Rotavirus, un número importante de muestras

ES procederán de la población pediátrica, al ser el sector

más vulnerable a desarrollar síntomas que puedan
poner en peligro la integridad de los pacientes.

STICK/SIMPLE ROTAVIRUS · Incidencia en la población de la

enfermedad
USO EXCLUSIVO PROFESIONAL Hay numerosas publicaciones que señalan a rotavirus y
adenovirus, junto con norovirus, como los mayores
ESTAS INSTRUCCIONES DEBEN DE SER LEÍDAS CON responsables de las infecciones gastrointestinales
ATENCIÓN ANTES DE PROCEDER A UTILIZAR EL TEST. víricas a nivel mundial. Se estima una prevalencia de
virus gastrointestinales del 21% para rotavirus, 13%
INTRODUCCIÓN para norovirus y 5% para adenovirus en población
· Intención de uso pediátrica entre 0 y 28 meses4. Además, se observa
Test inmunocromatográfico en un solo paso para la ayuda que la coinfección más frecuente se produce entre
al diagnóstico de la infección gastrointestinal causada por rotavirus y norovirus con una frecuencia del 50%,
rotavirus mediante la detección cualitativa de los seguida de rotavirus y adenovirus sobre el 16%; e
antígenos de rotavirus en heces humanas. Una señal incluso en un 6% de los casos se ha detectado
positiva en la banda positiva del test proporciona indicios infección múltiple por los tres virus.
de una posible infección causada por rotavirus, lo que Con respecto a la estacionalidad del virus, este mismo
debería contribuir al diagnóstico del paciente. En el caso estudio4 indica que las infecciones por rotavirus
de obtener un resultado negativo para un paciente que parecen ser significativamente más frecuentes de marzo
presenta la sintomatología típica de este tipo de a mayo.
infecciones, se recomienda confirmar el resultado por
otras técnicas. · Características de Rotavirus y su infección1,2,3
Los resultados de esta prueba deben ser evaluados por el Los rotavirus son un tipo de virus de RNA de doble
médico clínico en combinación con otra información cadena pertenecientes a la familia Reoviridae. Son
clínica disponible del paciente. No deben utilizarse como virus que poseen una baja dosis infectiva, cuyo
el único criterio para diagnosticar esta infección. mecanismo de transmisión es el contacto directo de
La prueba es cualitativa y su ejecución no está una persona a otra por vía feco-oral y, menos
automatizada, aunque la interpretación de los resultados frecuentemente, a través de agua y alimentos
puede hacerse visualmente o mediante un lector de tiras. contaminados. El rotavirus es uno de los principales
agentes etiológicos de las gastroenteritis agudas en
Esta prueba se usa exclusivamente para diagnóstico in todo el mundo y el principal agente causal de
vitro. deshidratación grave en niños entre 6 meses y 2 años,
Es un test para uso por profesionales. No es una prueba tanto en países en vías de desarrollo, donde muestra
diagnóstica en el lugar de asistencia al paciente. No es un una elevada mortalidad, como en desarrollados. A la
test de uso de autodiagnóstico. edad de 5 años la mayoría de los niños (>95%) ha
sufrido, al menos, un episodio de gastroenteritis
· Información general producida por rotavirus. Aunque el desarrollo de
El test Stick/Simple Rotavirus permite la detección de vacunas está permitiendo reducir la incidencia, tan
rotavirus en una tira. sólo algunos países han logrado implementarlas en su
El test está basado en la captura inmunológica de programa nacional de inmunización. Este virus se
micropartículas coloreadas cuando pasan a través de una clasifica en siete serogrupos antigénicos (A a G). Sólo
membrana sobre la que se han inmovilizado anticuerpos los grupos A, B y C infectan al ser humano, siendo el
monoclonales específicos frente a rotavirus. grupo A el causante de casi todos los casos.
Cada vez más se insiste en la recomendación de emplear
inmunoensayos rápidos para la detección de rotavirus. FUNDAMENTO O PRINCIPIOS BÁSICOS DEL
Algunas publicaciones4,5, defienden el empleo de test TEST
rápidos inmunocromatográficos para la detección de virus El test Stick/Simple Rotavirus es un test
intestinales pues, si bien no alcanzan el nivel de inmunocromatográfico que utiliza una combinación
sensibilidad de los métodos moleculares, ofrecen de:
destacadas ventajas como la rapidez y facilidad con que se 1. Partículas de látex rojas conjugadas a un anticuerpo
obtienen los resultados. específico frente al antígeno VP6 del grupo A de
rotavirus que coopera con un anticuerpo específico
· Población a la que está destinada la prueba para rotavirus situado en la membrana bajo la banda
Si bien cualquier sector de la población puede estar de control.
afectado por el virus detectado por el test Stick/Simple 2. Partículas de látex azul conjugadas a un antígeno

