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Una vez que la FDA lo apruebe y otorgue su
licencia, el NAT estará disponible para el
EDUCACION CONTINUA escrutinio de rutina de todos los
componentes de los donadores sanguíneos
por HIV y HCV, dependiendo de la
factibilidad y eficiencia demostrada en el
proyecto de investigación de droga nueva
que actualmente se está realizando. El
método NAT para el virus de hepatitis B
(HBV) no ha sido implementado en el
presente debido a su anticipada carencia de
efectividad en comparación con los métodos
de prueba vigentes (Treat et al., 2000).
Técnicas de Amplificación En años recientes, todos los donadores de
de Acidos Nucleicos (NAT) sangre han sido tamizados extensivamente
por medio de entrevista y de pruebas para
en Banco de Sangre diferentes marcadores infecciosos. En 1996,
el riesgo de infección por HIV transmitido
Dra. Marianela Trejos Herrera 1 mediante transfusión fue aproximadamente
de 1 en 493.000 unidades transfundidas. Este
Dra. Virginia Chacón Zamora 2 riesgo representa una disminución notable,
considerando que en los inicios de 1980 era
tan alto como 1% por unidad transfundida,
1 Laboratorio Clínico, en algunas ciudades de los EUA. Por
Hospital Calderón Guardia, CCSS otra parte, el riesgo de infección por HCV
transmitida por transfusión es de 1 en
2 Laboratorio Clínico, 103.000 unidades transfundidas (Treat et al.,
Hospital San Vicente de Paúl, CCSS 2000).
Los donadores infectados pueden fallar al
Introducción responder exactamente las preguntas acerca
En los inicios de la primavera de 1999, de los factores de riesgo de las enfermedades
la Cruz Roja Americana y dieciséis transmisibles, en el momento de la donación
laboratorios miembros de los Centros de de sangre. Los riesgos actuales de infección
Sangre Americanos comenzaron a probar por HIV y HCV transmitidas por trans-
sangres de donadores por el virus de la fusión, aunque bajos, pueden ser reducidos
inmunodeficiencia humana (HIV) tipo 1 y el con los métodos de biología molecular
virus de la hepatitis C (HCV) con un capaces de amplificar y detectar el genoma
nuevo método conocido como “prueba viral (America’s Blood Centers, 1999;
de amplificación de ácidos nucleicos”, Shapiro, 1999).
conocida en la literatura en inglés por las
siglas NAT. Esta prueba es conducida bajo Razones para implementar el NAT
los denominados protocolos de investigación El ímpetu para iniciar el uso de NAT en
de drogas nuevas, aprobados por la Food and donadores sanguíneos es multifactorial
Drug Administration (FDA) de los EUA. (Treat et al., 2000):
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(1) En acatamiento con el Comité Europeo llevado a cabo con diversas técnicas de
para Propietarios de Productos amplificación de ácidos nucleicos. La
Medicinales (CPMP), se requiere que reacción en cadena de la polimerasa (PCR),
todos los derivados de plasma distribui- la reacción en cadena de la ligasa, la
dos en la Unión Europea después del 1 de amplificación basada en la secuencia de
julio de 1999, sean obtenidos a partir de ácidos nucleicos y la amplificación mediada
plasma que tenga pruebas negativas para por transcripción, son técnicas de amplifi-
HCV por NAT. Este mandato se origina cación genómica que usan diferentes
como resultado de infecciones por HCV métodos para lograr la amplificación in vitro
en algunos pacientes que recibieron de los ácidos nucleicos. Todas estas técnicas
inmunoglobulinas (Igs) comercialmente detectan la presencia de agentes infecciosos
disponibles, preparadas después de la en los donadores, amplificando secuencias
implementación del escrutinio serológico específicas de ácidos nucleicos del micro-
de los donadores para HCV. Como organismo. El uso de estas técnicas provee
resultado de las infecciones por HCV un mayor nivel de sensibilidad y especifici-
ocurridas a través de estas preparaciones dad que los métodos de rutina (inmuno-
que no fueron sometidas a inactivación ensayos enzimáticos, EIA). A pesar del
viral, las agencias regulatorias han escrutinio de rutina de los donadores de
ordenado que los fabricantes incluyan la sangre mediante EIA para la detección de
inactivación viral en la producción de Igs antígenos (HBsAg, HIV p24) y anticuerpos
terapéuticas. Asimismo, como una etapa (anti-HIV 1/2, anti-HBc, anti-HCV), existe
de seguridad, el CPMP Europeo ordenó un riesgo residual de infección postrans-
una prueba directa para HCV por NAT fusional para HIV o virus de hepatitis
y probablemente extienda estos adquiridos a través de donadores que están
requerimientos para incluir la prueba en el período de ventana (o latente) de la
genómica para HIV y HBV en el futuro. infección (America’s Blood Centres, 1999;
Treat et al., 2000).
