“Año de la recuperación y consolidación de la
economía peruana”
UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA AMAZONIA PERUANA
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS
Escuela Profesional de Ciencias Biológicas
INFORME DE LABORATORIO: TINCIÓN DE MICROORGANISMOS
CURSO: Biología celular y del desarrollo
DOCENTE: RODRIGUEZ MASHACURI HICLER NAPOLEÓN
ESTUDIANTES:
Prentice Vigo Andrea Alexandra
Silva Hernández Tatiana Julisa
Perez Huamán Kristell Kate
Santillán Arévalo Job Ernesto
Gómez Rodriguez George Wayan
Paima Roque Raquel Esther
Pinedo Dávila Sonny Santiago
Muñoz Córdova Delmer
Ahuanari Ayapi Jill Dana
Rucoba Inuma Angel Josué
Huanuiri Villanuev Kiara Zashenka
Apaza Ahuanari Paula Ninfa
IQUITOS – PERU
2025
1. OBJETIVOS
Objetivo general:
Aplicar correctamente la técnica de tinción de Gram para diferenciar bacterias Gram
positivas y Gram negativas, reconociendo su morfología y características estructurales
mediante la observación microscópica.
Objetivos específicos:
1. Identificar y emplear adecuadamente los materiales y reactivos necesarios para la
realización de la tinción de Gram.
2. Elaborar correctamente un frotis bacteriano utilizando cepas de Escherichia coli,
Klebsiella sp. y Staphylococcus sp. siguiendo las normas de bioseguridad.
3. Ejecutar paso a paso la técnica de coloración de Gram, aplicando los colorantes en el
orden y tiempos establecidos por el procedimiento estándar.
4. Observar al microscopio las características morfológicas y tintoriales de las bacterias
teñidas, clasificándolas según su tipo de pared celular.
5. Analizar los resultados obtenidos, interpretando la respuesta diferencial a los colorantes
como evidencia para la identificación bacteriana.
2. MATERIALES Y REACTIVOS
MATERIALES
- Láminas porta y cubre objeto
- Agua destilada.
- Mechero.
- Cepas de E. coli, Staphylococcus sp. y Klebsiella sp.
- Asa estéril desechable.
- Pinzas de madera
- Pisceta
REACTIVOS
- Cristal violeta
- Yodo
- Alcohol acetona
- Safranina
- Rojo de Congo
- Azul de lactofenol
- Aceite de inmersión
- Colorante de Maneval.
- Azul de metileno
3. INTRODUCCIÓN.
Las técnicas de tinción microscópica son herramientas fundamentales en microbiología para la
visualización, identificación y clasificación de los microorganismos. Estas técnicas utilizan
colorantes químicos que se fijan selectivamente a estructuras celulares, permitiendo diferenciar
entre tipos de microorganismos o resaltar componentes específicos como la pared celular,
cápsulas, esporas o núcleos. Su aplicación es esencial tanto en el diagnóstico clínico como en la
investigación científica, ya que facilitan el estudio morfológico de bacterias, hongos y
protozoarios.
Entre las tinciones diferenciales, la tinción de Gram destaca por ser la más utilizada
universalmente debido a su eficiencia, bajo costo y capacidad de clasificación bacteriana.
Esta técnica, desarrollada por Hans Christian Gram en 1884, divide a las bacterias en dos
grupos: Gram positivas y Gram negativas, en función de la composición y grosor de su pared
celular. Las Gram positivas presentan una capa gruesa de peptidoglicano que retiene el
colorante cristal violeta tras la decoloración, mientras que las Gram negativas, con una pared
más delgada y una membrana externa rica en lipopolisacáridos, no lo retienen y se tiñen con
safranina.
En la presente práctica de laboratorio, se aplicó únicamente la tinción de Gram con base en el
procedimiento descrito en el POE institucional, siguiendo pasos rigurosos: preparación del
frotis, aplicación de cristal violeta, fijación con lugol, decoloración con alcohol y tinción de
contraste con safranina. Este procedimiento permitió observar bajo el microscopio bacterias con
morfología bacilar y cocos, algunas teñidas de morado (Gram positivas) y otras de rosa (Gram
negativas), según su afinidad a los colorantes empleados.