1
reconocido por un anticuerpo específico para dicho MATERIALES NO INCLUIDOS EN EL KIT
antígeno unido a la membrana conformando la llamada - Cronómetro.
banda de control del test. - Dispositivos adecuados para la toma de muestra
En este test la muestra se trata, en primer lugar, con el fecal (en el formato Stick).
tampón diluyente de la muestra (incluido en este kit) para - Tubos de ensayo/microtubos (en el formato Stick).
conseguir la extracción del virus a partir de la matriz. Tras - Pipetas graduadas (en el formato Stick).
la extracción, sólo se necesita añadir un volumen - Vortex.
determinado de sobrenadante en la tira reactiva y esperar
5 minutos. Existen controles a disposición del usuario para validar
Al aplicar la muestra al test, las partículas coloreadas los resultados obtenidos, que se pueden adquirir como
migran. En el caso de una muestra positiva, los una referencia comercial independiente.
anticuerpos presentes en las partículas reaccionarán con
los antígenos víricos, formando un complejo partícula- EQUIPOS PARA LA INTERPRETACIÓN DE
antígeno que, a su vez, será retenido en la membrana por RESULTADOS
otros anticuerpos específicos para el virus, dando lugar a El test puede interpretarse visualmente o mediante el
la aparición de una línea roja. uso del lector de test de inmunocromatografía de
Diferentes líneas de color (azul -control- y roja -test-) serán OPERON.
visibles, dependiendo del contenido de virus en la Para este diagnóstico, se ha evidenciado una
muestra. Estas líneas se usan para interpretar el resultado concordancia entre la interpretación visual y con el
a los 5 minutos de incubación a temperatura ambiente lector de tiras IC OPERON mayor de un 99,9%.
(ver Fig.1)
OPERON Lateral Flow Reader
FORMATOS DEL TEST
El test Stick/Simple Rotavirus está disponible en dos IUL, S.A.
formatos diferentes: Carrer de la Ciutat d'Asunción, 4
- Formato Stick: se trata de la tira reactiva envasada en un 08030 Barcelona, ESPAÑA
sobre de aluminio. Se necesita un tubo o un pocillo de Referencia comercial: [Link].000
tipo microplaca de 96 pocillos y fondo plano para
depositar la muestra extraída y correr el test. PRECAUCIONES
- Formato Simple: se trata de la tira reactiva en el interior 1. Las muestras de los pacientes (heces) deben ser
de una carcasa de plástico. Las muestras extraídas se manipuladas con cuidado ya que pueden contener
añaden directamente a la ventana de muestra de la agentes infecciosos. A lo largo de todo el proceso se
carcasa señalizada con una flecha. deben usar guantes desechables.
Ambos formatos tienen las mismas prestaciones, la única 2. El tampón de dilución de la muestra contiene azida
diferencia está relacionada con la forma de ejecutar el test de sodio al 0,095% como agente anti-microbiano.
(ver más abajo los apartados de “Procedimiento” Evitar el contacto directo con la piel y las mucosas.
correspondientes). Desechar de forma apropiada. No usar el tampón si
Estas instrucciones de uso aplican a cualquier referencia manifiesta indicios de contaminación o precipitación.
comercial del producto: [Link] El tampón de dilución de la muestra contiene material
de origen animal (suero bovino). Todos los materiales
MATERIALES INCLUIDOS EN EL KIT de origen animal utilizados son referencias comerciales
Formato Stick: y tienen su certificado asociado que evidencia que no
- 20 dispositivos de reacción. son infecciosos.
- 1 vial que contiene el tampón de dilución de la muestra. 3. No comer, beber, fumar, almacenar o preparar
- Instrucciones de uso (completas y/o resumidas). alimentos en la zona donde se manejan los reactivos y
Formato Simple: las muestras.
- 20 dispositivos de reacción. 4. Una vez finalizada la tarea, limpiar las superficies de
- 20 viales con tampón de dilución de muestra. trabajo con agua y jabón y terminar desinfectando con
- Instrucciones de uso (completas y/o resumidas). una solución adecuada. Por último, eliminar los
- Datamatrix (para la interpretación de resultados con guantes y lavar las manos con agua y jabón
lector en función de la referencia comercial). frotándolas bien.
5. No intercambiar los componentes de kits con
La información sobre la composición de los reactivos se distinto numero de lote.
indica en la ficha de seguridad del producto. Puede 6. En el caso de almacenar el test refrigerado, dejar
solicitar una copia de la misma a través de la dirección de que todos los componentes del kit y las muestras
correo electrónico msds@[Link] alcancen la temperatura ambiente, pues reactivos y/o
muestras fríos pueden reducir la funcionalidad del test.
Se recomienda esperar de 20 a 30 minutos para
alcanzar la temperatura ambiente.
2
7. Utilizar todos los reactivos únicamente in vitro. envoltorios de aluminio.
8. Las tiras inmunocromatográficas son de un sólo uso. Se Se deben utilizar las tiras reactivas una vez