(2) Los lineamientos de la FDA El NAT tiene capacidad para detectar la
establecieron que los fabricantes de presencia de infección porque detecta direc-
derivados sanguíneos y los bancos de tamente ácidos nucleicos genómicos virales
sangre deben implementar esta tecnología y no, indirectamente, la presencia de antic-
para disminuir o eliminar el período de uerpos. Lee y Allain (1998) describen que la
ventana durante el cual el donador es eficacia de tal escrutinio depende de la
infeccioso pero no reactivo por los méto- prevalencia de la infección en la población y
dos de escrutinio de rutina licenciados. la duración del período de ventana.
Los programas de donación de EUA,
(3) La demanda del consumidor ha avocado incluyendo America’s Blood Centers (ABC)
por una disminución adicional en los ries- y American Red Cross (ARC), iniciaron la
gos de transfusión por el uso de técnicas implementación de NAT para escrutinio de
más avanzadas. donadores de sangre, creando laboratorios
centralizados que conocieran los requerim-
Principios técnicos del NAT ientos de los vendedores de tecnología
El escrutinio genómico para agentes molecular. Tanto los ABC como la ARC
infecciosos utilizando NAT puede ser están trabajando con suplidores comerciales
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para desarrollar métodos basados en la positiva, asegurándose que todas las
utilización de mezclas (“pools”) de muestras están representadas en la mezcla y
muestras, optimizando los sistemas para evitando la contaminación cruzada.
asegurar la sensibilidad y especificidad de Dos sistemas de pruebas serán utilizados
estas pruebas, y entrenando el personal para el escrutinio de los donadores de
para llevarlas a cabo (America’s Blood sangre: Roche Molecular Systems Cobas
Centers, 1999). Ampliscreen para HCV y HIV y el GenProbe
El uso de mezclas de muestras de Pooled Plasma HIV-1/HCV Amplified Assay
donadores, aunque no se había utilizado (America’s Blood Centers, 1999).
previamente en EUA, reduce significativa- El sistema Cobas Ampliscreen está
mente el número de pruebas requeridas basado en cinco procesos principales:
diariamente, el tiempo de la prueba y el preparación de la muestra utilizando
costo de la prueba por donación. La razón ultracentrifugación para concentrar las
para usar mezclas de muestras se originó a partículas de virus; transcripción reversa
partir de observaciones de paneles con del ARN blanco para generar ADN
muestras de pacientes seroconvertidos que complementario (cDNA); amplificación del
producían la elevación de ácidos nucleicos cDNA blanco por medio de la reacción en
de HCV y HIV. La dilución de la muestra cadena de la polimerasa usando sondas
inherente en la mezcla tiene un impacto complementarias específicas de los virus;
mínimo en la sensibilidad para detectar hibridización de los productos amplificados
muestras virémicas en período de ventana. con sondas de oligonucleotidos específicos
Realizar la prueba molecular en mezclas de para el blanco y detección de los productos
muestras es factible. amplificados unidos a la sonda por
Se requiere algoritmos para resolver las determinación colorimétrica. La transcrip-
mezclas con resultados positivos, para deter- ción reversa y la amplificación por PCR del
minar la fuente individual del donador que blanco viral y del blanco control interno
causó la reactividad en la mezcla. El tamaño ocurren simultáneamente. Seguidamente a la
de la mezcla seleccionado por los programas amplificación por PCR, la sonda específica
de sangre de EUA varía desde 24 hasta 128. para el blanco es hibridizada con el amplicón
Los centros de sangre de EUA adoptaron y la detección del ADN amplificado es
dos sistemas de mezcla básicos y estrategias llevada a cabo utilizando un conjugado
de resolución de las mezclas. Una utiliza la avidina-peroxidasa. Después de que se ha
mezcla de 24 muestras, en la cual la resolu- completado la preparación de la muestra, el
ción de una mezcla positiva requiere de proceso restante es totalmente automático,
pruebas individuales de cada muestra. En la con un tiempo total para la prueba de
otra estrategia, mezclas más pequeñas (inter- aproximadamente 6 horas.
