Proyectos
Integradores
Proyecto 1:
Medios Diferenciales
Proyecto 2:
Determinación de la actividad de la
Catalasa en una Muestra de Suelo por
el Método de Johnson y Temple
MANUAL BIOQUIMICA LQI-335
Proyecto #1: Medios Diferenciales
Los agares diferenciales son medios de cultivo utilizados en microbiología para identificar
microorganismos basándose en sus diferencias metabólicas o bioquímicas. A diferencia de los
agares selectivos, que inhiben el crecimiento de ciertos microorganismos, los agares
diferenciales permiten el crecimiento de diferentes especies, pero las colonias o el medio
circundante muestran cambios visibles que indican diferencias metabólicas.
Ejemplos comunes de agares diferenciales son el agar sangre (para detectar hemólisis), agar
MacConkey (para diferenciar fermentadores de lactosa) y agar azul de metileno eosina (EMB).
Columbia Agar Base
Este medio combina las virtudes de la peptona, la tripteína, el extracto de levadura y el extracto
de corazón, que favorecen el desarrollo de microorganismos exigentes y la obtención de
colonias eugónicas. El almidón incrementa el desarrollo de neisserias y
las reacciones de hemólisis de algunos estreptococos. El cloruro de
sodio mantiene el balance osmótico y el agar es el agente solidificante.
Puede ser utilizado como medio base para ser suplementado con sangre
o con antimicrobianos, lográndose así un medio más enriquecido o
selectivo de acuerdo al aditivo. Si se suplementa con sangre ovina o
equina, se puede preparar “Agar Sangre” y lograr así el crecimiento y
observación de las reacciones hemolíticas de los microorganismos inoculados o también se
puede preparar “Agar Chocolate” el cual es un medio de cultivo adecuado para el crecimiento
de microorganismos exigentes en sus requerimientos nutricionales como ser Haemophilus spp.
y Neisseria spp.
Hemolisis
La hemólisis es la descomposición de los glóbulos rojos. La capacidad de las colonias
bacterianas para inducir hemólisis al crecer en agar sangre se utiliza para clasificar ciertos
microorganismos. Esto es particularmente útil para clasificar las especies de estreptococos. La
sustancia que causa la hemólisis se denomina hemolisina.
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Tipo de Hemolisis
Alfa-Hemólisis (α-hemólisis):
Cuando se presenta alfa-hemólisis (α-hemólisis), el agar bajo la colonia presenta un color claro
y verdoso. Streptococcus pneumoniae y un grupo de estreptococos
orales (Streptococcus viridans) presentan alfa-hemólisis. Esto a veces
se denomina hemólisis verde debido al cambio de color en el agar.
Otros términos sinónimos son hemólisis incompleta y hemólisis
parcial. La alfa-hemólisis se debe a la producción de peróxido de
hidrógeno por parte de la bacteria, que oxida la hemoglobina y
produce metahemoglobina, un derivado oxidado de color verde.
Beta-Hemólisis (β-hemólisis):
A veces llamada hemólisis completa, es una lisis completa de los glóbulos rojos en el medio
alrededor y debajo de las colonias: el área aparece aclarada (amarilla)
y transparente. La estreptolisina, una exotoxina, es la enzima
producida por las bacterias que causa la lisis completa de los
glóbulos rojos. Hay dos tipos de estreptolisina: estreptolisina O
(SLO) y estreptolisina S (SLS). La estreptolisina O es una citotoxina
sensible al oxígeno secretada por la mayoría de los estreptococos del
grupo A (GAS) y Streptococcus dysgalactiae; interactúa con el
colesterol en la membrana de las células eucariotas (principalmente
glóbulos rojos y blancos, macrófagos y plaquetas), lo que generalmente resulta en β-hemólisis
bajo la superficie del agar sangre. La estreptolisina S es una citotoxina estable al oxígeno
también producida por la mayoría de las cepas de GAS que resulta en el aclaramiento en la
superficie del agar sangre. El SLS afecta a las células inmunitarias, como los leucocitos
polimorfonucleares y los linfocitos, y se cree que impide que el sistema inmunitario del huésped
elimine la infección.