utiliza una tira por cada muestra a analizar. atemperadas (si se almacenan refrigeradas) y abierto
9. No usar los componentes del kit después de las fechas su envoltorio protector.
de caducidad. El producto mantiene la estabilidad reclamada una vez
10. En caso de rotura de la caja externa, el producto abierto.
puede ser utilizado si ninguno de los componentes ha sido
dañado. MUESTRAS
11. En caso de rotura o alteración del envasado primario ▪ Este test está diseñado para analizar muestras fecales
desechar el test. humanas.
12. Sacar la tira o el dispositivo de la bolsa de aluminio ▪ Se recomienda recoger la muestra fecal tan pronto
cuando vaya a realizarse el ensayo, para evitar exponer el como aparezcan los síntomas (diarreas y vómitos).
producto innecesariamente en exceso a factores ▪ No usar muestras que hayan sido recogidas en
ambientales que puedan perjudicarlo. medios de transporte o se les hayan añadido agentes
13. En el caso del formato Simple, es muy importante de conservación (como PVA o similares) o medios de
añadir el volumen correcto de muestra extraída al enriquecimiento ya que su presencia podría interferir
dispositivo de reacción. Si es inferior al indicado, puede con la correcta ejecución del test.
ser que no se realice la cromatografía porque no llegue ▪ Se recomienda analizar muestras frescas sin tratar. Si
suficiente muestra a la zona de reacción; si es superior, el se tienen que conservar durante un tiempo, pueden
exceso de volumen podría derramarse por el interior del guardarse en el frigorífico (+2-8ºC) durante 1 ó 2
dispositivo y afectar al correcto desarrollo de la días. Para tiempos más largos, deben congelarse a -
cromatografía. 20ºC teniendo en cuenta que algunas muestras
14. Es aconsejable que la tira, una vez utilizada se pierden inmunoreactividad tras haber sido congeladas.
manipule teniendo las mismas consideraciones que con la ▪ Si bien se recomienda analizar la muestra tratada
muestra. Se recomienda gestionarla como material con el tampón diluyente del test lo antes posible, se ha
potencialmente peligroso. comprobado que las muestras diluidas son estables a -
15. El producto usado debe desecharse conforme a la 20ºC y +2-8ºC durante un máximo de 4 días. No se
legislación vigente. recomienda emplear temperaturas más altas como la
16. No usar el test si aparece alguna línea de color en la temperatura ambiente.
zona de resultados antes de empezar a usarlo. ▪ Prestar especial atención cuando se analicen
17. Es muy importante tomar la cantidad adecuada de muestras hemorrágicas pues suelen dar problemas de
muestra: unos 75 mg si son muestras sólidas o semi- inespecificidad cuando el contenido en sangre es
sólidas (una bolita pequeña de unos 4 mm de diámetro) ó elevado. Un indicio de esta inestabilización del test
150 µl si son muestras líquidas; estas cantidades se suele ser la alteración del color azul de la banda de
extraen en 1,5 ml de diluyente de la muestra incluido en el control.
kit. ▪ En caso de congelación, descongelar totalmente las
Un exceso de muestra en relación a la cantidad de muestras a temperatura ambiente antes de proceder a
tampón añadida impide que la cromatografía transcurra su análisis.
de forma correcta; esto es especialmente crítico en el caso ▪ Evitar ciclos de congelación y descongelación con las
de muestras sólidas ya que no es tan sencillo tomar la muestras fecales ya que se puede alterar el
cantidad recomendada de muestra. Un defecto de muestra reconocimiento inmunológico del virus.
en relación a la cantidad de tampón añadida puede
afectar al resultado del test; esto es especialmente crítico PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS
en el caso de las muestras con baja concentración de Nota General: a lo largo del desarrollo del test, deben
analito. usarse guantes desechables debido al manejo de
18. No tirar la caja externa del kit hasta que se haya muestras potencialmente infecciosas. Una vez
utilizado todo el contenido. La caja contiene información finalizado el trabajo, proceder con la higiene de
esencial respecto al marcado CE del producto y acuerdo al punto 4 del apartado “Precauciones”.
lotificación.
19. Cualquier incidente grave relacionado con el producto Formato Simple
deberá comunicarse al fabricante y a la autoridad 1. Homogeneizar bien con el fin de obtener una
competente del Estado miembro en el que estén muestra lo más representativa posible.
establecidos el usuario y/o el paciente. 2. Desenroscar el tapón del vial con cuidado de no
derramar el tampón de extracción. Si las heces son
ALMACENAMIENTO sólidas o semi-sólidas, tomar con el extremo del
El producto Stick/Simple Rotavirus se puede conservar a aplicador 75 mg (una bolita pequeña de unos 4 mm
cualquier temperatura comprendida entre +2 y +30 ºC. de diámetro). Si las heces son líquidas coger con
Su fecha de caducidad está impresa en los tubos o en los ayuda de una pipeta 150 µl y transferirlos al vial.