El desarrollo de esta práctica permitió a los estudiantes comprender los fundamentos
fisicoquímicos de la técnica, afianzar el uso correcto del microscopio y reforzar los criterios
diagnósticos iniciales empleados en microbiología clínica, fomentando competencias técnicas y
de bioseguridad indispensables en el laboratorio.
4. MARCO TEÓRICO: COLORACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE
MICROORGANISMOS
La coloración de microorganismos es una técnica fundamental en microbiología que permite
visualizar y diferenciar bacterias, hongos y protozoarios bajo el microscopio. Estas técnicas se
basan en el uso de colorantes que interactúan con estructuras celulares específicas, facilitando la
identificación y clasificación de los microorganismos. Este marco teórico explora los principios,
métodos y aplicaciones de las técnicas de coloración descritas en el documento.
TECNICAS DE COLORACION BACTERIANA
Las tinciones en microbiología son las primeras herramientas que se utilizan en el laboratorio
para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas. Desde hace más de un siglo han ayudado a
resolver problemas de etiología microbiana. Hay una gran variedad de tinciones, que se han ido
desarrollando para la detección de los diferentes agentes infecciosos.(1)
Dentro de las coloraciones bacterianas las más empleadas son:
- Coloración de Gram:
Definición y Utilidad
Tinción diferencial que clasifica bacterias en Gram positivas (azul/morado) y Gram negativas
(rosa/rojo). Desarrollada por Hans Christian Gram (1884).
Aplicaciones: Identificación rápida de bacterias en muestras clínicas (ej.: líquidos estériles,
abscesos). Diferenciación de microorganismos causantes de infecciones.
Base Científica
- Gram positivas: Pared celular gruesa de peptidoglicano (retiene el complejo cristal
violeta-yodo). Sin membrana externa.
- Gram negativas: Pared celular delgada de peptidoglicano + membrana externa (soluble
en alcohol-acetona). No retienen el colorante primario (se tiñen con safranina).
Procedimiento
- Cristal violeta (colorante primario).
- Lugol (mordiente, forma complejo cristal violeta-yodo).
- Alcohol-acetona (decapante: cierra poros en Gram+, disuelve membrana en Gram–).
- Safranina (contratinción para Gram–).
Limitaciones
No aplica para bacterias sin pared celular (ej.: Micoplasma) o con pared modificada (ej.:
Micobacterias).
Gram variable: Algunas bacterias cambian de tinción por factores ambientales (pH, nutrientes).
(1)
- Coloración de Wright:
Definición y Origen
Tinción policromática que diferencia elementos celulares en sangre y médula ósea. Desarrollada
por James Homer Wright (1902), basada en la tinción de Romanowsky.
Usos principales:
- Diagnóstico de parásitos (Plasmodium spp., Leishmania, Trypanosoma cruzi).
- Identificación de hongos (Histoplasma capsulatum) y células sanguíneas.
Componentes y Mecanismo
- Reactivo: Mezcla de eosina Y (colorante ácido, tiñe citoplasma/eritrocitos de rosa/rojo)
y azul de metileno/azur B (colorante básico, tiñe núcleos de azul/morado).
- Efecto Romanowsky: Interacción entre eosina y complejo ADN-azul de metileno,
generando contraste (núcleos púrpuras, citoplasma rosa, gránulos neutrofílicos púrpura).
Factores que Afectan la Tinción
- pH: Variaciones alteran la afinidad ácido-base, modificando la intensidad del color.
- Tiempo y concentración de los colorantes.
Resultados Típicos
Núcleos: Azul/morado.
Citoplasma: Rosa/anaranjado.
Eritrocitos: Rojo intenso.
Parásitos: Azul dentro de eritrocitos (ej.: Plasmodium).(1)
- Coloración de Maneval
Objetivo y Contexto
Técnica especializada para visualizar cápsulas bacterianas, estructuras difíciles de teñir con
métodos convencionales (ej.: tinción de Gram). Desarrollada por López y Barajas (1982).
Importancia de las Cápsulas Bacterianas
- Composición: Principalmente polisacáridos (ej.: Klebsiella pneumoniae) o polipeptidos
(ej.: Bacillus con ácido D-glutámico).
