2009

DESARROLLO DE UN SISTEMA DE
ENVASADO ACTIVO: BIOPELÍCULAS
DE PROTEÍNAS LÁCTEAS PARA UN
DESARROLLO SOSTENIBLE
 Índice

Autores Resumen 5

Marina Patricia Arrieta

1. Introducción 5
MSc. en Tecnología de los Alimentos
Jefe de Trabajos Prácticos y Miembro Investigador 2. Objeto y Alcance 6
Facultad de Ciencias Agropecuarias
Universidad Católica de Córdoba, Argentina 3. Materiales y Metodología 6
3.1. Materiales 6
Mercedes Ana Peltzer
Dra. en Química
3.2. Preparación de las muestras 6
Investigadora Contratada Doctora 3.3. Caracterización térmica 7
Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología
3.3.1. Análisis termogravimétrico (TGA) 7
Facultad de Ciencias
Universidad de Alicante, España 3.3.2. Calorimetría diferencial de barrido (DSC) 7
3.4. Caracterización estructural y superficial 7
Maria Del Carmen Garrigos Selva 3.4.1. Espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) 7
Dra. en Química
Profesora Ayudante Doctora 3.4.2. Microscopia electrónica de barrido (SEM) 8
Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología 3.5. Caracterización colorimétrica 8
Facultad de Ciencias
Universidad de Alicante, España
3.6. Propiedades mecánicas 8
3.7. Propiedades de barrera al oxígeno 9
Alfonso Jimenez Migallon 3.8. Estudio de la actividad antimicrobiana de las biopelículas 9
Dr. en Ciencias Químicas
Profesor Titular de Universidad
3.9. Estudio de la influencia del tiempo de almacenamiento 9
Director del grupo de investigación “Análisis de Polímeros y Nanomateriales” 3.10. Estudio de la biodegradabilidad de las biopelículas 10
Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología 3.11. Plan de trabajo 10
Facultad de Ciencias
Universidad de Alicante, España 3.11.1. Cronograma 11
4. Resultados 12
4.1. Caracterización de los materiales de partida 12
4.1.1. Caracterización térmica 12
4.1.2. Espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier (FTIR) 13
5. Obtención de las biopelículas 15
5.1. Optimización del método de obtención de las biopelículas 15
5.2. Preparación de las biopelículas 15
6. Caracterización completa de las biopelículas obtenidas 15
6.1. Caracterización estructural de las biopelículas 15
6.1.1. Espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR)
de las biopelículas 15
Esta investigación ha sido financiada por Fundacion mapfre en la Convocatoria Ayuda a la Investigación 2008. 6.1.2. Microscopia electrónica de barrido (SEM) de las biopelículas 17
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6.2. Caracterización térmica de las biopelículas 18 Resumen La transparencia, biodegradabilidad y buenas propie-
dades de barrera al oxígeno y al dióxido de carbono
6.2.1. Análisis termogravimétrico (TGA) de las biopelículas 18 En este trabajo se ha desarrollado un sistema de enva- hacen de las películas de caseína materiales innovadores
6.2.2. Calorimetría diferencial de barrido (DSC) de las biopelículas 19 sado activo basado en biopelículas de caseinato de sodio para su uso en el envasado de alimentos. Sin embargo,
y de calcio con adición de un plastificante y un agente los materiales basados en caseína poseen dos desventa-
6.3. Caracterización óptica de las biopelículas 20 activo. Para ello, se utilizó glicerol como plastificante en jas en comparación con otras películas en base proteica:
6.4. Caracterización mecánica de las biopelículas 21 distintas proporciones: 0%, 15%, 25% y 35% en peso con propiedades dúctiles limitadas y alta sensibilidad al vapor
de agua [2,3]. Para solucionar estos inconvenientes es
6.5. Propiedades de barrera al oxígeno 21 respecto a la proteína empleada como polímero base.
Como agente activo se utilizó carvacrol debido a sus pro- necesario utilizar plastificantes para mejorar su flexibilidad.
6.6. Estudio de la actividad antibacteriana de las biopelículas 22 piedades antimicrobianas en una concentración inicial de Los plastificantes reducen la catidad de enlaces de hidró-
6.7. Estudio de la influencia del tiempo de almacenamiento 22 10% en peso en relación a la cantidad de proteína. Una geno entre las distintas cadenas moleculares, aumentando
vez obtenidas las biopelículas, se estudiaron sus propie- así los espacios intermoleculares y causando un incre-
6.7.1. Estudio de la actividad antibacteriana de las biopelículas dades estructurales, térmicas, mecánicas, ópticas, de ba- mento en las propiedades dúctiles del material por un
durante el almacenamiento 23 rrera al oxígeno, antimicrobianas así como su biodegrada- descenso de su rigidez, aunque también pueden disminuir
6.7.2. Caracterización mecánica de las biopelículas durante el almacenamiento 23 ción. sus propiedades de barrera debido a un incremento en el
Se obtuvieron películas translúcidas con microestruc- volumen libre. Los plastificantes más habituales para este
6.8. Estudio de la biodegradabilidad de las biopelículas 24 tura homogénea, con buena dispersión de los aditivos en tipo de materiales son los polioles, azúcares o almidones,
la matriz polimérica. El aumento en la proporción de plas- debido a su compatibilidad con las proteínas y su capaci-
7. Discusión 24 tificante o de carvacrol mejoró la flexibilidad de las biope- dad para favorecer la elasticidad y flexibilidad de las bio-
lículas reduciendo su fragilidad. Las biopelículas conte- películas obtenidas [3].
8. Conclusiones 26 niendo carvacrol presentaron propiedades antimicrobianas Los envases antimicrobianos son considerados uno
incluso tras 21 días de almacenamiento a 25 ºC y 50 % de de los sistemas de envasado activo más prometedores, al
inhibir la acción de los microorganismos causantes de la
9. Bibliografía 26 humedad relativa, mostrando excelentes propiedades de
barrera al oxígeno así como una rápida degradación física contaminación de los alimentos [4]. Las bacterias son, sin
en condiciones de compostaje, lo que contribuye a reducir duda, el grupo más importante de microorganismos aso-
de forma significativa el impacto medioambiental. ciados con los alimentos, tanto por lo que se refiere a la
A partir de los resultados obtenidos, se puede concluir potencial transmisión de enfermedades como a las altera-
que la mejor formulación correspondió a las biopelículas ciones que son capaces de provocar en los propios ali-
de caseinato de sodio con 35% de glicerol y 10% de car- mentos [5]. Los envases activos antimicrobianos son sis-
vacrol (NaCas-G35%-CV10%) ya que permitieron obtener temas capaces de controlar la descomposición
la mejor relación entre sus propiedades y la sostenibilidad microbiológica de productos perecederos [6].
medioambiental inherente a este tipo de materiales. Los aceites esenciales extraídos de plantas se utilizan
principalmente como fragancias o para dar sabores, pero
PALABRAS CLAVES: caseinato de sodio, caseinato en la actualidad han cobrado un nuevo interés centrado al
de calcio, glicerol, carvacrol, biopelículas, biodegrada- ser ricos en compuestos bioactivos con propiedades anti-
ción. microbianas [7]. En concreto, se deben citar los aceites
esenciales de orégano (carvacrol y timol); clavo (eugenol)
canela (cinamaldehido y eugenol) y romero (ácido carnó-
1. Introducción sico y carnosol). Varios de estos compuestos como el car-
vacrol y el timol han demostrado poseer también un efecto
El creciente interés en el desarrollo de productos alimen- sinérgico en sus propiedades, potenciando su capacidad
ticios de alta calidad, con mayor vida útil y con un impacto como antioxidantes [8]. Algunos investigadores han adi-
ambiental reducido ha fomentado el estudio y desarrollo cionado con éxito aceites esenciales de orégano a distin-
de films y revestimientos basados en biopolímeros [1], que tas matrices poliméricas: películas preparadas a base de
son producidos principalmente a partir de recursos reno- quitosano, carboximetil-celulosa y caseína, enriquecidas
vables, como la caña de azúcar, proteínas y almidones. con oleorresinas conteniendo orégano y carvacrol [9]; car-
Estos materiales son utilizados para distintas aplicaciones vacrol en polietileno de alta densidad [10], en biopolíme-
y se caracterizan por un consumo total de energía menor ros basados en proteína del suero lácteo [4] y en envases
que sus homólogos petroquímicos y un menor efecto basados en proteína de soja [11]; timol a policaprolactona
sobre el medio ambiente [2]. [12] entre otros. En el presente trabajo se eligió utilizar el
Los productos lácteos contienen muchos compuestos carvacrol como agente bioactivo debido a sus conocidas
diferentes con propiedades funcionales adecuadas y al- propiedades antimicrobianas frente a un amplio espectro
gunos de ellos, como la caseína, se han utilizado amplia- de microorganismos [13]. Los aceites esenciales y sus
mente en diversas aplicaciones. Así, por ejemplo, la ca- componentes, como el carvacrol, están clasificados como
seína actualmente se utiliza como adhesivo, para aromatizantes según la Decisión de la Comisión Europea
revestimientos, encolados, fibra textil, acabado del cuero, 2002/113/CE y, además son reconocidos como seguros al
industria papelera o en el envasado como biopelículas [3]; ser clasificados como GRAS (Generally Recognized As
entre otras aplicaciones. Safe) por la FDA (Food and Drug Administration) [10].
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El diseño de un sistema de envasado activo permite -- Glicerol anhidro pureza 99,5% (Fluka, Madrid, España) Se prepararon biopelículas con y sin agente antimi- oxidante de oxígeno (caudal de 50 mL min-1), con el fin de
reducir la cantidad de aditivos alimentarios, y de esta -- Carvacrol pureza 98% (Sigma Aldrich, Móstoles, Es- crobiano. En el primer caso, se agregó la cantidad de determinar el residuo inorgánico en cada una de las for-
forma poder comercializar alimentos libres de aditivos sin- paña) carvacrol necesaria para obtener una relación mulaciones.
téticos. Las biopelículas comestibles derivadas de los ca- -- Agua destilada proteína:antimicrobiano: 1:0,10; con posterior agitación
seinatos pueden reemplazar potencialmente a algunos En la Tabla I se especifican los microorganismos que continua durante 3 minutos a 1000 rpm. 3.3.2. Calorimetría diferencial de barrido (DSC)
polímeros sintéticos utilizados en el envasado de alimen- se han empleado para los ensayos bacteriológicos mien- Una vez preparadas las soluciones formadoras de bio- Esta técnica se basa en el registro de la energía necesaria
tos, debido a la similitud en sus propiedades con el aña- tras que en la Tabla II se muestran los reactivos utilizados películas, se colocaron 30 mL de cada disolución en cáp- para establecer una diferencia de temperatura nula entre
dido de su naturaleza renovable y biodegradable [14]. para el diagnóstico bacteriológico. sulas de Petri de polietileno (15 cm de diámetro) y poste- la muestra y un material inerte de referencia sometidos
Además, los costes de producción de este tipo de biopo- riormente se secaron a 25 ºC y 50 % de humedad relativa ambos al mismo programa de temperaturas. La diferencia
Tabla I. Bacterias indicadoras utilizadas (Colección Española de cul-
límeros se encuentran en condiciones de entrar en com- tivos Tipo (CECT) de la Universidad de Valencia). durante 48 horas. de energía registrada por el instrumento es equivalente a
petencia comercial con los polímeros de uso común, como la energía térmica absorbida o disipada en el curso de
las poliolefinas o el PVC. Bacteria Número ATCC
una transición por parte del material. En ese momento se
En resumen, estos nuevos materiales constituyen sis- 3.3. Caracterización térmica
E. coli 25922 registran los desplazamientos desde la línea base en el
temas de envasado innovadores con un elevado potencial La caracterización térmica y algunos aspectos de la ca- termograma para dicha transición, cuya área es proporcio-
comercial capaces de permitir la incorporación de aditivos S. aureus 25923
racterización estructural de los materiales plásticos se nal a la variación entálpica asociada [16]. Los cambios en
activos con características antimicrobianas y que a su vez suele llevar a cabo con el uso de las técnicas de análisis la temperatura de la muestra son debidos a transiciones
