[Link].
es 2
Técnicas de separación celular
Estas técnicas permiten la preparación e identificación de poblaciones
celulares.
La más utilizada actualmente es la citometría de flujo:
Permite separar e identificar las diferentes poblaciones celulares y
conocer su estado de activación y funcionalidad midiendo la
expresión de diferentes marcadores.
Existen técnicas alternativas, utilizadas por laboratorios que no
disponen de citómetro de flujo.
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La citometría de flujo
La citometría de flujo es una técnica de análisis de poblaciones celulares en
suspensión.
La principal aplicación es la caracterización de subpoblaciones de
linfocitos B.
Tiene un alto poder resolutivo.
Permite analizar grandes cantidades de células de un modo
mutiparamétrico.
Permite realizar estudios funcionales con distintas poblaciones
celulares.
Inconveniente: necesita células en suspensión.
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La citometría de flujo
El fundamento de la citometría de flujo
Las células en suspensión pasan, alineadas y
de una en una, por delante de uno o varios
detectores que recogen y miden sus
diversas características físicas y/o químicas
mientras son iluminadas por un láser.
Las mediciones se realizan sobre cada
célula, no sobre un promedio de toda la
población. MES GRAN: A LA
Algunos modelos permiten separar las DIAPO SEGÜENT
diferentes subpoblaciones.
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La citometría de flujo
El fundamento de la citometría de flujo
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La citometría de flujo
El fundamento de la citometría de flujo
Los parámetros que se pueden medir por citometría de flujo se dividen en:
Derivados de la luz dispersada por la célula o partícula.
Derivados de luz generada por fluorocromos (naturales o artificiales)
presentes en la muestra.
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La citometría de flujo
Preparación de suspensiones celulares
Las suspensiones deben cumplir unos requisitos:
Ser representativas del tejido que es objeto de análisis.
Ser de alta calidad, con pocos agregados y restos, y bajo coeficiente
de variación.
Preservar las características celulares.
Contener suficiente muestra celular.
Se pueden preparar a partir de la disgregación de material fresco.
En materiales sólidos, existen diferentes métodos de disgregación,
pero pueden producir alteraciones de las características celulares.
Hay que tener en cuenta estas alteraciones y escoger un método de
preparación que no afecte a la población celular que se estudia.
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Funcionamiento del citómetro de flujo
El citómetro de flujo
La suspensión celular es convertida a una fina corriente de fluido que se
dispersará en gotitas microscópicas, en las que incidirá la luz.
Cada célula dispersa la luz en dos direcciones, que permiten determinar
parámetros físicos de las células:
Forward scattering (FSC) (dispersión frontal a 0°): tamaño de la célula.
Side scattering (SSC) (dispersión lateral a 90°): complejidad superficial y
granularidad de la célula.
Si las células han estado incubadas con anticuerpos específicos marcados
que emiten fluorescencia, se excitarán con el láser y emitirán luz.
Ventajas de la citometría: objetividad, elevada sensibilidad, velocidad de
análisis y posibilidad de realizar análisis multiparamétricos sobre una célula.
Desventajas: coste del instrumento e imposibilidad de visualizar las células
analizadas. [Link] 9
Funcionamiento del citómetro de flujo
El citómetro de flujo
Existen diferentes fluorocromos
que se excitan a diferentes
longitudes de onda. Además, estos
pueden combinarse.
EN DUES; A CONTINUACIÓ
El FACS (separador de células
activado por fluorescencia),
permite separar las células
mediante la aplicación de carga
eléctrica momentánea.
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Funcionamiento del citómetro de flujo
El citómetro de flujo
Existen diferentes fluorocromos que se excitan a diferentes longitudes de
onda. Además, estos pueden combinarse.
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Funcionamiento del citómetro de flujo
El citómetro de flujo
El FACS (separador de células activado por fluorescencia), permite separar
las células mediante la aplicación de carga eléctrica momentánea.
