VARIACIONES DE LOS NIVELES

SÉRICOS DE COMPLEMENTO

TEMA 10: VARIACIONES DE LOS NIVELES SÉRICOS DE COMPLEMENTO. CURVA DE

HEMÓLISIS. MÉTODO DE VALORACIÓN COMPONENTES DEL COMPLEMENTO CON
LECTURA FINAL AL 100% Y 50 % DE HEMÓLISIS. VALORACIÓN DE COMPLEMENTO.
VALORACIÓN DE HEMOLISINA. CÁLCULO DE LA DOSIS MÍNIMA HEMOLÍTICA.
Vías de Activación del complemento

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 Variaciones de los niveles séricos de Complemento
Deficiencias congénitas Deficiencias por otras patologías
Deficiencia de componentes de la vía clásica:
 Deficiencia de C1q, C1r, C4 y C2
 Deficiencia de C3: susceptible a infecciones por bacterias piógenas  Lupus eritematoso sistémico
 Deficiencia de los últimos componentes de las vías: C5, C6, C7, C8 y
C9: susceptible a infecciones por Neisseria meningitidis y Nesseria  Artritis reumatoidea
gonorrhroeae
 Glomerulonefritis hipocomplementemica
Deficiencia de componentes de la vía alterna:
 La deficiencia recesiva de properdina ligada al cromosoma X  Glomerolunefritis post-estreptococcica
es más frecuente
Deficiencia de componentes de la vía de las lectinas:  Anemia hemolítica autoinmune
 Deficiencia en los genes que codifican para las MBL y las MASP2

Deficiencia de proteínas reguladoras:

 Deficiencia de C1 inh (Edema angioneurótico hereditario)
 Deficiencia de DAF: Hemoglobinuría paroxística nocturna
 Deficiencia del Factor I: agotamiento plasmático de C3
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 Deficiencia del Factor H: activación excesiva de la vía alterna
¿Cómo podemos valorar en el laboratorio el sistema del complemento?
 Ensayos inmunoquímicos:
Se utilizan distintas técnicas empleando Acs específicos para el componente a valorar.
Las técnicas empleadas de rutina son IDR, Turbidimetría, nefelometría, etc. (TP N˚1).

Disminuidas Aumentadas
C3 y
Enfermedades
inmunológicas C4
hereditarias o Ocurre regularmente en
adquiridas la fase aguda de muchas
en donde hay un enfermedades
déficit o consumo de reumáticas
estos factores.

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¿Cómo podemos valorar en el laboratorio el sistema del complemento?

 Ensayos funcionales:
Permiten evaluar la integridad del sistema de complemento.
Los métodos se basan en la determinación del efecto citotóxico del complemento
sobre los glóbulos rojos (GR) específicamente sensibilizados con un anticuerpo: la
hemolisina; lo que es conocido como Actividad Hemolítica del Complemento.

Evaluación de la vía clásica del

complemento 5
 Valoración del Complemento

50% de 100%
lisis COMPLEMENTO
de lisis

Valoración del complemento en Determinación de Acs en bajas

suero (disminución, aumento) concentraciones en suero

Reacción de Fijación de Complemento 6

Curva de hemólisis en función del complemento

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 Actividad Hemolítica del Complemento (CH50) La oxihemoglobina
Cantidad de suero necesaria para producir la lisis del liberada es proporcional
a la actividad del C'
50% del sistema hemolítico.
Se determina DO

Sistema Hemolítico
GR sensibilizados con el Ac: Hemolisina

Valoración al 50% de
hemolisis

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Reacción de Fijación del complemento

Es una prueba de alta especificidad y sensibilidad, se la usa para

la determinación de Anticuerpos en suero que están en bajas
concentraciones

 Se la utiliza para el diagnóstico de enfermedades virales, parasitarias,

bacterianas y micóticas.

 El principio básico de una prueba de fijación de complemento es la activación y el

consumo (fijación) del complemento en presencia de una reacción Ag:Ac
específica.

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 Reacción de Fijación del complemento
 Se realiza en dos etapas: la fijación del C’ y el revelado de la reacción con el sistema
hemolítico.
Primera etapa: fijación del C Segunda etapa: revelado de la reacción

Lisis - Lisis +

RFC +

RFC -

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 Reacción de Fijación del complemento
Reactivos necesarios para realizar una RFC

• Suero del paciente: Acs a determinar

• Antígeno especifico para los Acs a investigar
• Complemento
• Sistema Hemolítico
Reacción de Fijación del complemento

Extracción de sangre por

punción venosa
C

Desactivar el C
del suero
C C

Suero: fuente de Acs

Calentar a 56°C
por 30min

Suero del paciente:

Fuente de Acs Complemento
iC
iC inactivado 12
Reacción de Fijación del complemento

Suero problema
Ag comercial Inmunocomplejos Complemento
específico
C
C
C
iC
C

Fuente externa de C

Suero fresco conservado a:

2/4°C (heladera): se debe valorar en el
día.
-18/-20°C (congelado): conserva el título
por varias semanas
-70°C o liofilizado: conserva el título por
varios meses 13
Preparación del sistema hemolítico o indicador
¿Qué es el sistema hemolítico?
Partes iguales o volúmenes iguales de glóbulos rojos de carnero
al 2% y hemolisina en dos dosis mínimas hemolíticas (2DMH).