medias) se preparan y combinan para crear El sistema Gen Probe para HIV-1/HCV
una mezcla maestra final (“master pool”). detecta el ARN de estos agentes en un solo
La resolución de una mezcla maestra positi- tubo de formato múltiple, e involucra tres
va se realiza probando primero las mezclas etapas principales. La preparación de la
intermedias y luego, si es necesario, las muestra utiliza captura de blancos para
muestras individuales. El proceso de el RNA aislado del plasma. El plasma es
preparación de las mezclas es llevado a cabo tratado con detergente para liberar el RNA
mediante sistemas automatizados, capaces genómico viral, y los oligonucleotidos
de mantener la identificación de la muestra específicos son hibridizados con el blanco y
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capturados en micropartículas magnéticas, los resultados de las pruebas de rutina
las cuales se separan del plasma en un requeridos y licenciados por la FDA. Se
campo magnético. En una segunda etapa, la realizarán esfuerzos para permitir la
amplificación mediada por transcripción liberación de todos los productos con base
(TMA), la cual utiliza dos enzimas para en los resultados de la prueba NAT, tan
producir amplicones ARN vía intermediar- pronto como sea posible. Sin embargo, en
ios ADN, es empleada para amplificar el esta fase, es posible que un componente
ARN blanco HIV-1/HCV. Finalmente, la positivo por NAT y negativo por las pruebas
detección se logra por hibridización de serológicas de rutina, sea liberado y
los ácidos nucleicos. Una sonda quimio- transfundido. Los centros de sangre deberán
luminescente, complementaria al amplicón, notificar y trabajar con los hospitales, con
es hibridizada a este y es detectada por un los pacientes que no estén hospitalizados y
luminómetro. En cada reacción se adiciona que se les facilita tratamiento y con los
un control interno para asegurar todas las médicos que indicaron la transfusión,
etapas del proceso. Si la prueba es positiva, inmediatamente después de los resultados
se realizan pruebas discriminatorias para positivos.
diferenciar entre los dos virus, HIV-1 y HCV, La implementación del NAT debe ser
con el mismo proceso. La duración total de discutida con los médicos y los clínicos que
la técnica es de aproximadamente 5 horas y ordenan transfusiones sanguíneas. Esto es
media. especialmente importante debido a que el
centro de sangre requerirá que el médico
Información a los donadores responsable sea notificado en las raras
de sangre situaciones en que el paciente ha sido
Los donadores de sangre son informados transfundido con un componente sero-
de la naturaleza investigativa de la prueba negativo que es reactivo por NAT y el
NAT, durante el proceso de consentimiento médico, a su vez, necesitará notificar tal
de rutina usado por los centros de sangre. El situación al paciente.
Investigational Review Board (IRB) de cada Cuando sea implementado, el NAT
institución se encarga de establecer los incrementará el costo de procesar una unidad
requerimientos específicos para el de sangre en un centro de donación.
consentimiento del donador. A los donadores Consistente con las reglas aplicadas a las
se les explica que ellos serán notificados de pruebas llevadas a cabo bajo los protocolos
resultados positivos o discrepantes, que las de investigación de drogas nuevas
unidades con resultados positivos no serán establecidas por la FDA, a los centros
utilizadas para transfusión y que a ellos se de donación que participen en estas
les puede pedir muestras adicionales como investigaciones les será permitido que
parte del estudio de seguimiento. recobren solamente los costos directos
incurridos a través de su participación
Liberación del producto sanguíneo e (America’s Blood Centres, 1999).
impacto en los hospitales y los
Barreras logísticas para la
pacientes
implementacion
La liberación de los componentes
La prueba de NAT utilizada en la
sanguíneos para transfusión estará basada en
donación sanguínea está todavía en estados
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tempranos de su desarrollo. Por razones de después de la centrifugación. Además, el
costo-efectividad, el sistema automatizado HCV puede unirse a los lípidos presentes
no permite ejecutar los ensayos en muestras en el plasma y ser descartado durante
individuales, así que inicialmente la prueba la decantación y etapas de lavado. Las
es llevada a cabo en mezclas de muestras de mezclas de menos de 50 muestras no
donadores. Lee y Allain (1998) señalan requieren de una etapa de concentración y
diversas limitaciones técnicas y económicas no desmejoran la sensibilidad del NAT,
del NAT que imponen cargas a los centros de mientras se utilicen técnicas de amplifi-
sangre: cación altamente sensibles.