Gamma-Hemólisis (γ-hemólisis):
Si un organismo no induce hemólisis, el agar debajo y alrededor de la
colonia permanece inalterado y el organismo se denomina no
hemolítico o presenta gamma-hemólisis (γ-hemólisis). Enterococcus
faecalis (anteriormente llamado "estreptococo del grupo D"),
Staphylococcus saprophyticus y Staphylococcus epidermidis
presentan gamma-hemólisis.
Hemo-digestión
Cuando se siembran en agar sangre bacterias no hemolíticas, como
cepas de Vibrio cholerae, causante del cólera, no se observan claros
alrededor de colonias aisladas, pero la sangre que rodea áreas de
crecimiento más extensas se vuelve verde. Este proceso, llamado
hemo-digestión, se debe a los subproductos metabólicos de las
bacterias en condiciones aeróbicas.
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Procedimiento Experimental
Preparación de Placas de agar Columbia con 5% sangre (Agar Sangre)
1. Esterilizar el área de trabajo, lavar las manos adecuadamente y el mesón a utilizar.
2. Realizar la preparación del medio de cultivo, Agar Columbia, de la misma forma en la
que se describió en la Práctica #1.
3. Agregar 5mL de sangre animal, o humana, al medio líquido, cuando ese se encuentre en
una temperatura menor a 45 °C. Esto se realiza en el recipiente que se realizo la
solubilizacion del agar.
4. Verter sobre placas Petri estériles, dejar enfriar.
Detección de hemólisis en bacterias cultivadas
1. Esterilizar el asa y tomar una muestra del cultivo bacteriano, puede ser de agua u otro
medio natural, o medio incubado.
2. Siembre el microorganismo en la placa de agar Sangre con técnica de estría por
agotamiento.
3. Incubar la placa a 35–37 °C durante 24–48 horas.
4. Observe las colonias y el aspecto del agar alrededor de ellas.
5. Identifique el tipo de hemolisis de la muestra.
Evaluación de la capacidad hemolítica de bacterias aisladas de frotis faríngeos
[Link] a un voluntario realizar un enjuague bucal con agua estéril.
[Link] un hisopo estéril, tomar una muestra del fondo de la garganta (zona de las
amígdalas o faringe posterior).
[Link] la muestra, con el hisopo, directamente sobre una placa de agar Sangre con
técnica de estría por agotamiento.
[Link] la placa a 35–37 °C durante 24 a 48 horas.
[Link] las colonias y el aspecto del agar alrededor de ellas.
[Link] el tipo de hemolisis de la muestra.
Identificación
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Proyecto #2: Determinación de la
actividad de la Catalasa en una
Muestra de Suelo por el Método de
Johnson y Temple
La catalasa es una enzima intracelular que se encuentra en todas las bacterias aerobias y en la
mayoría de las anaerobias facultativas, estando ausente en las anaerobias obligadas. Por ello,
esta enzima se ha venido considerando a lo largo de los años como un exponente de la actividad
microbiana del suelo y se ha relacionado con el estado de fertilidad edáfico. Sin embargo, varios
autores indican que esta actividad no muestra una buena correlación con el número total de
microorganismos del suelo, por lo que su papel como exponente del estado bioquímico del
mismo seria limitado. La catalasa corresponde, según la nomenclatura de la Comisión
Internacional de Enzimas, a la actividad enzimática peróxido de hidrogeno oxidoreductasa y es
la encargada de catalizar la reacción que descompone el peróxido e hidrogeno (H2O2), liberando
H2O y O2. Tiene una función detoxificante en las células ya que elimina el H2O2 altamente
toxico, que se forma durante la cadena de transporte de electrones en la respiración aerobia y en
diversas reacciones de hidroxilación y oxigenación. Fue la primera enzima determinada en el
suelo y prácticamente la única que se estudió durante los primeros años del siglo XX.
Uno de los problemas para la determinación de la actividad de catalasa en suelo, siempre que se
haga a través de la descomposición del H2O2 es que entre un 65% de la actividad total que se
determina puede ser debida a una catálisis no enzimática, atribuible a compuestos inorgánicos
de Fe y Mn.
Desde principios del siglo XX se ha descrito numerosos métodos para la determinación de la
actividad de catalasa en los suelos, la mayoría de los cuales han sufrido diversas modificaciones.