representan una importante reducción en el impacto Tabla II. Reactivos para el diagnóstico bacteriológico (Insulab).
térmico, las cuales permiten evaluar ciertas propiedades entálpicas, endotérmicas o exotérmicas, y se relacionan
medioambiental causado por los residuos procedentes de físicas y químicas de una muestra cuando es sometida a con cambios estructurales o de fase en el material. Entre
Reactivo Composición (g/L) Presentación
los envases alimentarios. Esta es la razón de su estudio en un programa de temperaturas. Mediante el empleo de di- los procesos físicos con transiciones de fase endotérmicas
el presente proyecto. Peptona de caseína (10,0); chas técnicas se pueden identificar numerosos procesos se incluyen la fusión, vaporización, sublimación y desor-
Tampón Cloruro Sódico (5,0); relacionados con alguna característica del material [15]. ción. La absorción y adsorción suelen ser procesos endo-
Peptona Fosfato disódico (12); Tubo 10 mL
Así, el estudio del comportamiento de las biopelículas a
2. Objeto y Alcance Agua Agua (9,0);
térmicos, mientras que las transiciones cristalinas pueden
altas y bajas temperaturas, la determinación de paráme- ser tanto exotérmicas como endotérmicas, aunque lo más
Fosfato Potásico (1,5)
El objetivo principal del presente proyecto es el desarrollo tros clave para describir los cambios estructurales en los habitual en polímeros es que los procesos de cristalización
Peptona de caseína (17,0); materiales durante el procesado y la adición de los dife-
de un material activo antimicrobiano biodegradable y sos- impliquen un cambio energético de carácter exotérmico.
Caldo Peptona de Soja (3,0);
tenible con el medio ambiente para el envasado de ali- rentes componentes de las formulaciones se llevó a cabo Estos ensayos se llevaron a cabo utilizando un calorí-
Triptona Cloruro Sódico (5,0); Tubo 9 mL
mentos. En concreto, se obtendrán biopelículas en base mediante las técnicas de análisis térmico que se descri- metro DSC Q-2000 V23.12 Build 103 de TA Instruments
Soja Fosfato Potásico (2,5);
proteína láctea (caseinatos), adicionando un plastificante D (+) Glucosa. ben brevemente a continuación. (New Castle, DE, USA). Todos los ensayos fueron realiza-
(glicerol) y un compuesto con características antimicrobia- dos entre -90 ºC y 150 ºC, a una velocidad de calenta-
Extracto de carne (1,0);
nas (carvacrol), ambos de origen natural. Para ello, será miento de 10°C min-1 durante la primera etapa del calen-
Extracto de levadura (2,0); 3.3.1. Análisis termogravimétrico (TGA)
necesaria la formulación y caracterización completa de los Agar Placa de tamiento con posterior enfriamiento hasta -90 ºC y una
Peptona (5,0); La termogravimetría es una técnica analítica que deter-
Nutriente Petri segunda etapa de calentamiento hasta 180 ºC, siempre a
materiales obtenidos, así como la evaluación de su activi- Cloruro de Sodio (5,0); mina la pérdida de peso de una muestra en función de la
dad antimicrobiana. Agar (15,0) la misma velocidad. Los ensayos se realizaron en atmós-
temperatura o el tiempo, lo que permite asociar dichos
Este objetivo general, se pueden desglosar en los si- fera inerte de nitrógeno (50 mL min-1).
Hidrolizado de caseína (17,5); cambios a determinados procesos de degradación. La
guientes objetivos específicos: Agar
Infusión de carne (2,0); Placa de medición se lleva a cabo en atmósferas perfectamente
Mueller
-- Caracterización de los materiales de partida (glicerol, Almidón (1,5); Petri
Hinton definidas, habitualmente nitrógeno (condiciones inertes) o 3.4. Caracterización estructural y superficial
carvacrol, caseinato de sodio y caseinato de calcio). Agar (17,0)
bien en aire u oxígeno (condiciones oxidativas). La masa
-- Obtención de biopelículas de caseinatos modificadas Los ensayos de caracterización estructural se utilizan para
de la muestra sometida a un programa de temperaturas
con estos aditivos. conocer en detalle las modificaciones en la estructura quí-
queda registrada por una balanza de alta sensibilidad en
-- Caracterización completa de las biopelículas obtenidas. 3.2. Preparación de las muestras mica de los materiales empleados, así como los cambios
cada instante [15]. Ésta es una de las principales técnicas
-- Evaluación de la actividad antimicrobiana de las bio- Las películas fueron preparadas disolviendo 5 g (con pre- producidos tras la adición de diferentes componentes o
que se utilizan en el análisis de polímeros, sobre todo para
películas. cisión de 0,0001g) de proteína láctea (caseinato de sodio bien tras las diversas etapas por las que transcurre du-
estudiar el comportamiento a altas temperaturas, y se han
-- Estudio de la influencia del tiempo de almacena- o caseinato de calcio) en agua destilada y calentando rante su procesado o vida útil. Además, permiten compro-
descrito un amplio número de aplicaciones en numerosos
miento. hasta 65 ºC para facilitar su solubilización. Posteriormente, bar la ausencia de separación de fases y consiguiente
materiales: comparación de estabilidades térmicas relati-
-- Estudio de la biodegradabilidad. se homogeneizó la mezcla bajo agitación continua durante homogeneidad de los materiales. En el presente trabajo se
vas, efecto de los aditivos en la resistencia térmica del
10 minutos a 1100 rpm con un agitador magnético (SBS polímero, estudios sobre cinéticas de degradación, etc. estudió la homogeneidad de los materiales obtenidos em-
pleando las técnicas de caracterización estructural que se
3. Materiales y Metodología Magnetic Stirrer). Con el fin de conocer su comportamiento a altas tem-
describen a continuación.
Tras la disolución total del polímero se dejó enfriar la peraturas y su resistencia a la degradación térmica se
solución a temperatura ambiente y se añadió la cantidad estudió mediante TGA la estabilidad térmica de todos los
3.1. Materiales
requerida de glicerol anhidro para obtener las siguientes materiales de partida y de las biopelículas desarrolladas. 3.4.1. Espectroscopia infrarroja por transformada de
Los materiales utilizados para la elaboración de las biope- relaciones proteína:plastificante, 1:0; 1:0,15; 1:0,25; Para ello, se realizaron los ensayos en modo dinámico Fourier (FTIR).
lículas desarrolladas en el presente trabajo se indican a 1:0,35. Una vez incorporado el plastificante, se homoge- utilizando una termobalanza TGA/SDTA 851e Mettler To- La espectroscopia de infrarrojo (IR) es una técnica muy
continuación: neizaron las soluciones durante 3 minutos con agitación ledo (Schwarzenbach, Suiza) con un programa de tempe- empleada para la caracterización estructural de polímeros
-- Caseinato de sodio (Lote STD: 11868 - Ferrer Alimen- a 1100 rpm y por último se sometieron a un tratamiento raturas entre 30-700 ºC a una velocidad de 10 ºC min-1 en y está basada en las vibraciones de los átomos y grupos
tación S.A.) en baño de ultrasonidos durante 10 minutos para eliminar atmosfera inerte de nitrógeno (caudal de 50 mL min-1). funcionales en las moléculas a causa de su interacción
-- Caseinato de calcio (Lote A: 11866 - Ferrer Alimenta- las burbujas de aire que pudieran haber quedado en di- Para el caso de las biopelículas, se incluyó una etapa con la radiación emitida en la región infrarroja del espectro
ción S.A.) solución. adicional a partir de 700 ºC y hasta 900 ºC en atmósfera electromagnético. El espectro infrarrojo se obtiene ha-
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ciendo pasar a través de la muestra una radiación de la un detector de rayos X tipo UHV Dewar Si(Li) de Bruker -- Resistencia máxima a la tracción (σm) como el máximo de la velocidad con que las moléculas atraviesan el film
longitud de onda adecuada y determinando qué fracción para microanálisis (EDS), capaz de detectar elementos de de la curva para cada material. polimérico.
de la energía incidente es absorbida a causa de los dife- número atómico comprendido entre los del carbono y el -- Deformación en la rotura del material y tensión en el En el presente trabajo se utilizó un analizador de per-
rentes movimientos moleculares. La energía a la que apa- uranio. Se utilizó una aceleración electrónica de 10kV. punto de rotura (εr, σr) meación de oxígeno de Systech Instruments modelo 8500
rece un pico en un espectro de absorción corresponde a (Metrotec S.A, España). Se determinó la velocidad de
la frecuencia de vibración de uno o varios grupos funcio- transmisión de oxígeno (OTR) a través de las biopelículas
3.5. Caracterización colorimétrica
nales de la molécula [17] e implica la absorción de una hasta alcanzar el estado estacionario en cada caso. Las
cierta cantidad de energía de la radiación incidente. La determinación del color de un material mediante el uso muestras preparadas como biopelículas circulares de 14
En el presente trabajo, se utilizó la técnica de espec- de técnicas espectrofotométricas permite conocer las va- cm de diámetro, las cuales se colocaron en la cámara de
troscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) riaciones en su coloración según la formulación, lo cual es difusión separando sus dos compartimentos. En el supe-
para caracterizar los grupos funcionales y poder observar un parámetro muy importante en materiales que vayan a rior se introdujo oxígeno puro y en el inferior se circuló una
los posibles cambios causados por las interacciones entre ser utilizados en envasado de alimentos. corriente de nitrógeno. En este último se cuenta con un
los distintos componentes de la mezcla. El instrumento El instrumento utilizado en el presente trabajo fue un sensor de oxígeno, de forma que se puede registrar un
utilizado fue un espectrofotómetro infrarrojo Bruker Analitik espectrofotómetro KONICA CM-3600d COLORFLEX- valor de velocidad de transmisión por unidad de superficie
IFS 66 (Ettlingen, Alemania), que dispone de una fuente de DIFF2, HunterLab, Hunter Associates Laboratory, Inc, y de tiempo. Para poder comparar los resultados de las
IR medio con un rango de trabajo entre 9000-100 cm-1, un (Reston, Virginia, USA); el cual permite la medida del color muestras entre sí, se midió el espesor promedio de cada
divisor de haz de KBr y un detector DTGS. Las medidas por reflexión y por transmisión. Los valores obtenidos por una de las biopelículas y se multiplicó por el valor regis-
se llevaron a cabo en modo reflectancia total atenuada el equipo se dan en las coordenadas del espacio colori- trado por el equipo. Las determinaciones se realizaron por
(ATR) utilizando un accesorio Golden Gate con cristal de métrico CIELAB formado por un sistema cartesiano defi- Figura 1. Representación cualitativa de un diagrama tensión vs de- duplicado en todos los casos.
formación de un polímero.
diamante, que permite el análisis directo de la muestra sin nido por tres coordenadas que describen el color de un
necesidad de preparación previa. Los espectros se regis- objeto. Así, L* indica la luminosidad, es decir la cantidad Las propiedades mecánicas a tracción de las distintas 3.8. Estudio de la actividad antimicrobiana de las bio-
traron en el intervalo de números de onda comprendido de luz percibida que refleja o transmite un material y biopelículas obtenidas se estudiaron de acuerdo a la películas
entre 600 y 4000 cm-1, utilizando una muestra con un ta- puede tomar valores entre 0 y 100; a* indica la saturación norma ASTM D882-91-01 [19]. Para ello se utilizó una má-
maño aproximado de 5 mm2. Para el registro de fondo y el o desviación del punto acromático de L* hacia el rojo o quina de ensayos universales Single Column System Ins- A partir de la caracterización llevada a cabo se seleccio-
de las muestras se utilizaron 64 barridos y una resolución hacia el verde (si a* > 0 hacia el rojo y si a* < 0 hacia el tron Instrument Modelo 3344 (Fareham Hants, UK) equi- naron las formulaciones óptimas, de las cuales se deter-
de 4 cm-1, obteniéndose los espectros de absorbancia en verde); y b* es el ángulo de tono que define la desviación pada con una célula de carga de 2 kN. Las probetas minó su actividad antimicrobiana mediante la realización
función del número de onda (cm-1). de L* en el eje amarillo y/o azul (si b* > 0 hacia el amarillo utilizadas se cortaron en forma rectangular con dimensio- de ensayos microbiológicos simples y rápidos. Existen una