(1) el NAT requiere personal entrenado en También inherente al uso de mezclas de
técnicas de biología molecular y también muestras está la formación de mezclas
requiere equipo que no es común en los de inhibidores endógenos, los cuales
bancos de sangre. potencialmente podrían inducir a resultados
negativos falsos. Se conoce poco acerca de
(2) La prevención de la contaminación tales inhibidores, pero se estima que su
cruzada de amplicones entre muestras prevalencia puede ser tan alta como 1%.
requiere que la preparación de reactivos, Un problema adicional con el uso de
manejo de las muestras, amplificación mezclas de muestras es la interpretación y
genómica y detección, sean llevados a disposición de aquellas que son positivas
cabo en cuartos separados, imponiendo en la prueba inicial, pero negativas en las
así limitaciones de espacio. pruebas secundarias de conjuntos más
pequeños. Este problema también se aplica a
(3) Los ensayos de NAT comercialmente mezclas que son positivas en la etapa inicial
disponibles requieren más tiempo que y en la prueba secundaria, pero son negativas
las pruebas actualmente utilizadas, un cuando son probadas individualmente.
esquema que significa una carga en el Aunque esto representa una gran carga
escrutinio de rutina de la sangre y logística y económica en los centros de
liberación del producto. sangre, es parte del protocolo de evaluación
en el diseño de investigación de drogas
(4) El costo de cada prueba de NAT nuevas. Lee y Allain (1998) indican que
comercial es aproximadamente 10 veces aproximadamente el 50% de las muestras
mayor que la prueba de EIA más cara. que son positivas en NAT son falsos
Trabajar con mezclas de plasmas será positivos (es decir, no hay donaciones
económico en la práctica; sin embargo, individuales positivas que puedan ser
se deben tomar en cuenta algunas identificadas).
consideraciones técnicas. Por ejemplo, el También asociado con el problema de
HCV circula a concentraciones de resultados discrepantes está la apropiada
solamente 104-105 genomas equivalentes distribución de las unidades dentro de una
por mililitro. Aunque algunos autores mezcla primaria positiva. Algunos de los
creen que los virus pueden ser concentra- centros de donación pueden no tener
dos usando ultracentrifugación previa al resultados de las pruebas dentro de las 24 a
NAT, diversos virus, incluyendo el HCV, 36 horas siguientes a la recolección de la
pueden no concentrarse en el botón sangre. Mientras la tecnología de NAT esté
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bajo investigación, la FDA ha acordado informen a sus usuarios de su participación
que las unidades de transfusión pueden ser en el estudio de investigación del NAT para
circuladas sin interrupción mientras tengan determinar el valor de estas pruebas como
las pruebas serológicas de rutina negativas. una herramienta de escrutinio de donadores.
Bajo estas circunstancias, algunas A la fecha, no hay datos que permitan
instituciones pueden recibir unidades no apoyar el uso del NAT como medio de
probadas por NAT. Los médicos pueden incrementar la seguridad de los suplementos
explicar a sus pacientes que la sangre que de sangre. Sin embargo, la FDA ha
ellos recibirán puede estar probada o no por cooperado con los bancos de sangre y ha
el NAT. Los médicos pueden discutir las fomentado su participación en los ensayos
implicaciones teóricas del NAT sobre la clínicos de esta tecnología poderosa y
seguridad de la sangre, pero deben continuar prometedora para el escrutinio de los
identificando los riesgos de enfermedades donadores de sangre. Conforme la
transmitidas por transfusión como resultado tecnología evolucione, la prueba NAT de
de los métodos de rutina licenciados. Los todos los componentes sanguíneos será
pacientes deben entender que hasta que la completada previo a la transfusión. La
fiabilidad del NAT sea establecida, los última meta es progresar desde analizar
riesgos asociados con enfermedades mini-mezclas, a analizar muestras
transmitidas por transfusión permanecerán individuales, pero parece que este cambio
iguales. El NAT puede incrementar el tiempo llevará varios años. Las futuras aplicaciones
de circulación para probar y etiquetar los de la tecnología NAT pueden incluir
componentes sanguíneos que serán enviados plataformas que permitan una detección
a los servicios de transfusión. Los costos directa de otros virus (por ejemplo el virus
asociados al NAT pueden aumentar el precio de la hepatitis B, el parvovirus B-19 y el
de los componentes sanguíneos. citomegalovirus) y otros agentes infecciosos
como Trypanosoma, Babesia y las especies
de Plasmodium (Chamberland, 2001).