3
3. Introducir el aplicador con la muestra en el vial. IMPORTANTE: el líquido no debe nunca alcanzar la
Enroscar bien el tapón y agitar vigorosamente para zona donde están las flechas.
asegurar una mezcla homogénea. 4. Esperar 5 minutos y leer el resultado en la zona
4. Analizar la muestra lo antes posible con el test central blanca de la tira (ver Fig. 1).
Stick/Simple Rotavirus (ver apartado “Procedimiento de la
Prueba”). LECTURA DE RESULTADOS
Las tres imágenes que aparecen a continuación en la
Formato Stick Fig. 1 son un ejemplo de los distintos resultados que se
1. Homogeneizar bien con el fin de obtener una muestra pueden obtener con el test Stick/Simple Rotavirus.
lo más representativa posible. Se distinguen dos bandas coloreadas diferentes:
2. Tomar un tubo de ensayo o microtubo por muestra. Banda azul superior: constituye la banda de control
Añadir aproximadamente 1,5 ml de tampón. que indica un correcto funcionamiento del test.
3. Seguidamente, si las heces son sólidas o semi-sólidas, Banda roja inferior: indica presencia presencia de
tomar 75 mg de heces (una bolita pequeña de unos 4 mm rotavirus de en la muestra.
de diámetro) y resuspenderla en el tampón. Si las heces La banda azul de control debe aparecer siempre. La
son líquidas coger con ayuda de una pipeta 150 µl de presencia adicional de la banda roja indica la
muestra. presencia de rotavirus en la muestra.
4. Agitar vigorosamente para lograr una suspensión de la • Tira 1: resultado NEGATIVO.
muestra en el diluyente (alternativamente, agitar en el
Sólo aparece una línea transversal AZUL (en formato
Vortex durante 15 segundos).
Simple alineada con la letra “C” marcada en la
5. Esperar al menos 3 minutos hasta que las partículas
carcasa). Esta línea constituye la banda de control y
sólidas se hayan depositado en el fondo o centrifugar por
debe aparecer siempre ya que indica que la
un minuto a 700 xg, y con la ayuda de una pipeta
cromatografía transcurre con normalidad.
transferir 150 µl del sobrenadante a otro tubo de ensayo,
microtubo o uno de los 96 pocillos de una microplaca con • Tira 2: resultado POSITIVO.
fondo plano. Aparece una banda AZUL (control). Inmediatamente
6. Analizar la muestra lo antes posible con el test debajo de ella, aparece una banda ROJA (en formato
Stick/Simple Rotavirus (ver apartados de “Procedimiento”). Simple alineada con el rótulo “T” marcado en la
carcasa). La intensidad depende de la concentración
PROCEDIMIENTO SIMPLE del analito en la muestra.
Una vez que las muestras se han preparado como se • Tira 3: resultados INVÁLIDOS.
indica en los apartados anteriores, se procede de la No aparece la banda de control AZUL, el color azul de
siguiente manera: la banda de control aparece claramente alterado o
1. Sacar el dispositivo de reacción de la bolsa de aluminio. aparecen colores inespecíficos en la banda positiva
Desechar la bolsita de desecante puesto que sólo sirve (diferentes al rojo). Cualquier combinación de colores
para preservar el test de la humedad y no se emplea en la diferente a las indicadas más arriba, indica un
realización del test. funcionamiento anómalo del test. Algunas de las
2. Romper el extremo superior del vial. causas que justifican este hecho pueden ser:
3. Añadir 3 gotas en la zona para la muestra del - algunos de los reactivos se han deteriorado o el test
dispositivo de reacción (ventana circular señalada con una ha caducado.
flecha). Tratar de no añadir partículas sólidas con el - la muestra no se ha preparado de acuerdo a las
líquido. instrucciones de uso.
4. Esperar 5 minutos, leer e interpretar el resultado. - la muestra tiene un alto contenido en sangre.
Ante un resultado inválido, se recomienda repetir el test
PROCEDIMIENTO STICK con una nueva tira siguiendo estrictamente las
Una vez que las muestras se han preparado como se instrucciones de uso descritas en este manual.
indica en los apartados anteriores, se procede de la En el caso de las muestras con sangre, se aconseja el
siguiente manera: uso de una técnica alternativa si el problema de la
1. Sacar la tira de reacción de la bolsa de aluminio. inestabilización persiste pues éste no suele depender de
Desechar la bolsita de desecante puesto que sólo sirve la tira empleada sino de la propia matriz de la
para preservar el test de la humedad y no se emplea en la muestra.
realización del test. Toda línea que por la naturaleza de la muestra pueda
2. Si se usa un micro-tubo o una microplaca de 96 pocillos aparecer pasados los 5 minutos de reacción no tendrá
con fondo plano, tomar 150 µl del sobrenadante de la valor diagnóstico.
muestra y depositarlo en el microtubo o en la microplaca.
3. Introducir la tira reactiva en el microtubo o en el pocillo
de la microplaca con las flechas del adhesivo superior
indicando hacia abajo.