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Funcionamiento del citómetro de flujo
Componentes de los citómetros de flujo
Sistema hidráulico
Conduce la suspensión celular a una
velocidad constante y controlada a través
de la cámara de flujo o zona de detección,
donde incide el haz de luz.
Está formado por un capilar por el que pasa
un líquido isotónico que envuelve la
suspensión:
Permite la formación de un flujo laminar
sin turbulencias.
Las células viajan centradas y una tras
otra en el chorro de inyección.
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Funcionamiento del citómetro de flujo
Componentes de los citómetros de flujo
Sistema de iluminación
Proporciona el haz de luz que ilumina la muestra, generalmente un
láser.
La luz emitida es una mezcla de longitudes de onda.
Las longitudes de onda se definen por la energía emitida por el
electrón al caer de una orbita más alta a otra más baja.
Longitudes de onda más utilizadas (nm):
488, 568, 630 y 647.
Emisores láser más utilizados:
De argón con luz monocromática de 488 nm.
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Funcionamiento del citómetro de flujo
Componentes de los citómetros de flujo
Sistema óptico
Recoge la luz emitida por las células:
Fluorescencia.
Señal de luz a 90 grados, relacionada con la refractariedad y con
las estructuras celulares.
Dispersión frontal de la luz, relación con el tamaño celular.
Filtros coloreados o de absorción, dejan pasar:
Band Pass: deja pasar un rango de longitudes de onda.
Short Pass: dejan pasar por debajo de una longitud de onda.
Long Pass: dejan pasar por encima de una longitud de onda.
Filtros dicroicos o de interferencia: reflejan la luz.
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Funcionamiento del citómetro de flujo
Componentes de los citómetros de flujo
Sistema electrónico
Proporciona una iluminación de intensidad
constante, detectando y amplificando la
respuesta de las células o las partículas en
forma de pulso analógico.
Transforma las señales a forma digital y
controla el proceso de separación celular.
Existen dos tipos de detectores de luz:
Fotomultiplicadores: detectan la señal
de fluorescencia y luz dispersada a 90°.
Fotodetectores diodos, detectan la
dispersión frontal de la luz.
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Funcionamiento del citómetro de flujo
Componentes de los citómetros de flujo
Sistema de adquisición y análisis de datos
Permite la adquisición multiparamétrica, el análisis en tiempo real de los
datos y el análisis de las subpoblaciones seleccionadas.
Procesa la señal obtenida y proporciona la información estadística de los
datos, representándolos en forma de histogramas monoparamétricos o
biparamétricos.
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Funcionamiento del citómetro de flujo
Calibración y puesta a punto del citómetro
Calibración del láser
Se realiza mediante estándares o patrones de normalidad, con valores
determinados de fluorescencia o dispersión de la luz.
Maximizar la resolución.
Establecer el ruido de fondo para eliminarlo de las mediciones.
Establecer un nivel base para la detección de fluorescencia
(discriminación de las poblaciones positivas y negativas).
Antes de analizar una muestra hay que realizar siempre los ajustes de
Threshold y Color compensation: evitar los solapamientos producidos
por los espectros de múltiples fluorocromos.
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Funcionamiento del citómetro de flujo
Calibración y puesta a punto del citómetro
Control de calidad diario
Determina las mismas variables que se calculan durante el
establecimiento de la línea base para calcular su variación a lo largo del
tiempo. Se utilizan:
Controles conocidos: monitorizan las prestaciones o la
reproducibilidad de los reactivos y la calidad de los métodos de
preparación celular.
Controles negativos: descartan la unión inespecífica del fluorocromo
y seleccionan el umbral de autofluorescencia.
Controles positivos: comprueban que la técnica funciona.
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Funcionamiento del citómetro de flujo
Calibración y puesta a punto del citómetro
Verificación de la alineación de cada láser respecto a la celda de flujo
Se emplean microesferas multicolores fluorescentes de diámetro
determinado.
