

Cromatografía de adsorción
La FE es sólida y el analito interacciona con sitios
activos de la superficie de la FE. Intervienen fuerzas de
Van der Waals y enlaces de hidrogeno.
3. Detector de captura electrónica

Los rellenos más comunes de la FE son la sílica y

alúmina (en columnas que van en un instrumento, los
demás rellenos se usan para cromatografía en placa).

- Es sensible a compuestos con átomos

electronegativos (haluros de alquino, organometálicos
y organofosforados).
- Es de elevada sensibilidad
- Respuesta lineal limitada, si o si requiere la presencia
Se prefiere no trabajar con buffer porque las sales
de átomos electronegativos en los compuestos que se
pueden precipitar en alguna parte del instrumento y
quieran cuantificar.
dañarlo.
- En la fuente del detector puede haber un isótopo de
Ni o de H (tritio). Temperatura límite de 350°C ( 63Ni) y
Cromatografía de reparto
Es la más empleada. La FE es líquida (líquido adsorbido
o ligado a un soporte solido mediante una unión
covalente).
El analito puede interaccionar mucho con la FE y
quedar retenido o puede interaccionar más con la FM
(diferente solubilidad del analito en FM y FE) y así se
obtienen diferentes velocidades de elución y
Dependiendo de la fase de trabajo y del
diferentes tiempos que dependen de dicha interacción.
comportamiento del analito, se podría modificar la FM
Intervienen fuerzas intermoleculares (tipos de
para hacer que eluyan más o menos rápido los analitos
interacciones que se pueden dar entre en analito y las
 se modifica la fuerza elutrópica de la FM.
fases) que dependen de la polaridad del analito y de
ambas fases.

Hay dos tipos de cromatografía de reparto:

Fase normal – FE polar (FM menos polar que FE)
La FE es más polar que FM y que la muestra. La FM
debe ser si o si menor polar que FE para que el analito
tenga alternativas de elección. Intervienen fuerzas de
Van der Waals (dipolo – dipolo inducido, dipolo –
dipolo) y enlaces de hidrogeno (fuerzas polares muy
fuertes).
Algunas FM de baja polaridad pueden ser etil éter,
cloroformo o hexano.
Los solutos poco polares eluyen primero.
La FE suele ser solo de sílica pero también puede tener
una base de sílica unida a un grupo -R polar (ciano, ¿Cuándo se puede necesitar que se realice esta
diol, amino, dimetilamino), esto genera mayor modificación? Por ejemplo, cuando se trabaja en fase
especificidad y selectividad en la separación. normal y hay un analito muy retenido en la columna, la
fase totalmente apolar nunca lo va a eluir, por lo que
se debería disminuir la fuerza elutrópica para poder
hacerlo, esto se logra aumentando la polaridad de la
FM. Si trabajo en fase reversa y tengo la misma
situación de un analito retenido (en este caso un
analito apolar), se debe aumentar la fuerza elutrópica,
y para ellos se debe disminuir la polaridad de la FM.

Fase reversa – FE apolar (FM polar) Elección de fases en cromatografía de reparto

La FE es menos polar que la FM y la muestra. Se elige la polaridad de la FE similar a la polaridad del
Intervienen interacciones entre FE – soluto – solventes analito, y para eluir se selecciona una FM de polaridad
no polares de naturaleza dispersiva. Ocurre atracción considerablemente distinta, pero que disuelva la
entre dipolos instantáneos. Resultan de fluctuaciones muestra.
de carga (fuerzas de dispersión de London, Factor de retención: como criterio de trabajo, si se
interacciones no polares, no iónicas). tiene entre 2 o 3 componentes el factor de retención
Algunos ejemplos de FM pueden ser metanol, debe ser k = 2 – 5, esto para asegurar una buena
acetonitrilo o mezclas de ellos con agua o buffers. retención y como consecuencia una buena elución. Si
La base suele ser de sílica pero se le unen grupos se tienen más componentes en la muestra se permite k
-R apolares como una cadena de 6, 8 o 18 átomos de C, = 20.
una cadena hidrocarbonada cíclica como el fenil.
Los solutos de alta polaridad eluyen primero.
 fuertes (alta T, agentes oxidantes fuertes o
Aplicaciones radiación).

Fase móvil
 Ácidos y bases inorgánicos/orgánicos: KOH, NaOH,
HClO4, HCl, ácido tartárico, etc.
 Sales con o sin solventes orgánicos: Na2CO3,
NaHCO3, NaClO4.