4
CAPACIDAD DE DETECCIÓN Dos de las tres muestras discrepantes falsos positivos
Se ha determinado empleando unas partículas virales del fueron analizadas por RT-PCR, siendo una de ellas
virus tipo Nebraska Calf Diahorrea (NCDV) de la positiva en rotavirus, lo que sugiere que es un falso
compañía Ingenasa. El test Stick/Simple Rotavirus negativo por el ELISA RIDASCREEN® Rotavirus. La otra
interpretado visualmente y con el Lector de flujo lateral de muestra dio un resultado negativo en rotavirus. La
OPERON, alcanza una capacidad de detección de 8 ng/ml tercera muestra falso positivo fue analizada por otro
cuando se emplea esta preparación del virus. test Inmunocromatográfico de detección de antígenos
de rotavirus, dando un resultado negativo. Esto sugiere
ESPECIFICIDAD ANALÍTICA que ambas muestras son falsos positivos con el test de
Los anticuerpos monoclonales utilizados en producto OPERON.
Stick/Simple Rotavirus presentan una especificidad única En cuanto a las dos muestras discrepantes falsos
para la proteína VP6 de rotavirus (proteína mayoritaria de negativos, una de ellas fue analizada por RT-PCR
la cápside). No se ha detectado reacciones cruzadas con dando un resultado negativo, lo que sugiere que es un
otros antígenos y/o microorganismos presentes en las falso positivo por el ELISA RIDASCREEN® Rotavirus. La
muestras fecales. Ver el apartado de reactividad cruzada. otra muestra, fue analizada por otro test rápido dando
igualmente un resultado negativo.
SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD DIAGNÓSTICA
3. Evaluación Interna frente al test Rota-Strip de Coris
1. Evaluación interna frente a la RT-PCR
BioConcept
Se ha realizado una comparativa entre el test rápido
Se ha realizado una comparativa entre el test rápido
Stick/Simple Rotavirus y la RT-PCR. El estudio incluye el
Stick/Simple Rotavirus y test rápido Rota-Strip de
análisis de un total de 37 muestras, de las cuales 20 eran
CorisBioConcept como técnica de referencia. El
negativas y 17 eran positivas por RT-PCR.
estudio incluye el análisis de un total de 179 muestras,
Los resultados obtenidos mediante la interpretación visual
de las cuales 143 eran negativas y 36 positivas por el
del test fueron los siguientes:
test rápido Rota-Strip.
Los resultados obtenidos mediante la interpretación
RT-PCR visual del test fueron los siguientes:
ROTAVIRUS
Positivo Negativo