Beneficios potenciales del NAT En resumen, el NAT puede disminuir la
El NAT podría acortar el período de posibilidad de transfundir una unidad
ventana en la detección de HIV de 16 días a durante el período de ventana virémico, al
aproximadamente 10 días, al igual que el detectar presencia de HIV y/o HCV más
período de ventana del HCV de 70-80 días a temprano: disminuye el período de ventana
aproximadamente 10-30 días. Esto podría virémico del VIH en 30-50%, y del HCV en
reducir el riesgo de HCV transmitida por 50-98%.
transfusión de aproximadamente 1 en
100.000 unidades transfundidas a 1 en
500.000-1.000.000 unidades transfundidas Referencias
(NAT Implementation, 1999; Shapiro, America’s Blood Centers. (1999) Nucleic
1999). Sin embargo, las restricciones acid amplification technology (NAT):
regulatorias no permiten aumentar la testing blood donors. ABC Blood Bulletin
seguridad por el uso del NAT mientras esté 1, 1-9.
bajo el protocolo de investigación de droga Chamberland, M. (2001) Emerging
nueva. La FDA ha dicho informalmente infectious disease issues in blood safety.
que permitirá que los centros de sangre CDC 7, 1-8.
68 Rev. Col. de MQC de Costa Rica (2002) vol. 8 número 3
Lee H.H. y Allain, J.P. (1998) Genomic Introducción
screening for blood borne viruses in En el mundo actual existen presiones
transfusion settings. Vox Sang. 74, 119- opuestas en el ámbito público y privado para
123. reducir costos y al mismo tiempo mejorar la
American Association of Blood Banks calidad del servicio brindado. Ello implica
(1999) NAT implementation. American un gran reto para las organizaciones en
Association of Blood Banks Bulletin No. salud, que requieren adoptar nuevos sistemas
99-3. para alcanzar los índices de calidad deseada.
Shapiro, A. (1999) Nucleic acid amplifica- El laboratorio clínico debe implantar un
tion (NAT). Transfusion Medicine Update proceso de mejoramiento continuo de la
(May), 1-5. calidad que implica: planeamiento, diseño
Treat, M., Leparc, G. y Benson, K. (2000) del proceso, ejecución del proceso, control
Nucleic acid amplification testing: the de calidad, evaluación y medidas correctivas,
new infectious disease testing method for etapas que se retroalimentan cíclicamente.
donor blood. Cancer Control Journal 6, 1 En el proceso deben definirse metas
-8. objetivos y requerimientos para la calidad
(Lehmann, 1998).
Todas las corrientes actuales de
-o-o-o-o-o-o- globalización requieren de la
implementación de técnicas de calidad total,
las cuales han llevado a la necesidad de
Análisis del Desempeño instaurar procesos de acreditación que
garanticen la calidad de los servicios a los
según Sistema Analítico en usuarios (Jasen et al., 1997).
el Programa de Evaluación En la acreditación del Laboratorio
Clínico, las entidades externas evalúan y
Externa de la Calidad dan fe de que el servicio cumple con los
en Lípidos y Glucosa requerimientos de una determinada norma.
La mayoría de las normas (ISO-17.025,
(año 2001) Colegio Americano de Patólogos,
Confederación Latinoamericana de Química
Dra. Marianela Vargas1 Clínica [COLABIOCLI], redes de los
Dra. Sara Rodríguez2 Centers for Disease Control and Prevention
Dra. Louella Cunningham2 (CDC), Colegio de Microbiólogos y
Químicos Clínicos de Costa Rica y otros)
1Departamento de Análisis Clínicos, Fac. de exigen, además de un programa de control
Microbiología, Universidad de Costa Rica interno de calidad, la participación del
✉ mvargasu@[Link] laboratorio en un programa de evaluación
externa del desempeño, el cual evalúa en
2Centro de Referencia de Lípidos, Instituto forma objetiva los resultados de encuestas
Costarricense de Investigación y Enseñanza periódicas interlaboratoriales. Muchos
en Nutrición y Salud (INCIENSA) errores sistemáticos no detectables en el
✉ srodriguez@[Link] control interno de calidad son revelados
✉ lcunningham@[Link] únicamente mediante la evaluación externa
de la calidad (Hirst, 1992). Es así como los