- Función:
Virulencia: Protege a bacterias de la fagocitosis (ej.: Streptococcus pneumoniae).
Morfología colonial: Colonias lisas/mucoides (con cápsula) vs. rugosas (sin cápsula).
Método de Tinción Negativa
Principio: Las cápsulas no retienen colorantes convencionales y se disuelven con fijación
térmica.
Colorantes usados:
- Maneval A (Rojo Congo): Indicador de pH (rojo en pH básico, rosa en pH ácido 3.0–
5.2).
- Maneval B (Fucsina ácida): Contrasta el fondo.
Resultado: La cápsula aparece como un halo transparente alrededor de la bacteria (teñida de
rojo/rosa) contra un fondo oscuro.
Limitaciones
Requiere técnicas de contraste (negativas) debido a la naturaleza hidrofílica y no adherente de
las cápsulas.(2)
- Coloración de Ziehl Neelsen
Objetivo: Técnica especial para teñir micobacterias (ej.: Mycobacterium tuberculosis), cuya
pared celular cerosa resiste colorantes convencionales.
Fundamento Científico
Composición única de la pared celular:
- Ácidos micólicos: Hidroxiácidos de alto peso molecular (exclusivos de micobacterias,
nocardias y corinebacterias).
- Arabinogalactano: Polímero que une el peptidoglicano con los ácidos micólicos,
formando una capa lipofílica externa.
- Resistencia a decoloración: Los complejos carbolfucsina-ácidos micólicos resisten
solventes fuertes (alcohol ácido).
Procedimiento
- Colorante primario: Carbolfucsina (afinidad por ácidos micólicos).
- Se aplica con calor (mechero Bunsen) para fundir ceras y permitir la penetración del
colorante.
- Decoloración: Alcohol ácido (elimina el colorante no fijado, excepto en micobacterias).
- Contratinción: Azul de metileno (tiñe células no ácido-alcohol resistentes).
Resultados
Micobacterias: Rojo brillante (por retención de carbolfucsina).
Otras células/tejidos: Azul (teñidos por el azul de metileno).
Alta especificidad para micobacterias debido a su pared celular única.(3)
- Coloración de Leifson
Objetivo: Visualizar flagelos bacterianos (estructuras finas de ~0.01 micrones, invisibles al
microscopio óptico sin tinción). Clasificar bacterias según la morfología y disposición de sus
flagelos (ej.: Bacillus).
Fundamento
Engrosamiento químico:
- Ácido tánico: Aumenta el grosor de los flagelos para hacerlos visibles.
- Colorante de Leifson: Tiñe los flagelos engrosados (contiene fucsina básica).
- Diferencia con eucariotas: Los flagelos eucariotas son más gruesos y no requieren este
método.
Componentes del Colorante
- Solución A: Fucsina básica + etanol (colorante principal).
- Solución B: Ácido tánico + agua destilada (mordiente).
- Solución C: Cloruro sódico + agua destilada (estabilizador).
- Proporción: Mezcla en partes iguales (33.3% cada solución).
Procedimiento
Preparación de la muestra:
- Extender una gota de muestra en un círculo sobre un portaobjetos limpio.
- Fijación al aire (evitar calor para no dañar flagelos).
Tinción:
- Aplicar colorante de Leifson (10-15 minutos).
- Lavar con agua y secar.
Observación: Microscopía óptica.
Resultados
Flagelos teñidos: Visible como estructuras filamentosas alrededor de la bacteria.
Aplicaciones: Identificación de especies bacterianas (ej.: patógenos móviles).(4)
5. METODOLOGÍA
En esta práctica se llevó a cabo la coloración e identificación de microorganismos, la cual
realizamos la técnica de coloración de Gram, que es una de las más importantes para la
identificación de bacterias, esto permite poder diferenciarlas en Gram positivas y en Gram
negativas según cómo reacciona su pared a los colorantes.