y si b* < 0 hacia el azul). nes 10 x 100 mm, y se colocaron en la máquina con una serie de microorganismos llamados marcadores cuya pre-
3.4.2. Microscopia electrónica de barrido (SEM). distancia entre mordazas de 50 mm, siendo sometidas a sencia en los alimentos advierte sobre una inadecuada
Para estudiar la morfología de la superficie y las secciones una velocidad de elongación de 25 mm min-1. Para cada manipulación de la materia prima o eventual contamina-
3.6. Propiedades mecánicas
al corte transversal de las biopelículas obtenidas se em- formulación se realizaron 5 repeticiones del ensayo. La ción, con la consiguiente existencia de un peligro para la
pleó la microscopía electrónica de barrido (SEM). Esta Las propiedades mecánicas de un material se refieren a ductilidad de las muestras se analizó mediante la determi- salud del consumidor [20].
técnica permite el análisis microscópico de los polímeros su respuesta cuando se ve sometido a una fuerza ex- nación del módulo de Young (MPa) y del porcentaje de En el presente trabajo, la actividad antimicrobiana de
con muy alta resolución y se basa principalmente en un terna, la cual se puede relacionar con la deformación que deformación (ε%). las biopelículas seleccionadas se evaluó mediante el mé-
bombardeo de electrones de alta energía que forman un llega a sufrir [18]. De los diferentes ensayos existentes todo de difusión de disco descrito por el Laboratorio Inter-
haz de pocos nanometros de diámetro que barre la super- para esta determinación, el más empleado es el ensayo nacional de Referencia: National Committee for Clinical
ficie del material formando una imagen con los electrones de tracción en una dimensión, el cual permite evaluar las 3.7. Propiedades de barrera al oxígeno Laboratory Standards (NCCLS) [21]. De esta manera se
secundarios que se generan en la interacción de la radia- propiedades más relevantes del material cuando se pre- Una de las propiedades más importantes cuando se trata llevaron a cabo ensayos por contacto directo entre la bio-
ción electrónica con una capa superficial y fina de la tende estudiar los cambios en su ductilidad, permitiendo de diseñar un sistema para envasado de alimentos es la película y el medio de cultivo inoculado, con una concen-
muestra. Mediante un detector apropiado se registra el evaluar de forma precisa su capacidad para soportar es- permeabilidad a los gases, en particular al oxígeno. Este tración inicial de microorganismo de 106 UFC mL-1, a una
resultado de esta interacción para dar imágenes topográ- fuerzos y deformaciones sin que se vea alterado. La infor- gas es capaz de participar en reacciones químicas perju- temperatura de 37 ºC durante 24 horas y en condiciones
ficas en dos dimensiones. Incluso, en ciertos casos, per- mación que suministra el ensayo de tracción es muy com- diciales para los alimentos y por eso su presencia debe de esterilidad.
mite registrar imágenes en tres dimensiones [17]. pleta ya que permite cuantificar la respuesta elástica y estar limitada por el material de envase en la mayor parte Para el presente estudio se seleccionaron dos bacte-
Para poder observar la imagen de una muestra en un plástica del material a través de sus propiedades resis- de los casos. rias indicadoras susceptibles de estar presentes en los
microscopio electrónico de barrido ésta debe ser conduc- tentes, como el módulo elástico de Young (E) y las dúcti- Para la determinación de la velocidad de transferencia alimentos: Staphylococcus aureus y Escherichia coli. E.
tora. Como los polimeros no son buenos conductores, las les: porcentaje de deformación a la rotura (εB%), permi- de cualquier gas a través de una película de un material coli sugiere contaminación de origen fecal, mientras que
muestras fueron cortadas en piezas de 1 cm2 y recubiertas tiendo obtener la curva tensión (σ) – deformación (ε) polimérico se debe tener en cuenta la segunda ley de Fick S. aureus se relaciona con la piel, las mucosas y el tracto
de una fina capa de oro con un espesor comprendido (Figura 1) donde se registra el esfuerzo aplicado en fun- (Ecuación 1). respiratorio de los animales y el hombre [20], siendo un
entre 10 y 25 nm. Para ello, se utilizó un metalizador / ción de la deformación del material, que aumenta a velo- microorganismo muy útil como indicador de una inade-
evaporador BALZERS modelo SCD 004 (Balzers, Lie- cidad constante. Q = D A t (c1-c2) / e cuada manipulación.
chtenstein) de bajo vacío. A partir de las gráficas tensión-deformación como la Ecuación 1. Segunda ley de Fick.
Una vez preparadas las muestras se realizaron micro- mostrada en la Figura 1 se pueden determinar los siguien-
3.9. Estudio de la influencia del tiempo de almacena-
fotografías de las mismas a magnificaciones de 500x y tes parámetros: Esta ecuación relaciona la cantidad de gas que atra-
miento
1000x. Se utilizó un microscopio electrónico de barrido -- En la parte inicial de la curva se cumple la relación viesa el material (Q) con el área de la película (A), el
JEOL modelo JSM-840 (Tokio, Japón), que consta de un lineal: E = σ/ε, donde E es el módulo de elasticidad de tiempo de contacto (t), la diferencia de concentración de Las proteínas constituyentes de las biopelículas pueden
detector de electrones secundarios tipo centelleador-foto- Young, que es la pendiente de esta parte de la curva; permeante entre las dos caras de la película (C1-C2) y su verse afectadas en gran medida por las condiciones de
multiplicador con resolución 4 nm, un detector de electro- y E0 el modulo inicial de la curva, siendo E0 = (dσ/dε) espesor (e). El coeficiente de difusión (D) se considera almacenamiento. Por ello, se realizó un estudio de la in-
nes retrodispersados tipo Si P-N con resolución 10 nm y para ε= 0. como una constante de proporcionalidad y es una medida fluencia del tiempo de almacenamiento de las biopelículas
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con el fin de definir y delimitar sus condiciones de aplica- En el reactor se introdujeron las muestras cortadas en 3) Obtención de biopelículas de caseinato de sodio y miento mediante ensayos mecánicos y microbiológicos
bilidad para envasado alimentario y conocer si mantienen piezas rectangulares (2 x 3 cm2), poniendo cada trozo en calcio: periódicos en condiciones controladas de humedad y tem-
sus propiedades con el tiempo. un contenedor de malla de acero inoxidable para permitir Para la formulación de las biopelículas se optimizó la con- peratura.
Se seleccionaron las biopelículas que presentaron me- el contacto directo con el suelo y una fácil recuperación centración de plastificante, de forma que se obtuvieran
jores características y se almacenaron en una cámara cli- del material para su inspección visual a diferentes tiempos materiales con buenas propiedades para su aplicación en 7) Estudio de la biodegradabilidad de las biopelículas
mática a 25 ºC y 50 % de humedad relativa. Posterior- de ensayo. Dichas mallas de acero conteniendo las mues- envasado de alimentosl. Se prepararon biopelículas por óptimas obtenidas:
mente se fueron retirando de la cámara climática para su tras se enterraron a una profundidad de 8 cm, basándose disolución y posterior evaporación del disolvente (casting) A partir de los resultados obtenidos en los apartados ante-
análisis a diferentes tiempos: 7, 14, y 21 días, llevándose en trabajos anteriores [23]. Se prepararon tres reactores, con y sin la adición del agente antimicrobiano, de forma riores, se seleccionó la mejor formulación que representara
a cabo los mismos ensayos antimicrobianos comentados retirándose una muestra de cada uno de ellos para poder que pudieran compararse los resultados frente a muestras un mejor compromiso entre las propiedades mecánicas y
en el apartado anterior para comprobar si las biopelículas realizar ensayos por triplicado a los distintos tiempos de de referencia. Para ello, se disolvió la proteína en la canti- su acción antimicrobiana. Se estudió la biodegradabilidad
conservan o pierden su capacidad antimicrobiana en el reacción: 10 min, 25 min, 80 min, 120 min, 240 min y 300 dad necesaria de agua para que el peso final fuera 100g de estos materiales, con el fin de comprobar su contribu-
tiempo mencionado. Asimismo, y para evaluar un posible min. con posterior adición del plastificante en la proporción co- ción a un menor impacto medioambiental.
cambio en la respuesta elástica y plástica del material, se rrespondiente a cada material. En las muestras con agente
Tabla III. Características del compost utilizado.
estudiaron también sus propiedades mecánicas a tracción antimicrobiano (carvacrol), éste fue añadido en último 3.11.1. Cronograma (realizado durante el periodo de
comentadas en el apartado 3.6. Enmienda Orgánica Húmica (Femabon) lugar. Finalmente, se tomó una porción de la disolución en Abril de 2010 a Enero de 2011).
Materia Orgánica Total 25 % el recipiente adecuado para dejar evaporar el disolvente,
3.10. Estudio de la biodegradabilidad de las biopelículas bajo condiciones controladas de temperatura y humedad Actividad Abr May Jun Jul Ago
Extracto Húmico Total 7,5 %
relativa. Busqueda
A partir de los resultados obtenidos en los apartados an- Ácidos Húmicos 5,5 % x x x x x x x x x x
Bibliográfica
teriores se evaluó la mejor formulación, teniendo en cuenta
Humedad máxima (para polvo) 40 % 4) Caracterización completa de las biopelículas obtenidas: Caracterización de los
las biopelículas que mostraron un mejor compromiso entre x x
materiales
las propiedades mecánicas y su acción antimicrobiana. Humedad máxima (para granulado y Se llevó a cabo la caracterización completa de todas las
14 % Obtención y
Así, se estudió su biodegradabilidad, de forma que se peletizado) formulaciones obtenidas mediante técnicas de análisis es-
caracterización de las x x x x x
pueda constatar su contribución a un menor impacto Humedad mínima (para polvo, granulado y tructural, óptico y térmico. También se determinaron sus
10 % biopelículas
medioambiental. peletizado) propiedades mecánicas y de barrera. La caracterización
Realización de Informe
Los estudios para comprobar el grado de desintegra- Carbono Orgánico 18,5 % estructural se llevó a cabo mediante la realización de en-
de avances de la x
ción física de las películas desarrolladas se llevaron a sayos de FTIR y SEM, que permitieron conocer en detalle investigación
pH 7,2
cabo en reactores de compostaje dentro de los cuales se las modificaciones en la estructura química y de superficie Estudio de la actividad
introdujo 1 kg de compost, que consiste en un fertilizante Conductividad eléctrica (dS/m) 10,5 inducidas por la adición del plastificante y/o el agente x x x x
antimicrobiana
compuesto por un 80% de turba negra y un 20% de es- Relación C/N 15 antimicrobiano de los materiales empleados, así como ve- Estudio de la influencia
tiércol compostado con las características indicadas en la rificar la homogeneidad de las muestras. Asimismo, se de la humedad relativa y x x x x x
Tabla III. Los reactores consistieron en cajas de 18 cm x realizaron ensayos de medición de color para comprobar tiempo de almacenaje
18 cm x 10 cm (largo, ancho, alto) que se cubrieron con 3.11. Plan de trabajo la transparencia de las muestras. La caracterización tér- Estudio de la
una tapa para asegurar la hermeticidad, con dos orificios mica se llevó a cabo mediante TGA y DSC, estudiando las biodegradabilidad de x x
Para poder alcanzar los objetivos planteados en el presente
de 5 mm de diámetro en el centro de dos de los lados propiedades de degradación de estos materiales y su las biopelículas
trabajo, se establecieron una serie de etapas a desarrollar
para permitir el intercambio de gases entre la atmósfera comportamiento a altas temperaturas. Se determinaron las Realización de informe
durante la investigación que se detallan a continuación:
interior y el entorno [22] (Figura 2). propiedades mecánicas de tracción en una dirección si- final y artículo
guiendo procedimientos normalizados, con el fin de eva-
1) Busqueda Bibliográfica: luar la ductilidad del material en función de la concentra- Actividad Sep Oct Nov Dic Ene