Positivo 20 0 Rota-Strip
Stick/Simple ROTAVIRUS
Rotavirus Positivo Negativo
Negativo 0 17
Stick/Simple Positivo 36 4
Concordancia sensibilidad= 20/(20+0)*100 >99,9 % Rotavirus Negativo 0 139
Concordancia especificidad= 17/(17+0)*100 >99,9 %

Concordancia sensibilidad=36/(36+0)*100>99,9 %
2. Evaluación Interna frente al ELISA RIDASCREEN ® Concordancia especificidad=139/(139+4)*100=97,2%
Rotavirus de R-Biopharm
Se ha realizado una comparativa entre el test rápido Tres de las cuatro muestras discrepantes falsos positivos
Stick/Simple Rotavirus y el ELISA comercial RIDASCREEN® fueron analizadas por RT-PCR. Dos de ellas resultaron
Rotavirus como técnica de referencia. El estudio incluye el positivas en Rotavirus, lo cual sugiere que son falsos
análisis de un total de 179 muestras, de las cuales 140 negativos por el test Rota-Strip. La otra muestra
eran negativas y 39 positivas por el ELISA RIDASCREEN® analizada por RT-PCR fue negativa. La cuarta muestra
Rotavirus. falso positivo fue analizada por un inmunoensayo
Los resultados obtenidos mediante la interpretación visual enzimático (ELISA), dando un resultado negativo. Esto
del test fueron los siguientes: que sugiere que ambas muestras son falsos positivos
con el test de OPERON.
ELISA RIDASCREEN®
REPETIBILIDAD
ROTAVIRUS Rotavirus
PRECISIÓN INTRA-ENSAYO
Positivo Negativo Se analizaron visualmente y con el lector de tiras IC
Positivo 37 3 OPERON cinco réplicas de una serie de diluciones ½
Stick/Simple del estándar interno (curva de sensibilidad) empleando
Rotavirus Negativo 2 137 un lote del producto Stick/Simple Rotavirus, el mismo
día por la misma persona. Se obtuvo una repetitividad
Concordancia sensibilidad=37/(37+2)*100= 94,9 % del 100% lo que indica una alta precisión intra-ensayo
Concordancia especificidad=137/(137+3)*100=97,9% del test.