Para esta ocasión utilizamos un frotis bacteriano que como el Escherichia coli y Klebsiella sp
sobre una lámina portaobjetos usando un asa estéril. Extendimos bien la muestra, lo dejamos
secar al aire y luego lo fijamos pasándolo al ras de la llama del mechero. Después cubrimos toda
la muestra con cristal violeta durante 1 minuto, esto permitió que el colorante pueda penetrar en
las células. Luego de ello enjuagamos con agua destilada y aplicamos el lugol por un minuto,
esto actúa como mordiente para que el colorante sea fijado. Volvimos a enjuagar la muestra con
agua y después se añadió alcohol-acetona gota a gota con la lámina inclinada para decolorar.
Después se aplicó safranina por un minuto, como colorante de contraste, este paso es el que tiñe
las bacterias que perdieron el color violeta durante la decoloración y por ello es uno de los pasos
más importantes. Finalmente se lavó el exceso de colorante dejando la lámina secar al ambiente
para observarlo bajo el microscopio.
6. RESULTADOS
Como se muestra en las imágenes, observamos bacterias Gram positivas, porque tienen un color
violeta, esto se debe a que la pared celular es más gruesa que las negativas y con una capa de
peptidoglicano más densa que permite retener el colorante primario (cristal violeta) durante el
proceso de tinción de Gram.
7. CONCLUSIONES
Através de esta práctica, pudimos comprender mejor la importancia de la coloración de Gram
como una herramienta fundamental para la identificación bacteriana. Al realizar el
procedimiento paso a paso, desde la preparación del frotis hasta la observación final al
microscopio, logramos diferenciar con claridad las bacterias Gram positivas de las Gram
negativas, entendiendo cómo reacciona su pared celular frente a los colorantes utilizados. Me
pareció muy interesante ver cómo, mediante simples pasos como la fijación, el uso del
mordiente, la decoloración y el contraste, se pueden obtener resultados tan precisos y útiles para
el estudio microbiológico. Esta experiencia me ayudó no solo a reforzar lo aprendido en clase,
sino también a desarrollar más seguridad en el manejo de técnicas de laboratorio y del
microscopio, lo cual considero muy valioso para nuestro aprendizaje y formación profesional.
8. REFERENCIAS.
1. López-jácome LE, Hernández-durán M, Colín-castro CA, Ortega-peña S, Cerón-gonzález G,
Franco-cendejas R. Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología. 2014;3.
2. Al M. TINCIÓN DE GRAM GR AM Y DE MANEVAL.
3. Meléndez RCG, Sánchez MO. Laboratorio de Microbiología :
4. Tébar I, Morgado L. Tinción de Leifson.
9. ANEXOS
Anexo 1: Procedimiento de la Técnica de Coloración de Gram
La técnica de coloración de Gram permite diferenciar las bacterias en dos grandes grupos: Gram
positivas y Gram negativas, según las características de su pared celular. El procedimiento
estándar es el siguiente:
1. Preparar un frotis de la muestra, dejar secar y pasar ligeramente por la llama del mechero para
fijar la muestra.
2. Cubrir la extensión con el cristal violeta por 1 minuto y lavar con agua destilada.
3. Aplicar el yodo de Gram y dejarlo reaccionar por 1 minuto y lavar con agua destilada.
4. Agregar la solución decolorante gota a gota con el porta inclinado cuando ya no haya arrastre
de colorante, lavar con agua destilada para detener la acción decolorante.
[Link] el porta con la solución de safranina de Gram por 20 segundos.
[Link] con agua destilada el exceso de colorante, secar al aire y dejar secar al ambiente.
7. Observar en objetivo de inmersión.
Anexo 2: Resultados Esperados en la Coloración de Gram
Tipo de Bacteria Color Observado Interpretación
Gram positiva Morado / Violeta Pared celular gruesa de
peptidoglicano retiene el
cristal violeta
Gram negativa Rosado / Rojo Pared delgada, no retiene el
cristal violeta; se tiñe con
safranina
Anexo 3: Errores Comunes en la Coloración de Gram
• Decoloración excesiva: Puede hacer que bacterias Gram positivas se vean como Gram
negativas.
• Decoloración insuficiente: Bacterias Gram negativas podrían parecer Gram positivas.
• Frotis muy grueso: Dificulta la tinción uniforme y la observación clara.
• Portaobjetos mal fijado: Puede causar desprendimiento del frotis durante el lavado.
Anexos 4: Fotos tomadas en el laboratorio