Inicialmente se realizó una busqueda bibliográfica para ción del plastificante. Aquellas muestras que hasta aquí Busqueda
x x x x x x x x x x
conocer el estado actual sobre el desarrollo de biopelícu- presentaron características dúctiles aceptables siguieron Bibliográfica
las en base proteica para envasado de alimentos. Para siendo analizadas. Por último las modificaciones en las Caracterización de los
ello se llevó a cabo una recopilación de la información propiedades de barrera como consecuencia de la plastifi- materiales
necesaria, centrada en publicaciones relevantes y recien- cación se evaluaron mediante la determinación de OTR a Obtención y
tes, relacionadas con las metodologías analíticas a utilizar través de las biopelículas. caracterización de las
biopelículas
y con el tema de la presente investigación.
5) Estudio de la actividad antimicrobiana de las Realización de Informe
Figura 2. Reactores utilizados para los ensayos de biodegradación. de avances de la x
2) Caracterización de los materiales de partida: biopelículas:
investigación
Las condiciones de ensayo utilizadas fueron modifica- En esta fase se llevaron a cabo los ensayos de caracteri- Se llevaron a cabo ensayos por contacto directo entre la Estudio de la actividad
das con respecto a las indicadas en la norma UNE-EN ISO zación de la proteína láctea (caseinato de sodio y casei- película y el medio de cultivo inoculado (método de difu- antimicrobiana
20200 [22], dado que se observó que el material desarro- nato de calcio), plastificante (glicerol) y el agente antimi- sión de disco). El efecto antimicrobiano se evaluó por me- Estudio de la influencia
llado presentaba una alta capacidad de degradación. De crobiano (carvacrol) que sirvieron de base para conocer dición del halo de inhibición comparando con un control de la humedad relativa y
este modo, en el presente trabajo se realizó un periodo de los cambios inducidos en la matriz tras la mezcla. Se llevó (película sin agente antimicrobiano). tiempo de almacenaje
incubación a una temperatura de 25 ºC para permitir el a cabo una caracterización térmica de dichos materiales Estudio de la
desarrollo de los microorganismos que crecen a tempera- mediante la realización de ensayos de TGA y DSC para 6) Estudio de la influencia de la humedad relativa y biodegradabilidad de x x x x x x
tura ambiente (mesófilos). Además, los tiempos de incuba- conocer su estabilidad térmica; así como una caracteriza- tiempo de almacenaje: las biopelículas
ción fueron muy cortos por la alta velocidad de desintegra- ción estructural mediante FTIR para conocer en detalle la Se llevó a cabo un seguimiento de la dependencia de las Realización de informe
x x x x
ción del material. estructura química. propiedades de las películas con el tiempo de almacena- final y artículo
12 | DESARROLLO DE UN SISTEMA DE ENVASADO ACTIVO: BIOPELÍCULAS DE PROTEÍNAS LÁCTEAS PARA UN DESARROLLO SOSTENIBLE DESARROLLO DE UN SISTEMA DE ENVASADO ACTIVO: BIOPELÍCULAS DE PROTEÍNAS LÁCTEAS PARA UN DESARROLLO SOSTENIBLE | 13