6
 marcescens, Pseudomonas aeruginosa, Neisseria
REPRODUCIBILIDAD gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Candida
albicans, Branhamella catarrhalis, Bordetella pertussis,
PRECISIÓN INTER-DÍA
Proteus vulgaris, Staphylococcus saprophyticus,
Con un mismo lote del test Stick/Simple Rotavirus se midió
Streptococcus milleri, Enterococcus faecium a una
visualmente una curva de sensibilidad a lo largo de diez
concentración de 0,5x108 células/ml.
días espaciados en el tiempo. Los resultados fueron muy
reproducibles ya que se obtuvo una reproducibilidad del - Virus: Influenza tipo A H1N1 a 1.4x106 TCID50/ml,
100%. Influenza tipo A H3N2 a 3,0x106 TCID50/ml, Influenza
tipo B Victoria a 1,6x106 TCID50/ml, Influenza tipo B
PRECISION INTER-OPERADOR / INTER-LABORATORIO Yamagata a 1,5x107 TCID50/ml, Echovirus a 7,2x105
Tres personas midieron visualmente una curva de TCID50/ml, Poliovirus 2,2x107 TCID50/ml, Parainfluenza
sensibilidad por duplicado. Se observaron diferencias que 2,2x107 TCID50/ml, Adenovirus tipo 3 a 1,3x108
no superaron, en ningún caso, una dilución ½, lo cual es TCID50/ml, Adenovirus tipo 7 a 2,8x106 TCID50/ml,
asumible y tolerable por la técnica. Adenovirus tipo 40 5,6x105 TCID50/ml y Adenovirus tipo
41 a 1,0x106 TCID50/ml.
PRECISION INTER-LOTE
Con tres lotes distintos del test Stick/Simple Rotavirus se MODIFICACIONES RESPECTO A LA VERSIÓN
midió visualmente y con el lector de tiras IC OPERON una ANTERIOR DE ESTE DOCUMENTO
curva de sensibilidad por triplicado. El análisis lo realizó Se mejora la estructura de la información general
una única persona el mismo día. Las diferencias proporcionada al comienzo de las instrucciones,
observadas fueron iguales o menores a una dilución ½, lo desglosando los diferentes puntos para ser coherentes
cual es asumible y tolerable por la técnica. con los requisitos del Reglamento IVDR.
Se desglosan mejor los componentes del kit.
EFECTO HOOK O PROZONA
En cuanto a los parámetros de funcionamiento del test,
Se ha comprobado que el test Stick/Simple Rotavirus
se han incluido modificaciones en los siguientes
interpretado visualmente no presenta efecto Hook
apartados: “Precauciones”, “Muestras”, “Preparación
evaluando muestras reales fuertemente positivas de
de las muestras“, “Lectura de resultados”, “Limitaciones
rotavirus con un contenido vírico equivalente de hasta
del procedimiento”, “Capacidad de detección”,
8.192 ng/ml de partículas virales, y con el estándar
“Especificidad analítica”, “Sensibilidad y especificidad
interno de rotavirus hasta una concentración de 65.000
diagnóstica”, “Repetibilidad”, “Reproducibilidad”,
ng/ml.
“Efecto Hook o prozona”, anteriormente “Efecto Hook”,
“Sustancias interferentes” y “Reactividad cruzada”.
SUSTANCIAS INTERFERENTES
Las siguientes sustancias no mostraron ningún efecto en los
resultados visuales del test cuando fueron añadidas a
muestras fecales (positivas y negativas) a las ----------------
concentraciones indicadas en la siguiente tabla:

Bilirrubina 1 mg/ml Ácido ascórbico 20 mg/ml

Atropina sulfato
Hemoglobina 10 mg/ml 0,5 mg/ml
(Atropina [Link])
Acetamidofeno 1 mg/ml Cafeína 2,5 mg/ml