Hemolisina Sistema
GR hemolítico

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Obtención de los glóbulos rojos de carnero

1. Punción yugular a ovejas

• NaCl (4.2 g/L)
• Citrato de sodio (8.0 g/L)
Anticoagulante: Alsever (glucosa-citrato • Glucosa (20.5 g/L)
• Ácido cítrico al 10%
• H2O destilada

2. Centrifugar la sangre

3. Se descarta el plasma. Lavar el pellet de GR

GR de carnero
se unas 3 veces con solución tamponada

4. Confeccionar la curva para determinar la concentración de los GR 15

Curva de calibración de GR
Determinación del
1. Pellet de GR+ diluyente 5 veces el vol de hematies volumen globular o
Hematocrito

2. Preparar suspensiones a diferentes concentraciones

Suspensiones al 15%, 7,5% y al 3,75%

en solución carbonatada

3. Determinar el porcentaje de transmitancia de dichas suspensiones en espectrofotómetro

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Curva de calibración de GR

0,2 ml + 9,8 ml de
sol. carbonatada

GRC al 2% 17
¿Que es la hemolisina?

Es un anticuerpo dirigido contra los glóbulos rojos de carnero

¿Cómo se obtiene la hemolisina?

Por inmunización de conejos con GR de carnero

Ac hemolisina
Plan de inmunización

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 Preparación del sistema hemolítico o indicador
¿Cómo se obtiene la hemolisina?

Estroma celular de GR: los GR son lavados en solución salina varias veces y
luego son lisados con ácido acético 2%. El estroma celular se lava múltiples
veces con buffer acetato y la suspensión celular así preparada se calienta
durante una hora a 100°C

GR de carnero enteros
Plan de inmunización

Ag isófilos: se encuentran en la superficie de los glóbulos rojos de carnero y son sensibles al

calor. Si se calientan a 100°C, se degradan y desaparecen Termolábiles

GR de carnero
Ag heterófilos o de Forssman: se encuentran en los glóbulos rojos de carnero, pero son
resistentes al calor. Se mantienen intactos incluso a altas temperaturas. Termoestables

Ac de tipo IgM anti GR de carnero 19

Calidad de la Hemolisina

Hemolisina II y III: Ag GR de
carnero enteros

Hemolisina I: Ag es estroma
calentado de GR de carnero

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Determinación del título sub-aglutinante de la hemolisina
Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8
Buffer 1 1 1 1 1 1 1 1
Hemolisina 1 -------
1/10
descartar
GRC 2% 1 1 1 1 1 1 1 1
Dilución 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 640 1/1280 T

Incubar 37°C durante 90 minutos

Título: máxima dilución de suero que me da aglutinación visible

Título aglutinante 1/160 Dilución de hemolisina a la cual los GR se encuentran
Título sub-aglutinante 1/320 sensibilizados pero no presentan aglutinación visible
Determinación de las dosis mínimas hemolíticas (DMH) de hemolisina
Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8
Buffer 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 ----- 0,75

Hemolisina 0,25 0,25

1/320
GR2% 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25

C 1/20 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 ----- -----

H2O 0,75
Dil. De 1/640 1/1280 1/2560 1/5120 1/10240 1/20480
Hemolisina

2DMH 1DMH

1DMH: Es la máxima dilución de hemolisina que produce el 100% de lisis

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Preparación del sistema indicados o sistema hemolítico

Dilución 1/320 2.5ml de hemolisina en 2DMH

Hemolisina

Sistema hemolítico (SH)

GR al 2% 23
Valoración del Complemento

Suero fresco conservado a:

Fuente de complemento
2/4°C (heladera): se debe valorar en el
día.
• Fresco: extraído en el día -18/-20°C (congelado): conserva el título
SUERO por varias semanas
-70°C o liofilizado: conserva el título por
varios meses
cobayo humano
• Libre de hemólisis

Heparina
• No usar anticoagulante que sean quelantes de Ca2+ Citrato de sodio
Dilución 1/20 Dilución 1/100 EDTA

Extracción de sangre sin SUERO

anticoagulantes
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Valoración del Complemento
Lectura de los resultados
Tubos 1 2 3 4 5 6 7 T

C 1/20 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 -------

Buffer 0,45 0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,50

C´H 100%:20/0,25=80 UCH 100%

SH 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

- - - - + + + -
C 0% de lisis
Incubar 37°C durante 30 minutos
Dosis Reactiva corresponde al tubo de la serie que contiene la menor cantidad de
suero fresco (Complemento) capaz de producir la lisis de los GR sensibilizados

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 Suero del paciente:
fuente de Acs Complemento en
la DR
Positivo
Primera etapa:

Antígeno

C
C
C C
Reacción no visible
C C C
Negativo

Reacción visible
Segunda etapa:

SH Lisis negativa

CC Lisis positiva
 Factores que modifican la valoración del Complemento

• Número de hematíes.

Cuántos ml de C se necesitan para

producir el 50% de lisis de los GR?

2
25% más de C

> [hematíes] / ml
 Factores que modifican la valoración del Complemento
• Volumen final de la reacción

Actividad hemolítica del C

Vol final de la reacción

V C
2 25%
4 50%

• Fuerza iónica del diluyente

FI Actividad hemolítica del C

Buffer Mayer FI: 0,147

 Factores que modifican la valoración del Complemento

• Acción del pH

pH: 7,2 a 8,5 Actividad hemolítica del C

25%

• Temperatura

Temperatura
ideal 37°C
T: < 37°C Actividad hemolítica del C

• Iones Ca y Mg Son fundamentales para la activación del C

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Bibliografía

Margni Inmunología e Inmunoquímica. Fundamentos 5° Edición

Abbas. Litchman. Pillai. Inmunología Molecular y Celular. Ed 10
Delves. Martín. Burton. Roitt. Inmunología. Fundamentos. Ed 11
Fainboim-Geffner. Introducción a la Inmunología Humana. Ed 6

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GRACIAS
Carolina Maldonado

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