4. Resultados El análisis TGA del carvacrol reveló que éste degrada

en dos etapas (Figura 6), la primera correspondiente al
desprendimiento de sustancias volátiles y la segunda a la
4.1. Caracterización de los materiales de partida propia degradación del material, siendo despreciable el
Con el fin de controlar la calidad de los materiales sumi- residuo tras la degradación.
nistrados y conocer sus principales características rele-
vantes para las tareas a desarrollar con posterioridad, se [Link]. Calorimetría diferencial de barrido (DSC)
realizó una caracterización completa de los materiales de A partir de los termogramas obtenidos para los caseinatos
partida para la obtención de las biopelículas: proteínas se pudo observar la presencia de un pico de carácter
lácteas (caseinato de sodio y caseinato de calcio), plasti- endotérmico durante el primer calentamiento que no apa-
ficante (glicerol) y el agente antimicrobiano (carvacrol). reció en el segundo calentamiento (Figuras 7 y 8), por lo
cual se pudo concluir que este pico corresponde a la
4.1.1. Caracterización térmica evaporación de agua.

Figura 4. Termograma TG/DTG obtenido para caseinato de calcio. Figura 9. Termogramas DSC obtenidos para glicerol durante el pri-
[Link]. Análisis termogravimétrico (TGA) mer (---) y segundo (---) calentamiento.
Tabla IV. Temperatura inicial de degradación (T0) y temperatura de
En las Figuras 3-6 se muestran las curvas de degradación, máxima velocidad de degradación (Tmax) de los materiales de partida.
La Figura 10 muestra el termograma DSC para el
junto a sus correspondientes derivadas (DTG), obtenidas Tmax (ºC) Tmax (ºC) carvacrol, el cual presenta su valor de Tg a -63 ºC, tanto
del análisis TGA para los materiales constituyentes de las Material T0 (ºC)
Etapa I Etapa II en el primer como en el segundo calentamiento. Se ob-
biopelículas. Caseinato de sodio 117 87 330 servó también un pico exotérmico correspondiente a una
Para los dos tipos de caseinatos se observaron dos cristalización fría a una temperatura de -22 ºC. A tempe-
Caseinato de calcio 182 87 338
etapas en el proceso de degradación térmica (Figuras 3 y raturas superiores (alrededor de -5 ºC) se observó un
Glicerol 203 269 -
4). La primera etapa corresponde a la pérdida de hume- pico endotérmico correspondiente a la fusión de los cris-
dad y/o de volátiles, con una pérdida de peso significativa Carvacrol 81 92 208
tales formados en el carvacrol durante el propio ensayo.
alrededor de 100 ºC. Los caseinatos de calcio y de sodio En la Figura 5 se muestran las curvas TGA y DTG del Es de destacar la presencia de un hombro en dicho
presentan valores de temperatura inicial de degradación plastificante donde se observó una única etapa de degra- pico, que parece indicar que la cristalización anterior ha
(T0) 117 ºC y 182 ºC, respectivamente. Sin embargo, no se dación representada por un único pico, con un residuo dado lugar a dos tipos de cristales en la molécula de
observaron grandes diferencias en los valores de la tem- final prácticamente despreciable. carvacrol.
peratura de máxima velocidad de degradación (Tmax) en Figura 7. Termogramas DSC obtenidos para caseinato de sodio du-
ambas etapas (Tabla IV). La segunda etapa de degrada- rante el primer (---) y segundo (---) calentamiento.
ción de los caseinatos mostró un pico simétrico y un resi-
duo final correspondiente a la presencia de componentes
inorgánicos.

Figura 5. Termograma TG/DTG obtenido para glicerol.

Figura 10. Termogramas DSC obtenidos para carvacrol durante el

primer (---) y segundo (---) calentamiento.
Figura 8. Termogramas DSC obtenidos para caseinato de calcio du-
rante el primer (---) y segundo (---) calentamiento.

En la Figura 9 se muestran las curvas DSC obtenidas 4.1.2. Espectroscopia infrarroja con transformada de
durante el primer y segundo calentamiento para el glice- Fourier (FTIR)
Figura 3. Termograma TG/DTG obtenido para caseinato de sodio.
rol, en las que se pudo observar un cambio en la línea En la Figura 11 se muestra el espectro infrarrojo corres-
En la Tabla IV se muestran los valores de T0 y Tmax para base a –81 ºC que se asoció a la temperatura de transi- pondiente al glicerol y en la Tabla V su correspondiente
los materiales de partida. El valor de T0 fue determinado ción vítrea (Tg), siendo prácticamente la misma durante el asignación de bandas. Se puede observar una banda
como la temperatura a la cual se pierde un 5% del peso primer y segundo calentamiento. Inmediatamente des- de absorción amplia alrededor de 3270 cm-1, asociada
inicial del material al calentarlo a 10 ºC min-1 y Tmax fue pués de dicha temperatura se observó un pico endotér- a los grupos hidroxilo del glicerol acoplada con la ab-
determinada a partir de los máximos de las curvas DTG mico correspondiente a una relajación entálpica debida a sorción característica de los alcoholes primarios y se-
tanto para la primera como para la segunda etapa de la la reordenación de las moléculas de glicerina tras su tran- cundarios, la cual ocurre a 1030 y 1100 cm-1, respecti-
degradación. Figura 6. Termograma TG/DTG obtenido para carvacrol. sición vítrea. vamente.
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Número de onda (cm-1) Asignación- Tipo de vibración 5. Obtención de las rpm y por último se sometieron a un tratamiento en baño
de ultrasonidos durante 10 minutos para eliminar gases
1385-1370 Deformación simétrica del -CH3 biopelículas
que pudieran haber quedado en disolución.
1340 Deformación (flexión) del -CH3 Se prepararon biopelículas con y sin agente antimicro-
5.1. Optimización del método de obtención de las bio- biano. En el primer caso, se agregó la cantidad de carva-
1275-1150 Vibración C-OH aromático películas crol necesaria para obtener la relación
Deformación en el plano del proteína:antimicrobiano: 1:0,10; con posterior agitación
1250-950 Para la preparación de las biopelículas se escogió el mé-
enlace C-H aromático. continua durante 3 minutos a 1000 rpm. Una vez prepara-
todo de disolución del material con posterior evaporación
Deformación fuera del plano del del disolvente (casting). Con el objetivo de conseguir las das las soluciones formadoras de biopelículas, se coloca-
650-900
enlace C-H aromático. condiciones más favorables de la solución formadora de ron 30 mL de cada disolución en cápsulas de Petri de
las biopelículas se llevaron a cabo diferentes pruebas. En polietileno (15 cm de diámetro) y posteriormente se seca-
En lo que se refiere a los caseinatos, en la Figura 13
primer lugar, se intentó llevar a cabo su disolución a tem- ron a 25 ºC y 50 % de humedad relativa durante 48 horas.
se muestran sus espectros FTIR en los que se puede ob- Las muestras obtenidas tras este tratamiento tanto de
peratura ambiente para posteriormente elevar la tempera-
servar una banda ancha en la región de los enlaces NH caseinato de sodio/glicerol (NaCas-G) como de caseinato
tura hasta la total disolución. También se hicieron pruebas
en el intervalo entre 2000 y 3400 cm-1 con varios picos variando las condiciones de secado (tiempo y tempera- de calcio/glicerol (CaCas-G) resultaron ser películas trans-
Figura 11. Espectro FTIR obtenido para glicerol. superpuestos característicos de la absorción de los gru- parentes e inodoras, mientras que las muestras a las que
tura). De esta forma, se pudieron extraer algunas conclu-
pos funcionales en las proteínas. Las bandas que apare- siones que ayudaron a decidir la metodología a seguir en se les adicionó carvacrol (CV) también resultaron transpa-
Tabla V. Bandas de absorción identificadas para el espectro FTIR del cen en la región 1600-1500 cm-1 corresponden a las es- este proceso. Finalmente, se decidió preparar las biopelí- rentes pero no inodoras, percibiéndose un ligero olor ca-
glicerol. racterístico a orégano (Figura 15).
tructuras de amidas primarias y aminas secundarias culas tanto con caseinato de calcio como con caseinato
Número de onda (cm-1) Asignación- Tipo de vibración respectivamente. Alrededor de 3450 cm-1 aparecen las de sodio para estudiar las diferencias y similitudes entre
bandas correspondeintes a las cadenas peptídicas aisla- ambos polímeros. Se estableció que las biopelículas fue-
3650-3200 Tensión del enlace O-H
das [24], que se observaron más ensanchadas en la ca- ron secadas a 25 ºC y 50 % de humedad relativa durante
3000-2800 Tensión C-H diferentes tiempos: 12; 24, 48 y 72 h. Los ensayos TGA
seína cuajo. En la Tabla VII se indica la asignación de
1400-1200 Deformación en el plano del O-H durante la etapa de pérdida de agua y/o volátiles (alrede-
bandas correspondiente a estos materiales.
dor de 100 ºC) no mostraron diferencias significativas
1125-1000 Vibración CH-OH entre las biopelículas secadas durante 48 h y 72 h (Figura
1075-1000 Vibración CH2-OH 14) por lo que se escogió como tiempo de secado 48 h.