Estas microesferas están marcadas con una mezcla de fluorocromos
que se excitan en un rango de entre 365 nm y 650 nm.
Emiten fluorescencia en un espectro compatible con cualquier
fluorocromo empleado en inmunofenotipado.
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Funcionamiento del citómetro de flujo
Mantenimiento preventivo del citómetro
Procedimiento de mantenimiento
Antes de comenzar las determinaciones analíticas:
Poner en marcha el equipo: láser, bomba del tanque de la solución
de flujo y ordenador.
Purgar el equipo y comprobar el nivel de los tanques.
Tras cada ronda de determinaciones analíticas:
Realizar un lavado corto.
Tras la última determinación analítica:
Realizar los lavados establecidos.
Apagar el equipo: bomba del tanque de la solución de flujo,
ordenador y láser.
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El análisis de los datos obtenidos por citometría
El análisis de los datos
Se basa en la obtención de los porcentajes de células fluorescentes y
de la media de intensidad de fluorescencia.
Los datos obtenidos se comparan entre las muestras problema y los
controles.
Para que un resultado sea válido estadísticamente, hay que repetir los
experimentos tres veces.
Para analizar los resultados, se utilizan filtros para poder obtener un
resumen de los datos.
Información obtenida:
La concentración, en células o partículas por ml.
El porcentaje de células positivas y negativas para cada canal.
La intensidad media de fluorescencia.
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El análisis de los datos obtenidos por citometría
La presentación de los resultados
Histogramas de frecuencias:
Histogramas monoparamétricos:
Cada valor de X (intensidad de
fluorescencia) es el número de
células que emiten esa intensidad.
Histogramas biparamétricos:
Observan las células o eventos
distribuidos como una función de
intensidad de la señal con respecto
a cada parámetro.
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El análisis de los datos obtenidos por citometría
La presentación de los resultados
Diagramas de dispersión o dot-plots:
Las células con características
similares, en función de su tamaño o
la emisión de fluorescencia, forman
un grupo en un gráfico.
Diagramas de contorno o contour-plots:
Proporcionan una representación 3D
configurada por X e Y más una
tercera dimensión.
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Aplicaciones de la citometría de flujo
Esta técnica tiene muchas aplicaciones, tanto en investigación como en
la rutina clásica.
Mediante citometría de flujo se pueden analizar:
A escala supracelular: organismos pluricelulares, esferoides e
hibridomas.
A escala celular: protoplastos vegetales, células animales, levaduras y
bacterias.
A escala subcelular: viriones, liposomas, cromosomas, orgánulos y
núcleos.
A escala molecular: proteínas, ácidos nucleicos e inmunocomplejos.
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Aplicaciones de la citometría de flujo
Determinación de poblaciones celulares en sangre periférica
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Aplicaciones de la citometría de flujo
Determinación de poblaciones celulares en sangre periférica
Inmunofenotipado de superficie:
identifica subpoblaciones celulares.
Detección de antígenos intracelulares.
Monitorización de las subpoblaciones
linfocitarias: diagnóstico y monitorización
de enfermedades linfocitarias.
Linfocitos T totales: anticuerpo
monoclonal anti-CD3. Los linfocitos T
cooperadores y citotóxicos, con
anticuerpos monoclonales anti-CD4 y
anti-CD8, respectivamente.
Linfocitos B: se utiliza un anticuerpo
monoclonal anti-CD19.
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Aplicaciones de la citometría de flujo
Fenotipaje de leucemias y linfomas
Detección de enfermedad mínima residual en las leucemias agudas en
remisión para el diagnóstico precoz de recaídas.
El estudio de síndromes linfoproliferativos:
Permite un diagnóstico diferencial rápido entre una linfocitosis reactiva y
un proceso monoclonal.
El inmunofenotipo permite clasificar los síndromes linfoproliferativos en
neoplasias de origen B, T y NK.