Resinas de intercambio iónico

Intercambiador Grupo
Cromatografía de intercambio iónico
Catiónico: portador de
Se produce un intercambio reversible entre iones de la
grupos con carga (-) que
muestra y la FE. Intervienen fuerzas electroestáticas. unen cationes
Es necesario que el analito este cargado para que reversiblemente
interaccione con un relleno de resina, si el analito es Ácido fuerte Sulfónico
(–) se usa un intercambiador que exponga en su
superficie cargas (+). Las sustancias a separar se unen a
la FE y quedan retenidas por lo que deben eluir para
Ácido débil Carboxilo -COOH
llegar al detector, esto se realiza haciendo eluciones Aniónico: portador de
con buffers de distintos pH o de diferente fuerza iónica grupos con carga (+) que
(los componentes de la FM compiten con los analitos unen aniones
por los sitios activos de la FE). reversiblemente.
Base fuerte Amonio cuaternario

Base débil Amonio terciario

Aplicaciones
El detector más utilizado con este tipo de  Tratamiento de aguas: ablandamiento,
cromatografía es el conductímetro. Se usa mucho en la descarbonatación, desmineralización, obtención de
separación de biomoléculas. agua ultra pura y potable, tratamiento para la
producción de cerveza, refrescos, etc.
Fase estacionaria  Farmacia: extracción y purificación de antibióticos,
 Resinas de intercambio iónico: se usan para etc.
especies cargadas de bajo peso molecular (pm <  Minería: eliminación de acidez y metales en bebidas
500) que penetran en los pequeños poros de la y jugos de frutas, recuperación de polifenoles
resina. (antocianinas en mostos de uva), desmineralización
 Geles de intercambio iónico: se usan para de soluciones de ácido cítrico (conservante), de
moléculas más grandes (proteínas, aminoácidos, sorbitol (edulcorante y emoliente), de gelatina,
nucleótidos, azúcares y polialcoholes). extracción de aminoácidos esenciales de los caldos
 Intercambiadores iónicos inorgánicos: `son óxidos de fermentación.
hidratados de Zr, Ti, Sn y W. Se usan en  Industria química: recuperación de metales valiosos
separaciones que exigen condiciones químicas o eliminación de metales indeseables en talleres de
galvanoplastia, eliminación de ácido sulfúrico y de
 peróxido de hidrógeno (eliminación de derivados de
la antraquinona y de trazas metálicas,
principalmente Fe), testeado cuantitativo de los
electrolitos y aditivos patentados de los baños de
electrochapado.
 Purificación/separación de biomoléculas:
proteínas, nucleótidos, aminoácidos, azúcares, etc. Características de la FE (inerte – tamiz o filtro):
Tamaño de partícula y poro uniforme, estable,
resistente, derivados de sílice o rellenos poliméricos.

Características de la FM (no interactiva):

Disolver la muestra, estable, poco viscosa, solventes
acuosos u orgánicos.

Detectores empleados:
Índice de refracción y espectrofotométrico.

Sistema de elución:
Cromatografía de exclusión molecular
Por gravedad o HPLC (alta presión).
El criterio de separación es en base a la forma y el
tamaño del analito. Las moléculas de mayor tamaño no
Aplicaciones
entran en los poros de las partículas de gel y eluyen
 Separación y purificación de compuestos de alto
primero.
pm.
 Análisis y cuantificación de polímeros sintéticos
(fuerza, resistencia y diseño del polímero).
 Determinación de pesos moleculares de polímeros.
 Determinación de las estructuras terciarias y
cuaternarias de las proteínas purificadas.

Las moléculas de tamaño pequeño difunden a través

de los poros de las partículas de gel y por ello son
retardadas en su paso por la columna.
Si el gel tiene elevado contenido acuoso el proceso se
llama filtración.

Cromatografía de afinidad
Utiliza la alta especificidad de las reacciones biológicas
Si la FE es un contenido orgánico y la FM son solventes del tipo antígeno-anticuerpo, hormona-receptor.
orgánicos se llama permeación en gel. La FE está constituida por un ligando unido a un
soporte inerte. Cuando la muestra atraviesa la
columna, solo interacciona con el ligando y se retine
solo el analito capaz de reaccionar con dicho ligando,
el resto de la muestra eluye. Al finalizar la separación
es necesario que el analito ligado eluyan, para ello se
trabaja con alguna que reacción que permita su
separación.

También sirve para proteínas que puedan

interaccionar con ligando específicos.