En la Figura 12 se muestra el espectro correspon-

diente al carvacrol y en la Tabla VI su correspondiente
asignación de bandas.
Figura 15. Biopelículas de caseinato de sodio y glicerol (1:0,35) ob-
tenidas sin (izquierda) y con carvacrol (derecha).

6. Caracterización completa
de las biopelículas
obtenidas
Se llevó a cabo una caracterización completa de todas las
Figura 13. Espectros FTIR obtenidos para caseinato de sodio y ca- formulaciones obtenidas mediante técnicas de análisis tér-
seinato de calcio. mico, estructural y mecánico; así como mediante la eva-
Figura 14. Termogramas TG/DTG obtenidos para dos biopelículas de luación de sus propiedades funcionales.
Tabla VII. Bandas de absorción identificadas para los espectros FTIR caseinato de sodio a distintos tiempos de secado.
de caseina cuajo y caseinatos (de sodio y calcio). 6.1. Caracterización estructural de las biopelículas
5.2. Preparación de las biopelículas
Figura 12. Espectro FTIR obtenido para carvacrol. Número de onda (cm-1) Asignación- Tipo de vibración Estas técnicas se utilizaron para conocer en detalle las
Las películas fueron preparadas disolviendo 5 g (con pre- modificaciones en la estructura química de los materiales
Tensión del enlace –NH,
3400-2000 cisión de 0,0001g) de proteína láctea (caseinato de sodio empleados, comprobando la ausencia de separación de
Tabla VI. Bandas de absorción identificadas para el espectro FTIR aminoácidos
del carvacrol. o caseinato de calcio) en agua destilada, calentando hasta fases y la consiguiente homogeneidad de los materiales.
Tensión del enlace C=O, de
1740-1630 65 ºC para facilitar su solubilización. Posteriormente se
Amida I
Número de onda (cm ) -1
Asignación- Tipo de vibración homogeneizaron bajo agitación continua durante 10 minu-
6.1.1. Espectroscopia infrarroja por transformada de
Tensión simétrica del enlace tos a 1100 rpm. Tras la disolución total del polímero se
3650-3200 Tensión del enlace O-H 1510-1630 Fourier (FTIR) de las biopelículas
N-C=O, de Amida II dejó enfriar la solución a temperatura ambiente y se aña-
Tensión simétrica y antisimétrica 1650-1590 Deformación del NH2 dió la cantidad requerida de glicerol para obtener las si-
2975-2845
del enlace C-H [Link]. FTIR de las biopelículas de caseinato de sodio
guientes relaciones proteína:plastificante, 1:0; 1:0,15;
1650-1550 Deformación del NH
Deformación antisimétrica del 1:0,25; 1:0,35. Una vez incorporado el plastificante, se La Figura 16 muestra los espectros FTIR obtenidos a par-
1480-1485
-CH3 1110-930 Tensión del enlace P-N-C homogeneizaron las soluciones durante 3 minutos a 1100 tir de las biopelículas de caseinato de sodio sin glicerol,
16 | DESARROLLO DE UN SISTEMA DE ENVASADO ACTIVO: BIOPELÍCULAS DE PROTEÍNAS LÁCTEAS PARA UN DESARROLLO SOSTENIBLE DESARROLLO DE UN SISTEMA DE ENVASADO ACTIVO: BIOPELÍCULAS DE PROTEÍNAS LÁCTEAS PARA UN DESARROLLO SOSTENIBLE | 17

así como con 15%, 25% y 35% de este plastificante. Al En la región del espectro correspondiente a las vibra- 6.1.2. Microscopia electrónica de barrido (SEM) de las Las biopelículas preparadas con caseinato de calcio
observar la región comprendida entre 600 y 1800 cm-1 ciones CH se observó un aumento en la proporción del biopelículas con o sin glicerol mostraron una microestructura homoge-
(Figura 17) se vio claramente que a medida que se au- pico correspondiente a los grupos metileno (-CH2) (2925 nea, regular y lisa (Figuras 22 y 23).
Se realizaron micro-fotografías de las muestras a magnifi-
mentaba la proporción de glicerol en las biopelículas dis- cm-1) para las biopelículas plastificadas (Figura 18). Al
minuía la intensidad de los picos que se encontraban pre- añadir carvacrol a estas formulaciones no se observaron caciones de 500x y 1000x. Todas las muestras mostraron
sentes en el caseinato de sodio. Así, para el material sin cambios apreciables en sus espectros FTIR, probable- una microestructura de superficie homogénea, lo que in-
glicerol, se observó un único pico a 1070 cm-1, que pro- mente debido a que este aditivo muestra absorciones en dica una buena dispersión del plastificante en la matriz
bablemente esté asociado a la vibración del enlace co- la región del infrarrojo muy similares tanto a las del glicerol polimérica ya que no se observó dispersión ni formación
rrespondiente P-N-C, mientras que para las otras tres bio- como a las de los caseinatos. de dos fases.
películas se observaron dos picos alrededor de 1030 y
En la Figura 20 se muestran las imágenes obtenidas
1100 cm-1 que corresponden a la absorción característica
para las películas preparadas con caseinato de sodio con
de los alcoholes primarios y secundarios, ya que además
aumentaban su intensidad a medida que lo hacía la pro- y sin glicerol. Tal como se puede observar, las películas
porción de glicerol. En cambio, las bandas características con un 25% en peso de glicerol presentaron una estruc-
de las amidas primarias y secundarias (1600-1500 cm-1 tura agrietada, lo cual puede indicar algún tipo de interac-
respectivamente) disminuyeron a medida que aumentó la ción entre los distintos componentes durante el proce-
proporción de glicerol. A la vista de estos resultados se sado, aunque este resultado no es concluyente para hacer
puede concluir que la unión de los caseinatos con el gli-
esta afirmación de modo definitivo.
cerol provoca la ruptura y recombinación de enlaces quí-
En la Figura 21 se puede observar la sección transver-
micos en la estructura del polímero.
sal de una biopelícula sin plastificante y otra con la mayor Figura 22. Micrografías (SEM) 1000x de la superficie de las películas
de caseinato de calcio (a) sin glicerol; (b-d) con glicerol (b: 15 %; c:
cantidad de plastificante utilizada en el presente trabajo 25 %; d: 35 %).
(35 % en peso de glicerol), donde se puede observar la
presencia de pequeñas burbujas que no se pueden rela-
cionar con la adición de glicerol, ya que también aparecen
en las películas no plastificadas.
Figura 18. Espectros FTIR de las biopelículas de caseinato de sodio
con 0%, 15%,25% y 35% de glicerol en la región de 2700-3700 cm-1.

[Link]. FTIR de las biopelículas de caseinato de calcio

Al igual que en el caso de las biopelículas de caseinato
de sodio, se pudo observar que para las de caseinato
Figura 23. Micrografías (SEM) 1000x de la sección transversal de las
de calcio plastificado los picos característicos de los
películas de caseinato de calcio (a) sin glicerol; (b) 35% de glicerol.
alcoholes primarios y secundarios (1030 y 1100 cm-1)
aumentaron de intensidad a medida que lo hizo la pro- En cuanto a las películas con carvacrol, se observó
porción de plastificante en la formulación (Figura 19). En que éstas presentan una estructura homogenea (Figuras
este caso tampoco se observaron cambios apreciables 24 y 25) indicando que el carvacrol se incorporó adecua-
Figura 16. Espectros FTIR de las biopelículas de caseinato de sodio en sus espectros FTIR al añadir el agente antimicro- damente a la matriz proteica.
con 0% 15%,25% y 35% de glicerol. biano.

Figura 20. Micrografías (SEM) 1000x de la superficie de las películas

de caseinato de sodio (a) sin glicerol; (b-d) con glicerol (b: 15 %; c:
25 %; d: 35 %).

Figura 24. Micrografías (SEM) 1000x de la superficie de las películas

Figura 17. Espectros FTIR de las biopelículas de caseinato de sodio Figura 19. Espectros FTIR de las biopelículas de caseinato de calcio Figura 21. Micrografías (SEM) 1000x de la sección transversal de las de caseinato de sodio, con un 10% de carvacrol. (a) sin glicerol; (b-d)
con 0%, 15%,25% y 35% de glicerol en la región de 600-1800 cm-1 y carvacrol, con 0%, 15%,25% y 35% de glicerol. películas de caseinato de sodio (a) sin glicerol; (b) 35 % de glicerol. con glicerol (b: 15 %; c: 25 %; d: 35 %).
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En la Figura 26 se muestran las curvas TGA para los Tabla IX. Temperatura inicial de degradación (T0), temperatura de máxima velocidad de degradación (Tmax) de tres regiones y peso residual a
materiales de partida (caseinato, glicerol y carvacrol) y 900 ºC de las biopelículas de caseinato de calcio y glicerol.

algunas biopelículas con plastificante (glicerol) y/o carva-

Biopelículas de Caseinato de Calcio + Glicerol Proporciones (CaCas:Glicerol)
crol. Para todas las formulaciones obtenidas se observó
inicialmente un salto en la curva asociado a la pérdida de Parámetros termogravimétricos (1 : 0) (1 : 0,15) (1 : 0,25) (1 : 0,3 5)
agua y al inicio de la degradación del carvacrol entre 100
ºC y 150 ºC, mientras que posteriormente se observaron T0 (ºC) 89 116 169 149
las etapas típicas de los procesos de degradación del T intervalo (ºC) 30-160 30-154 30-126 30-116
Región I
glicerol (entre 200 ºC y 250 ºC) y más tarde del caseinato Tmax (ºC) 81 101 83 70
a una temperatura superior a 350 ºC. Tinicio (ºC) 199 169 135 116
Región II
Tmax (ºC) 338 287 232 220
Tinicio (ºC) - 287 285 280
Región III
Tmax (ºC) - 332 330 341
Peso residual a 900 ºC (%) 5,0 5,3 7,0 5,2

Figura 25. Micrografías (SEM) 1000x de la superficie de las películas Tabla X. Temperatura inicial de degradación (T0), temperatura de máxima velocidad de degradación (Tmax) de tres regiones y peso residual a
de caseinato de calcio con un 10% de carvacrol. (a) sin glicerol; (b-d) 900 ºC de las biopelículas de caseinato de sodio, carvacrol y glicerol.
con glicerol (b: 15 %; c: 25 %; d: 35 %).
Biopelículas de Caseinato de Sodio + Carvacrol + Glicerol Proporciones (NaCas : Carvacrol : Glicerol)

Parámetros termogravimétricos (1:0,1:0) (1:0,1:0,15) (1:0,1:0,25) (1:0,1:0,35)