En todos ellos la actividad de catalasa se determina añadiendo peróxido de hidrogeno al suelo y
midiendo bien la cantidad de O2 liberado o bien el H2O2 remanente en el suelo al cabo de un
tiempo determinado. En los métodos que se basan en la medida del H2O2 remanente, esta se
determina por titulación con KMnO4 o por colorimetría. En suelos con elevado contenido en
materia orgánica la co-extracción de la misma durante la determinación da lugar a extractos
ligeramente coloreados, lo que dificulta en gran medida la distinción del punto final de la
valoración con permanganato potásico, no solo porque enmascara el color rosa pálido, típico de
dicho punto final, sino también porque dicha materia orgánica reduce al permanganato,
subestimado la actividad enzimática. Esto hace que los extractos correspondientes a los
controles, esto es, suelo incubado sin adición de H2O2, tengan que ser valorados con extremo
cuidado, para evitar una estimación incorrecta de la actividad catalasa. Por otro lado, incluso en
suelos con bajo contenido de materia orgánica, el punto de viraje es muy difícil de apreciar por
lo que la valoración de muestras y controles es extremadamente subjetiva.
El procedimiento para que tenga lugar la reacción enzimática se basa en la adición de una
determinada cantidad de H2O2 al suelo y en la incubación de la mezcla a 20 °C durante un
periodo de tiempo determinado en el que actúa la enzima, provocando la descomposición del
H2O2 en H2O y O2, según la siguiente reacción:
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Posteriormente, el H2O2 residual, esto es, el peróxido de hidrogeno que permanece inalterado
después de que tuvo lugar la reacción enzimática, se mide mediante una valoración con
permanganato potásico, lo cual se basa en que el peróxido de hidrógeno en solución acida
reduce al permanganato con formación de oxígeno, según la siguiente reacción:
Procedimiento Experimental:
1. Pesar 0.5 g de suelo húmedo en un recipiente son tapón, y añadir 40 mL de agua
destilada y tapar.
2. Agitar por 30 minutos en agitador magnético (3 vuelta por minuto).
3. Añadir 5 mL de H2O2 1:100, disolver 1 mL de H2O2 30% en 100 mL de agua destilada,
tapar y agitar de nuevo durante 10 minutos exactos.
4. Preparar la reacción enzimática y estabilizar el peróxido de hidrogeno remanente
mediante la adicion de 5 mL de H2SO4 1.5 M.
5. Filtrar con mucho cuidado. Esta será la muestra problema.
6. Realizar control, utilizando los mismos componentes que la muestra, pero sustituyendo
los 5 mL de H2O2 por igual volumen de agua destilada.
7. Preparar un blanco sin suelo, pero con H2O2. Su composición será entonces, 40 mL de
H2O, 5 mL de H2O2 y 5 mL de H2SO4 1.5M.
8. Repetir filtrado con muestra control y muestra blanco.
9. Tomar una alícuota de 25 mL del filtrado y valorar lentamente con KMnO4 0.01 M.
Llegar hasta un rosa pálido.
10. Valorar la muestra control y muestra blanco, con KMnO4 0.01 M. Llegar hasta un rosa
pálido.
11. Tomar los datos de las 3 valoraciones, y proceder a los cálculos.
Cálculos
𝑀𝐵 − (𝑀𝑃 − 𝑀𝐶) ∗ 𝑁 ∗ 0.5 ∗ 𝐹𝐷 ∗ 6
𝐴𝐸 =
𝐺
Donde:
- AE = Actividad enzimática de Catalasa (mmoles H2O2 consumido en g-1 h-1).
- MG = Cantidad de permanganato en ml gastados en la valoración del blanco.
- MP = Cantidad de permanganato en ml gastados en la valoración de la muestra
problema.
- MC = Cantidad de permanganato en ml gastados en la valoración del control.
- N = Normalidad exacta del permanganato potásico.
- 0.5 = Valor constante que procede del cálculo para conocer los mg de H2O2 que
reaccionan con el permanganato.
- FD = Factor de dilución, en este caso seria 50 ml/25 ml.
- G = Factor relativo a la cantidad de suelo seco utilizado, en este caso 0.5 gramos de
suelo húmedo.
- T = Factor de tiempo; en este caso serie 6, ya que la incubación dura 10 minutos.
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