Expresión de las inmunoglobulinas citoplasmáticas (IgCit) de cadenas
ligeras (κ y λ) o pesadas (IgA, IgD, IgG e IgM).
El estudio de las inmunoglobulinas citoplasmáticas puede ayudar a
establecer el ratio de células plasmáticas patológicas/sanas.
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Aplicaciones de la citometría de flujo
Fenotipaje de otras poblaciones celulares
Se puede realizar el inmunofenotipaje de superficie de cualquier
célula, marcando antígenos de su membrana con anticuerpos
monoclonales o policlonales conjugados con fluorocromos.
Se pueden necesitar procesos de preparación de las muestras
(centrifugación, disgregación, estimulación celular, etc.).
Otras aplicaciones:
Detección de leucocitos activados en sangre periférica o en
preparaciones celulares estimuladas.
Detección de aloanticuerpos y autoanticuerpos circulantes o unidos
a células.
Diagnóstico de deficiencias en moléculas de adhesión.
Identificación de basófilos circulantes y detección de degranulación
provocada por alérgenos.
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Aplicaciones de la citometría de flujo
Cuantificación de moléculas
Cuantificación de proteínas:
Se emplean microesferas con distintas
intensidadesENdeDUES; A CPONTINUACIÓ
fluorescencia para detectar
y cuantificar proteínas solubles.
Cada microesfera está recubierta de
anticuerpos para una proteína específica.
Permite detectar varias proteínas
simultáneamente.
Cuantificación de anticuerpos:
Se pueden detectar anticuerpos frente a un
patógeno determinado.
Se pueden detectar diferentes anticuerpos
(frente a diferentes patógenos)
simultáneamente.
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Aplicaciones de la citometría de flujo
Cuantificación de moléculas
Cuantificación de proteínas:
Se emplean microesferas con distintas intensidades de fluorescencia
para detectar y cuantificar proteínas solubles.
Cada microesfera está recubierta de anticuerpos para una proteína
específica.
Permite detectar varias proteínas simultáneamente.
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Aplicaciones de la citometría de flujo
Cuantificación de moléculas
Cuantificación de anticuerpos:
Se pueden detectar anticuerpos frente a un patógeno determinado.
Se pueden detectar diferentes anticuerpos (frente a diferentes
patógenos) simultáneamente.
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Otras técnicas de separación celular
Panning para linfocitos
Es un método sencillo que permite
separar los linfocitos T de los B.
Se utilizan placas sensibilizadas con
anticuerpos específicos de los
marcadores de superficie de las
subpoblaciones que se quiere
separar (por ejemplo, anti-CD4 y
anti-CD8).
Las células de interés se unirán a los
anticuerpos mientras que la otra
población podrá eliminarse
mediante lavados.
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Otras técnicas de separación celular
Separación celular inmunomagnética
Selección positiva:
La población deseada es marcada
magnéticamente y aislada en la fracción
celular retenida.
Selección negativa:
Eliminación de las células no deseadas
mediante marcado magnético y elución de
la fracción que contiene la población
deseada no marcada.
Manual o automatizada.
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Otras técnicas de separación celular
Separación con microesferas de plástico no magnéticas
Se incuba la muestra en presencia de las microesferas adecuadas para
el tipo celular deseado.
Se filtra con un filtro que retiene solo las células unidas a las
microesferas.
Mediante un tampón, se liberan las células de las microesferas, que se
recogen en un tubo.
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Otras técnicas de separación celular
Técnicas de inmunotoxicidad
Se utiliza la capacidad lítica del complemento para eliminar las células
no deseadas.
Se marcan las células no deseadas con anticuerpos monoclonales
específicos de marcadores de membrana.
Se añade complemento de conejo, que activará la vía alternativa
(formación del complejo antígeno-anticuerpo en la célula diana).
La depleción por complemento es una técnica rápida, barata y elimina
el 95-100 % de la población diana.
Aplicaciones:
Purificación celular.
Enriquecimiento de poblaciones celulares.
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