6.2. Caracterización térmica de las biopelículas
En este apartado se muestran los resultados obtenidos T0 (ºC) 98 99 107 104
para el estudio de las propiedades de degradación de las T intervalo (ºC) 30-140 30-131 30-121 30-104
biopelículas y en general, su comportamiento a altas tem- Región I
Tmax (ºC) 81 81 69 69
peraturas.
Tinicio (ºC) 164 155 151 157
Figura 26. Termogramas obtenidos para dos formulaciones de bio- Región II
Tmax (ºC) 335 272 243 243
películas y sus componentes.
6.2.1. Análisis termogravimétrico (TGA) de las Tinicio (ºC) - 287 279 280
biopelículas Región III
Los resultados obtenidos para los análisis mediante Tmax (ºC) - 326 320 320
Con el fin de conocer las variaciones del comportamiento TGA de las biopelículas preparadas se muestran en las
Peso residual a 900 ºC (%) 5,2 3,8 5,0 1,9
a altas temperaturas de estos nuevos materiales y su re- tablas VIII-XI. Tal como se puede observar, la degradación
sistencia a la degradación térmica, se analizó el efecto de de los caseinatos es el proceso que predomina a tempe-
los distintos porcentajes de plastificante sobre la estabili- Tabla XI. Temperatura inicial de degradación (T0), temperatura de máxima velocidad de degradación (Tmax) de tres regiones y peso residual a
raturas superiores a 300 ºC. Los procesos de evaporación
900 ºC de las biopelículas de caseinato de calcio, carvacrol y glicerol.
dad térmica de los caseinatos y la estabilidad del agente del plastificante y del agente activo se superponen ligera-
antimicrobiano elegido (carvacrol). mente con el inicio de la degradación. Biopelículas de Caseinato de calcio + Carvacrol + Glicerol Proporciones (CaCas : Carvacrol : Glicerol)

Parámetros termogravimétricos (1:0,1:0) (1:0,1:0,15) (1:0,1:0,25) (1:0,1:0,3 5)

T0 (ºC) 99 116 105 161

T intervalo (ºC) 30-152 30-161 30-152 30-111
Región I
Tmax (ºC) 76 107 93 76

Tabla VIII. Temperatura inicial de degradación (T0), temperatura de máxima velocidad de degradación (Tmax) de tres regiones y peso residual a Tinicio (ºC) 190 175 143 140
Región II
900 ºC de las biopelículas de caseinato de sodio y glicerol. Tmax (ºC) 335 338 265 244
Tinicio (ºC) - 356 287 290
Región III
Biopelículas de Caseinato de Sodio + Glicerol Proporciones (NaCas:Glicerol)
Tmax (ºC) - 362 335 335
Peso residual a 900 ºC (%) 6,0 5.3 4,1 6,1
Parámetros termogravimétricos (1 : 0) (1 : 0,15) (1 : 0,25) (1 : 0,3 5)

T0 (ºC) 90 101 170 97

T intervalo (ºC) 30-164 30-142 30-128 30-128 6.2.2. Calorimetría diferencial de barrido (DSC) de las minada con anterioridad. Si bien no se pudo determinar con
Región I
Tmax (ºC) 78 78 84 69 biopelículas precisión el valor de Tg en estas muestras, si se pudo com-
Tinicio (ºC) 191 193 154 152 En las curvas DSC de algunas de las biopelículas prepara- probar que para los casos en los que las biopelículas fue-
Región II
Tmax (ºC) 314 323 249 244 das en el presente trabajo se pudo observar claramente ron mezcladas con el plastificante, éstas presentaron un li-
Tinicio (ºC) - 335 275 284 durante el primer calentamiento un pico endotérmico gero cambio en la linea base a una temperatura de -57 ºC
Región III próximo a los 100 ºC causado por la evaporación del agua que podría corresponder a la Tg del sistema al ser, por otra
Tmax (ºC) - 347 320 326
presente en la matriz. Durante el segundo calentamiento parte, algo superior al valor de temperatura de transición
Peso residual a 900 ºC (%) 6,7 7,0 3,7 5,4
dicho pico no se observó debido a que el agua ya fue eli- vítrea observada para el propio plastificante (Figuras 27-30).
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6.4. Caracterización mecánica de las biopelículas

Las Figuras 31 y 32 muestran los resultados comparativos
para las propiedades de los ensayos de tracción (módulo
elástico y tensión en el punto de rotura) de las biopelícu-
las.

Figura 33. Porcentaje de deformación a la rotura (εB%) obtenido para

Figura 27. Termogramas DSC obtenidos para una biopelícula de Figura 30. Termogramas DSC obtenidos para una biopelícula de ca-
las biopelículas (n = 5).
caseinato de calcio durante el primer (---) y segundo (---) calenta- seinato de sodio con un 35% de glicerol y 10% carvacrol durante el
miento. primer (---) y segundo (---) calentamiento.
Teniendo en cuenta que la flexibilidad del material es
una propiedad clave en la fabricación de películas para
6.3. Caracterización óptica de las biopelículas envasado de alimentos, para proceder a las siguientes
Figura 31. Módulo elástico de Young obtenido para las distintas bio- etapas del plan de trabajo se selccionaron las formulacio-
Para la realización del ensayo de medición de color se
películas (n = 5). nes con un 25 % y 35 % en peso de glicerol, con y sin
colocaron las biopelículas sobre el sensor del instrumento
carvacrol. Se siguieron estudiando tanto las formulaciones
de medida y se tomaron cinco medidas en diferentes pun-
de caseinato de sodio como las de caseinato de calcio.
tos. La Tabla XII muestra un promedio de cada una de las
medidas y sus respectivas desviaciones estándar para
todas las formulaciones. 6.5. Propiedades de barrera al oxígeno
Tabla XII. Coordenadas de color del espacio CIELAB de las biopelí- Las Tablas XIII y XIV muestran los valores finales de OTR
culas formuladas (n = 5). en el estado estacionario multiplicado por el espesor pro-
medio de cada película (OTR.e), obtenidos para las bio-
Biopelículas L* DS a* DS b* DS
películas de caseinato de sodio y calcio, cuyos espesores
NaCas 35,40 0,20 -0,33 0,09 -1,10 0,10
promedio estuvieron en el intervalo 88 ± 16 μm y en el
NaCas-G15% 34,30 0,07 -0,10 0,10 -0,88 0,03
intervalo de 103 ± 11 μm respectivamente.
NaCas-G25% 34,28 0,05 -0,24 0,04 -0,81 0,05
En todos los casos, los valores de OTR.e obtenidos
NaCas-G35% 33,83 0,08 -0,13 0,03 -0,69 0,04
fueron muy bajos, indicando que las biopelículas presen-
CaCas 35,00 0,10 -0,12 0,09 -0,82 0,03
Figura 28. Termogramas DSC obtenidos para una biopelícula de ca- tan excelentes propiedades de barrera al oxígeno y en
CaCas-G15% 34,60 0,02 -0,10 0,05 -0,67 0,02
seinato de calcio con 35% de glicerol durante el primer (---) y consecuencia demostrando su utilidad como envase para
segundo (---) calentamiento. CaCas-G25% 34,50 0,07 -0,15 0,05 -0,72 0,08
CaCas-G35% 34,10 0,09 -0,09 0,03 -0,61 0,04 los alimentos en los que se deba restringir la presencia de
NaCas-CV10% 35,61 0,08 -0,56 0,08 -1,08 0,06 Figura 32. Tensión en el punto de rotura obtenida (σr) para las biope- oxígeno con el fin de limitar los procesos oxidativos.
NaCas-G15%-CV10% 34,71 0,06 -0,37 0,06 -1,30 0,10 lículas (n = 5). Por otro lado, se observó que la adición del agente
NaCas-G25%-CV10% 34,64 0,05 -0,30 0,03 -0,96 0,05 antimicrobiano produjo un leve aumento en el valor de
Como era de esperar al tratarse de un proceso de
NaCas-G35%-CV10% 33,78 0,03 -0,17 0,06 -0,72 0,06 OTR.e de las biopelículas, disminuyendo ligeramente sus
plastificación, la adición de glicerol en la máxima propor-
CaCas-CV 34,80 0,07 -0,14 0,06 -0,67 0,04 propiedades de barrera a oxígeno. Sin embargo, al ser
ción utilizada (35 % en peso) provocó una disminución
CaCas-G15%-CV10% 34,68 0,04 -0,12 0,06 -0,57 0,04 este incremento poco significativo, se puede concluir que
CaCas-G25%-CV10% 34,20 0,10 -0,10 0,04 -0,61 0,04
importante en el módulo elástico de Young para todas las
las propiedades de barrera son muy adecuadas para su
biopelículas, lo que implica una disminución de la rigidez
CaCas-G35%-CV10% 33,90 0,05 -0,08 0,02 -0,52 0,05 uso como material de envasado activo de alimentos en
del material plastificado (Figura 31).
todos los casos ensayados.
Se pudo observar que la evolución de la luminosidad En cuanto a la deformación en el punto de rotura, se
L* mostraba un ligero descenso con el aumento en la puede observar en la Figura 33 que un aumento en la Tabla XIII. Velocidades de transmisión de oxígeno por espesor pro-
proporción del plastificante, por lo que se puede concluir proporción de plastificante mejoró la flexibilidad de todas medio de muestra (OTR.e) obtenidas para las películas de caseinato
de sodio (n = 2).
que las biopelículas al estar más plastificadas se hacen las biopelículas. En particular las de caseinato de sodio
ligeramente más transparentes. Tanto para el índice de con un 35 % en peso de glicerol son las que presentaron OTR.e
Biopelículas DS
saturación a*, como para el ángulo de tono b*, se obser- el incremento más elevado de εB % (alrededor de un 80 (cm3mm / m2día)
varon valores ligeramente inferiores a cero, desviándose, %) tanto para las películas sin carvacrol como con un 10 NaCas-G25% 1,87 0,01
por lo tanto levemente hacia el color verde y azul, respec- % de este aditivo. Este resultado es importante desde el NaCas-G35% 1,4 0,3
tivamente. Sin embargo, se debe tener en cuenta que los punto de vista práctico ya que para la fabricación de pe-
Figura 29. Termogramas DSC obtenidos para una biopelícula de ca- NaCas-G25%-CV 2,42 0,02
seinato de sodio con 10% de carvacrol durante el primer (---) y valores absolutos de los parámetros a* y b* fueron muy lículas es necesario que el valor de εb sea lo más alto
segundo (---) calentamiento. cercanos a 0. posible, demostrando así la flexibilidad del material. NaCas-G35%-CV 2,1 0,7
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Tabla XIV. Velocidades de transmisión de oxígeno por espesor pro- (Figuras 35 y 36), mientras que para las biopelículas utili- para comprobar si las biopelículas conservan o pierden su 6.7.2. Caracterización mecánica de las biopelículas
medio de muestra (OTR.e) obtenidas para las películas de caseinato zadas como control (sin carvacrol en su formulación) se capacidad antimicrobiana en el tiempo mencionado. Asi- durante el almacenamiento
de calcio (n = 2).
observó el crecimiento bacteriano en toda la superficie de mismo, se estudiaron también las propiedades mecánicas Las propiedades mecánicas a tracción de las biopelículas
OTR.e la placa (Figura 37). Por lo tanto, se puede concluir que a tracción para evaluar un posible cambio en la respuesta se estudiaron de acuerdo a la norma ASTM D882-01 [19]
Biopelículas DS
(cm3mm / m2día) las biopelículas con un 10% de carvacrol presentaron ac- elástica y plástica del material. a tiempos 7, 14 y 21 días. En la Figura 41 se muestra la
CaCas-G25% 7,12 0,01 tividad antimicrobiana tanto frente a la cepa de S. aureus deformación en el punto de rotura obtenida para las mues-
como para E. coli. 6.7.1. Estudio de la actividad antibacteriana de las tras de caseinato de sodio a los distintos tiempos. Se pudo
CaCas-G35% 4,4 0,3
biopelículas durante el almacenamiento observar que, incluso tras 21 días de almacenamiento, las
CaCas-G25%-CV 4,57 0,09 biopelículas mostraron propiedades mecánicas satisfacto-
Para todas las biopelículas conteniendo carvacrol, tanto
CaCas-G35%-CV 1,2 0,3 de caseinato de sodio como de caseinato de calcio, se rias, manteniéndose los valores iniciales sin variaciones
observó que se mantiene la inhibición del crecimiento significativas.
bacteriano a tiempos de almacenamiento 7, 14 y 21 días.
6.6. Estudio de la actividad antibacteriana de las bio-
A modo de ejemplo, se muestran algunas placas a dis-
películas
tintos tiempos y de distintas biopelículas en las Figuras
Se sembraron en placas de agar nutriente las bacterias 38-40.
indicadoras elegidas (S. aureus y E. coli) y se incubaron a
37 ºC durante 24 horas para permitir el crecimiento de las
colonias (Figura 34). De las colonias obtenidas tras este
Figura 35. Inhibición del crecimiento de S. aureus. a) Biopelícula de
tratamiento se seleccionaron de tres a cinco de ellas bien
caseinato de sodio, glicerol y carvacrol (1: 0,35: 0,1). b) Biopelícula
aisladas y con similar morfología, las cuales fueron extraí- de caseinato de calcio, glicerol y carvacrol (1: 0,35: 0,1).
das del agar de cultivo y transferidas con un asa a un tubo
con caldo de triptonasoja. Los inóculos se incubaron a 37
ºC hasta que alcanzaron la turbidez del estándar de 0,5
McFarland, aproximadamente tras 5 horas de tratamiento.
De este modo se obtuvo una suspensión con aproximada-
mente 1 a 2 x 108 UCF mL-1. Con el fin de obtener una
concentración final de microorganismos del orden de 106 Figura 41. Deformación en el punto de rotura obtenida en las biope-
Figura 38. Biopelículas de caseinato de sodio, glicerol y carvacrol lículas de caseinato de sodio (n = 5).
UFC mL-1 se prepararon dos diluciones en serie (1/10) en
almacenadas durante 7 días a 25 ºC y 50 % HR. Inhibición del creci-
agua peptonada. Una vez obtenida la concentración de Se observó que el proceso de envejecimiento provocó
miento de a) E. coli y b) S. aureus.
microorganismos deseada, se procedió a inocular 0,1 mL un aumento en el módulo elástico de Young en las biope-
sobre la superficie de cada placa de agar Mueller Hinton lículas de caseinato de sodio (Figura 42). La biopelícula
y su inmediata distribución del inóculo por rayado con un que presentó un mayor aumento en este parámetro fue la
asa de Digrosky sobre toda la superficie por dos o más Figura 36. Inhibición del crecimiento de E. coli. a) Biopelícula de
caseinato de sodio, glicerol y carvacrol (1: 0,25: 0,1). b) Biopelícula de caseinato de sodio con un 25 % de glicerol, que se
veces, rotando la placa aproximadamente 60 º cada vez de caseinato de calcio, glicerol y carvacrol (1: 0,35: 0,1). encontraba menos plastificada y sin la presencia de car-
para asegurar una distribución constante del inóculo. vacrol.

Figura 39. Biopelículas de caseinato de sodio, glicerol y carvacrol (1:

0,25: 0,10) almacenadas durante 14 días a 25 ºC y 50 % HR.
Inhibición del crecimiento de E. coli.

Figura 37. Crecimiento de a) S. aureus y b) E. coli en biopelículas

Figura 34. Placas de Petri conteniendo las bacterias utilizadas a) S. control a) caseinato de calcio y glicerol (1: 0,25) y b) caseinato de
aureus, b) E. coli sodio y glicerol (1: 0,35)

Se cortaron las biopelículas en forma de cuadrados de

10 x 10 mm2 y se colocaron presionándolos de forma que
6.7. Estudio de la influencia del tiempo de almacena- Figura 42. Módulo elástico de Young obtenido para las biopelículas
se asegurara un contacto pleno con la superficie del agar. de caseinato de sodio (n = 5).
miento
Se prepararon entonces tres cuadrados por placa, las
cuales fueron duplicadas para asegurar la reproducibili- Tras preparar todas las biopelículas necesarias para el La deformación en el punto de rotura para las mues-
dad de los resultados. estudio, se almacenaron en una cámara climática a 25 ºC tras preparadas a partir de caseinato de calcio se muestra
Se pudo observar que todas las biopelículas cuyas y 50 % de humedad relativa, siendo posteriormente retira- en la Figura 43. Estas biopelículas presentaron valores
Figura 40. Biopelículas de caseinato de sodio, glicerol y carvacrol
formulaciones contenían carvacrol mostraron una inhibi- das para su análisis a diferentes tiempos: 7, 14, y 21 días. almacenadas durante 21 días a 25 ºC y 50 % HR. Inhibición del cre- mas bajos que las de caseinato de sodio, indicando su
ción del crecimiento bacteriano en la zona de contacto Se llevaron a cabo los mismos ensayos antimicrobianos cimiento de a) S. aureus y b) E. coli. mayor rigidez como característica general.
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prácticamente imposible despegar las biopelículas de la sencia de pequeñas burbujas que podrían haber sido sado de alimentos, en base poli(ácido láctico), PLA. Estos
malla metálica. Finalmente, tras 300 minutos, las muestras formadas en la etapa de secado durante la eliminación del autores obtuvieron valores de OTR.e de 29,5 cm3 mm /m2
se encontraban totalmente desintegradas bajo las condi- agua [26], al crearse vapor en el interior de la matriz y día, mientras que para PLA plastificado los valores fueron
ciones estudiadas, tanto aquellas sin agente antimicro- formar una gota, la cual se va desplazando hacia arriba superiores, llegando a ser de 48 cm3 mm / m2 día.
biano como las que contenían carvacrol. durante el secado de tal modo que va produciendo orifi- El estudio de la actividad antibacteriana de las biope-
cios en las paredes delgadas de la película. Este fenó- lículas demostró que todas las formulaciones que conte-
meno se denomina “balloning” [11]. nían carvacrol presentaron dicha actividad tanto frente a
Del análisis TGA se pudo concluir que la etapa más la cepa de S. aureus como para E. coli incluso tras 21 días
importante del proceso de degradación global del material de almacenamiento en condiciones de temperatura y hu-
es la degradación de los caseinatos, proceso que predo- medad relativa controladas. La capacidad antimicrobiana
mina a temperaturas superiores a 300 ºC. La evaporación del carvacrol frente a estos microorganismos ha sido am-
del plastificante y del agente activo se superponen ligera- pliamente estudiada. En este sentido, Ben Arfa et. al
mente con el inicio de la degradación, siendo complicado (2006) [7] demostraron que de los aceites esenciales de-
separar con claridad el inicio y final de cada proceso me- rivados del orégano, el carvacrol es el que presenta me-
diante esta técnica. jores características antimicrobianas frente a E. coli y S.
Figura 43. Deformación en el punto de rotura obtenida para las bio- Los valores absolutos de las coordenadas del espacio aureus entre otras bacterias. Por otra parte, el carvacrol ha
películas de caseinato de calcio (n = 5).
colorimétrico CIELAB a* y b* obtenidos fueron muy cerca- sido utilizado como agente activo en la formulación de otro
En la Figura 44, se muestra el módulo elástico de nos a 0, indicando la ausencia de color y una elevada tipo de películas; Gutiérrez et al (2009) [29] desarrollaron
Young de las biopelículas de caseinato de calcio, las cua- transparencia para todas las formulaciones; aún para películas de polipropileno con carvacrol que también inhi-
les, al igual que las biopelículas de caseinato de sodio, aquellas conteniendo carvacrol. En este sentido, Pereda bieron el crecimiento de S. aureus y E. coli. Por otro lado,
presentaron un aumento en este parámetro a medida que et. al (2010) [25], si bien obtuvieron películas transparen- Lim et al (2010) [30] desarrollaron películas biodegrada-
transcurría el envejecimiento. tes de caseinato de sodio plastificadas con glicerol y mo- bles en base a algas rojas (Gelidium corneum) con carva-
dificadas con aceite de tung, observaron que presentaban crol, presentando capacidad antimicrobiana frente a E.
una coloración ligeramente ámbar, con valores para la coli O157:H7. En cuanto a su aplicabilidad al envasado de
coordenada b* de hasta 8,11 cuando este aceite esencial alimentos, hay que tener en cuenta que, en general, casi
se adicionó en un 10% en peso con respecto a la proteína. todos los alimentos contienen nutrientes suficientes para
Las biopelículas sin aditivar presentaron valores del mantener el crecimiento de la mayoría de los microorga-
módulo elástico de Young comprendidas en el intervalo nismos [5]. De este modo, al demostrar que las biopelícu-
0,1-4,2 GPa, mayores que los de algunos polímeros con- las aditivadas con carvacrol presentaron actividad anti-
Figura 45. a) muestra antes de ser introducida en el reactor; b-f vencionales como polipropileno (0,2-1,2 GPa), polietileno bacteriana durante el almacenamiento, aún después de 21
muestras retiradas del reactor a tiempos b) 10 min; c) 80 min; d) 90 de alta densidad (0,5-1,2 GPa) y politetrafluoretileno (0,3- días, tanto para E. coli como para S. aureus, se puede
min; e) 120 min; f) 240 min. 0,8 GPa) [17]. Este resultado indica una rigidez muy alta concluir que estas biopelículas presentan características
de los caseinatos en comparación con las poliolefinas. Por antibacterianas satifactorias para su aplicación en el enva-
otra parte, las biopelículas de caseinato de calcio resulta- sado de alimentos.
7. Discusión ron ser más rígidas que las de caseinato de sodio, lo cual Finalmente, las biopelículas desarrolladas en el pre-
coincide con los resultados aportados por Fabra et. al sente trabajo demostraron una rápida desintegración fí-
El analisis FTIR ha demostrado la unión de los caseinatos (2010) [27], quienes estudiaron la influencia del calcio en sica, obteniendo tiempos muy inferiores a los indicados en
Figura 44. Módulo elástico de Young obtenido para las biopelículas
con el glicerol en la biopelícula a través de fuertes interac- las propiedades mecánicas de biopelículas de caseinato la bibliografía en condiciones de compostaje. Martucci y
de caseinato de sodio (n = 5). ciones desarrolladas por la recombinación polielectrolítica de sodio y calcio. Por otro lado, en el presente estudio el Ruseckaite, (2009) [23] desarrollaron películas en base
de ambos componentes, ya que sus espectros presenta- proceso de envejecimiento de las biopelículas de casei- gelatina, las cuales fueron sometidas a condiciones de
ron bandas características de las amidas (en la región nato de sodio, en condiciones de temperatura y humedad compostaje similares, obteniendo una pérdida de la inte-
6.8. Estudio de la biodegradabilidad de las biopelículas
1600-1500 cm-1) comunes en las proteínas; así como tam- relativa controlada, provocó un aumento en el módulo gridad estructural del material al cabo de 10 días. Lodha
A partir de los resultados obtenidos en los apartados an- bién bandas que corresponden a la absorción caracterís- elástico de Young. Sin embargo, este aumento se dio en y Netravali (2005) [31] estudiaron resinas de aislados pro-
teriores, se evaluó la mejor formulación teniendo en cuenta tica de los alcoholes primarios y secundarios (alrededor menor proporción para las películas aditivadas con carva- teicos de soja, las sometieron a compostaje que degrada-
el compromiso necesario entre las propiedades mecáni- de 1030 y 1100 cm-1). Esta conclusión coincide con los crol, indicando que éste ejerce una acción importante ayu- ron en 21 días. De este modo, se puede interpretar que la
cas y su acción antimicrobiana. De esta forma, se selec- resultados aportados por Pereda et. al, (2007) quienes dando a retardar la disminución de la flexibilidad del ma- rapidez del proceso de biodegradación obtenido en el
cionó la formulación de caseinato de sodio plastificada estudiaron también películas de caseinato de sodio plas- terial debido a su carácter parcialmente plastificante. presente trabajo es debido a que el compost presenta un
con 35 % en peso de glicerol y conteniendo 10 % de tificadas con glicerol [25]. En cuanto a las propiedades de barrera al oxígeno, se elevado porcentaje de humedad. Por lo tanto, es posible
carvacrol (NaCas35%GCV10%) y se procedió a estudiar A partir de la microscopia electrónica de barrido se observó que la adición del agente antimicrobiano produjo que la rápida desintegración de las biopelículas se deba
su biodegradabilidad. Para llevar a cabo este estudio se pudo observar una estructura agrietada en las biopelículas un leve aumento en el valor de OTR.e de las biopelículas, más bien a su hidrólisis en el medio ensayado y no pro-
introdujeron las muestras dentro de las mallas de acero de caseinato de sodio plastificadas con un 25 % en peso disminuyendo ligeramente las propiedades de barrera de piamente a la degradación mediada por las bacterias.
inoxidable en los reactores con compost tal como se des- de glicerol, lo cual puede ser debido a algún problema en éstas. Sin embargo, al ser este incremento poco significa- Este comportamiento de rápida degradación por hidrólisis
cribió en el apartado 3.10 y se fueron sacando a distintos la preparación de las películas. No obstante, Kristo et. al tivo, las propiedades de barrera al oxígeno se pueden no es indicativo de que la vida útil del material en un
tiempos de reacción: 10 min, 80 min, 90 min, 120 min, 240 (2008) [26] encontraron que dicha concentración era la considerar muy adecuadas para su uso como material de medio no acuoso no sea alta, ya que los polímeros biode-
min y 300 min. Tras cada extracción se realizó una inspec- mínima necesaria para superar la fragilidad e incrementar envasado activo de alimentos en todos los casos, por gradables se degradan únicamente en condiciones de
ción visual de las muestras para comprobar el grado de la flexibilidad de las películas de caseinato de sodio plas- ejemplo al contrastar estos resultados con los de otros compostaje y por tanto estas películas podrían ser ade-
desintegración física en función del tiempo y se tomaron tificadas con sorbitol. En la sección transversal de las bio- autores, como los estudiados por Martino et al. (2009) [28] cuadas para su uso en contacto con alimentos de bajo
fotografías (Figuras 45-a-f). Al cabo de 90 min, resultó películas (plastificadas y sin plastificar) se observó la pre- que desarrollaron películas biodegradables para el enva- contenido acuoso.
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8. Conclusiones 9. Bibliografía [15] Balart-Gimeno R, López-Martínez J, García-Sano- [24] Pereda M, Aranguren MI, Marcovich NE. Characteri-
guera D, Parres-García F. Técnicas experimentales zation of Chitosan/Caseinate Films. Journal of Applied
1. A partir de los resultados obtenidos y presentados en [1] Hernández-Izquierdo VM, Krochta JM. Thermoplastic de análisis térmico de polímeros. Valencia: Universi- Polymer Science 2008; 107:1080-1090.
los apartados anteriores, se puede concluir que la Processing of Proteins for Film Formation -A Review. dad Politécnica de Valencia; 2003. [25] Pereda M, Aranguren MI, Marcovich NE. Caseinate
plastificación de biopelículas de caseinatos con glice- Journal of Food Science 2008; 73: 30-39. [16] Brown M. Introduction to Thermal Analysis. Chapman films modified with tungoil. Food Hydrocolloids 2010;
rol ha sido uno de los factores claves para poder for- [2] Pojanavaraphan T, Magaraphan R, Chiou B-S, Schi- and Hall, Nueva York, 1987 24: 800-808.
mar las biopelículas dando materiales homogéneos. raldi DA. Development of Biodegradable Foamlike [17] Stuart B. Polymer Analysis. Jonh Wiley and [Link], [26] Kristo E, Koutsoumanis KP, Biliaderis CG. Thermal,
De esta forma se mejoraron las propiedades dúctiles Materials Based on Casein and Sodium Montmorillo- London 2002. mechanical and water vapor barrier properties of so-
del material con una reducción en el módulo de elas- nite Clay. Biomacromolecules 2010; 11: 2640–2646. [18] Callister WD. Introducción a la ciencia e ingeniería de dium caseinate films containing antimicrobials and
ticidad y un aumento en la elongación en el punto de [3] Audic JL, Chaufer B, Daufin G. Non-food applications los materiales. Reverté, Barcelona, 1995. their inhibitory action on Listeria monocytogenes.
rotura proporcionales a la concentración de plastifi- of milk components and dairy coproducts: A review. [19] ASTM 1993 Standard Test Method for Tensile Proper- Food Hydrocolloids 2008; 22: 373-386.
cante añadido. Lait 2003; 83: 417-438. ties of Thin Plastic Sheeting. ASTM D882-91-01, ASTM [27] Fabra MJ, Talens P, Chiralt A. Influence of calcium on
2. Tanto el glicerol como el carvacrol presentaron buena [4] Seydim AC, Sarikus G. Antimicrobial activity of whey Book Stand. 08.01:316. ASTM, Philadelphia, PA. tensile, optical and water vapour permeability proper-
compatibilidad con los caseinatos, formando películas protein based edible films incorporated with oregano, [20] Signorini ML, Sequeira GJ, Bonazza JC, Dalla Santina ties of sodium caseinate edible films. Journal of Food
transparentes, sin separación de fases. rosemary and garlic essential oils. Food Research In- R, Martí LE, Frizzo LS, Rosmini MR. Use of indicator Engineering 2010; 96: 356–364.
3. Todas las formulaciones conteniendo carvacrol inhi- ternational 2006; 39:639-644. microorganisms for the hygienic-sanitary conditions [28] Martino VP, Ruseckaite RA, Jiménez A. Processing
bieron el crecimiento de E. coli y S. aureus, demos- [5] Mossel DAA, Moreno B, Struijk CB. Microbiología de evaluation in the milk primary production. Revista and characterization of poly(lactic acid) films plastici-
trando la capacidad antimicrobiana de las biopelículas los alimentos. ACRIBIA S.A. Zaragoza España.I.S.B.N: Científica de la Facultad de Ciencias Veterinarias de zed with commercial adipates. Journal of Applied Po-
desarrolladas. 84-200-0998-9. 2003. la Universidad de Zulia 2008; 18 (2): 207-217. lymer Science 2009; 112: 2010-2018.
4. Se obtuvieron muy buenas propiedades de barrera al [6] Mastromatteo M, Mastromatteo M, Conte A, Del No- [21] NCCLS. Performance standards for antimicrobial disk [29] Gutiérrez L, Escudero A, Batlle R, Nerín C. Effect of
oxígeno, siendo éste un factor muy importante para un bile, MA. Advances in controlled release devices for susceptibility testing; ninth informational supplement Mixed Antimicrobial Agents and Flavors in Active Pac-
envase alimentario a la hora de proteger al alimento food packaging applications. Trends in Food Science document M100-S9, Vol. 19. No. 1, Table 2I. Wayne, kaging Films. J. Agric. Food Chem. 2009; 57: 8564-
contra la oxidación. Además, el valor de este paráme- & Technology 2010; 21: 591-598. Pennsyslvania: NCCLS; 1999. 8571.
tro supone una mejora significativa en relación a otros [7] Ben Arfa A, Combes S, Preziosi-Belloy L, Gontard N, [22] UNE-EN ISO 20200:2004. Determinación del grado [30] Lim GO, Hong YH, Song KB. Application of Gelidium
polímeros biodegradables. Chalier P. Antimicrobial activity of carvacrol related to de desintegración de materiales plásticos bajo condi- corneum Edible Films Containing Carvacrol for Ham
5. Debido a que el material presenta una degradación its chemical structure. Journal compilation. Letters in ciones de compostaje simuladas en un laboratorio. Packages. Journal of Food Science 2010; 75, (1): 90-93.
rápida por hidrólisis, debe estar sometido a condicio- Applied Microbiology 2006; 43: 149-154. [23] Martucci JF, Ruseckaite RA. Biodegradation of three- [31] Lodha P, Netravali AN. Effect of soy protein isolate
nes de baja humedad, representando una opción para [8] Viuda-Martos M, Ruiz-Navajas Y, Fernández-López J, layer laminate films based on gelatin under indoor soil resin modifications on their biodegradation in a com-
el envasado de alimentos con bajo contenido acuoso. Pérez-Álvarez J.A. Antifungal Activities of thyme, clove conditions. Polymer Degradation and Stability 2009; post médium. Polymer Degradation and Stability
6. Todos los compuestos utilizados en las formulaciones and oregano essential oils. Food Safety 2007; 27: 91- 94: 1307-1313. 2005; 87: 465-477.
son de origen natural y aptos para el consumo. Son 101.
altamente biodegradables y por tanto representan una [9] Ponce AG, Roura SI, Del Valle CE, Moreira MR. Anti-
alternativa prometedora y medioambientalmente sos- microbial and antioxidant activities of edible coatings
tenible a las películas sintéticas que hoy en día se enriched with natural plant extracts: In vitro and in vivo
utilizan. studies. Postharvest Biology and Technology 2008;
7. Al analizar de forma conjunta las propiedades de las 49: 294-300.
biopelículas de caseinato de sodio y calcio plastifica- [10] Peltzer M, Wagner J, Jiménez A. Migration study of
das con glicerol al 15 %, 25 % y 35 % en peso, sin carvacrol as a natural antioxidant in high-density po-
adición y con un 10% en peso de carvacrol, se puede lyethylene for active packaging. Food Additives &
concluir que la formulación de caseinato de sodio Contaminants: Part A 2009; 26: 938-946.
plastificada con un 35 % en peso de glicerol y un 10% [11] Chalier P, Ben Arfa A, Preziosi-Belloy L, Gontard N.
en peso de carvacrol (NaCas-G35%-CV10%) es la Carvacrol Losses from Soy Protein Coated Papers as
más adecuada de todas las ensayadas. Esto se debe a Function of Drying Conditions. Journal of Applied
a que forma una biopelícula de superficie lisa y homo- Polymer Science 2007; 106: 611-620.
génea, sin separación de fases, con capacidad anti- [12] Sánchez-García MD, Ocio MJ, Giménez E, Lagaron
microbiana frente a E. coli y S. aureus; con buenas JM. Novel policaprolactone nanocomposites contai-
propiedades de barrera al oxígeno, alta ductilidad ning thymol of interest in antimicrobial film and coating
brindando a las biopelículas una flexibilidad aceptable applications. Journal of Plastic Film & Sheeting 2008;
para asegurar la posibilidad de utilización y que se 24:239-251.
desintegra rápidamente en condiciones de compos- [13] Mascheroni E, Chalier P, Gontard N, Gastaldi E. De-
taje. signing of a wheat gluten/montmorillonite based sys-
8. Por lo tanto, se puede considerar que el presente tra- tem as carvacrol carrier: Rheological and structural
bajo abre una posibilidad en una nueva línea de inves- properties. Food Hydrocolloids 2010; 24: 406-413.
tigación sobre obtención de sistemas de envasado [14] Schou M, Longares, A, Montesinos-Herrero C, Mona-
activo con características antimicrobianas formado por han FJ, O’Riordan D, O’Sullivan M.. Properties of edi-
materiales de origen natural, altamente biodegrada- ble sodium caseinate films and their application as
bles y con excelentes propiedades mecánicas y de food wrapping. LWT Food Science Technology 2005,
barrera al oxígeno. 38: 605-610.
28 | DESARROLLO DE UN SISTEMA DE ENVASADO ACTIVO: BIOPELÍCULAS DE PROTEÍNAS LÁCTEAS PARA UN DESARROLLO SOSTENIBLE

Agradecimientos
A la FUNDACION MAPFRE, específicamente al
Programa de Becas Ignacio Hernando de
Larramendi 2009 para la prevención y medio
ambiente, por conceder la beca que ha
financiado el presente trabajo.

A FERRER ALIMENTACION S.A. por proporcionar

las materias primas (caseinatos).

Al departamento de Química Analítica, Nutrición

y Bromatología de la Universidad de Alicante
donde se ha realizado el presente trabajo.