Ác. acetilsalicílico 2 mg/ml Glucosa 20 mg/ml

Ampicilina 0,5 mg/ml

REACTIVIDAD CRUZADA
Mediante la interpretación visual del test Stick/Simple
Rotavirus no se ha detectado reacción entrecruzada con los
siguientes microorganismos:
- Bacterias: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae,
Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus,
Staphylococcus epidermis, Staphylococcus haemolyticus,
Streptococcus grupo B, Streptococcus grupo C,
Streptococcus grupo G, Streptococcus agalactiae,
Streptococcus mutans, Streptococcus pneumoniae, Serratia
7
 · Disease or infection incidence among the
EN intended test population
Many publications point to rotavirus - along with
adenovirus and norovirus - as being one of the main
STICK/SIMPLE ROTAVIRUS sources of viral gastrointestinal infections worldwide.
Among children aged 0 to 28 months4, the estimated
gastrointestinal virus prevalence is 21 % for rotavirus,
FOR PROFESSIONAL USE ONLY
13 % for norovirus, and 5 % for adenovirus.
PLEASE READ THESE INSTRUCTIONS CAREFULLY BEFORE
Furthermore, there is evidence of the most frequent co-
USING THE TEST.
infection occurring between rotavirus and norovirus,
with a frequency of 50%, followed by rotavirus and
adenovirus at around 16%; and even 6% of cases have
INTRODUCTION
been detected to have a multiple infection with all three
· Intended use viruses.
A single-step immunochromatographic test to aid in the Regarding the seasonality of the virus, the same study 4
diagnosis of the gastrointestinal infection caused by indicates that rotavirus infections appear to be
rotavirus, by means of the qualitative detection of rotavirus significantly more frequent from March to May.
in human stools. A positive signal on the positive test line
gives an indication that a rotavirus infection may be · Characteristics of rotavirus and its
present, which should help with the patient’s diagnosis. In infection1,2,3
the event of obtaining a negative result for a patient Rotaviruses are double-stranded RNA viruses belonging
presenting the typical symptomatology from this type of to the Reoviridae family. These viruses have a low
infection, confirming the result using other techniques is infectious dose, with transmission via direct contact
recommended. between one person and another, either through faeces
The test results should be evaluated by doctors in or orally, and less commonly, through contaminated
combination with other clinical information about the food and water. Rotavirus is one of the main
patient. They should not be used as the only criterion for aetiological agents of acute gastroenteritis worldwide
diagnosing the infection. and the main causal agent of severe dehydration
The test is qualitative and its execution is not automated, among children aged 6 months to 2 years old, both in
although the results interpretation can be done visually or developing countries, where a high mortality rate
by using a strip reader. occurs, and in developed countries. Most of the world's
This test is exclusively for in vitro diagnostic use. children (> 95%) have experienced at least one
This test is for professional use. This is not a diagnostic test episode of rotavirus-induced gastroenteritis by the age
for use at the patient care location. This is not a self- of 5. Although the development of vaccines is helping
diagnostic test. to reduce the incidence, only a few countries have
managed to implement them in their national
· General information immunisation programs. This virus is classified into
The Stick/Simple Rotavirus test can detect rotavirus on a seven antigenic serogroups (A to G). Only groups A, B
strip. and C infect human beings, with group A the source of
The test is based on the immunological uptake of coloured almost all cases.
microparticles as they pass through a membrane bound
with specific monoclonal antibodies that target rotavirus. THE BASIS OR BASIC PRINCIPLES OF THE TEST
The use of rapid immunoassays for the detection of The Stick/Simple Rotavirus test is an
rotavirus is increasingly recommended. Some immunochromatographic test that uses a combination
4,5
publications , support the use of of:
immunochromatographic rapid tests for the detection of 1. Red latex particles conjugated to a specific antibody
intestinal viruses because, although they do not reach the that targets the VP6 antigen from the group A rotavirus,
sensitivity level of molecular methods, they offer important which works in conjunction with another specific
advantages such as the speed and simplicity with which antibody for rotavirus located on the membrane below
results are obtained. the control line.
2. Blue latex particles conjugated to an antigen
· Intended test population recognised by a specific antibody for that antigen and
Although any population group can be affected by the bound to the membrane, forming the so-called test
virus detected using the Stick/Simple Rotavirus test, a control line.
significant number of samples will come from children, For this test, the sample is first treated with the sample
given they are most susceptible to developing symptoms dilution buffer (included in this kit) to extract the virus
that could endanger patient health. from the matrix. Once extracted, simply add a specific
volume of the supernatant to the reagent strip and wait
for 5 minutes.
8
The coloured particles migrate when the extracted sample agreement between visual interpretation and the
flows along the strip. In the event of a positive sample, the OPERON IC strip reader.
antibodies present in the particles will react with the virus
antigens, forming a particle-antigen complex, which will OPERON Lateral Flow Reader
also be retained on the membrane by other specific
IUL, S.A.
antibodies for the virus.
Carrer de la Ciutat d'Asunción, 4
Different coloured lines (blue -control- and red -test-) will
08030 Barcelona, SPAIN
appear depending on the virus content in the sample.
Commercial reference: [Link].000
These lines are used to interpret the result after 5 minutes
of incubation at room temperature (see Fig.1).
PRECAUTIONS
THE TEST’S FORMATS 1. Patient samples (stools) must be handled with care
The Stick/Simple Rotavirus test is available in two different as they may contain infectious agents. Disposable
formats: gloves must be worn throughout the process.
- Stick format: this is a reagent strip packaged inside an 2. The sample dilution buffer contains sodium azide at
aluminium sachet. A tube or a 96-well flat-bottomed 0.095% as an anti-microbial agent. Avoid direct
microplate is needed to deposit the extracted sample and contact with skin and mucosa. Dispose of
run the test. appropriately. Do not use the buffer if there are any
- Simple format: this is a reagent strip inside a plastic signs of contamination or precipitation.
housing. Extracted samples are added directly to the The sample dilution buffer contains material from
sample window marked with an arrow on the housing. animal origin (bovine serum). All the materials from
Both formats have the same characteristics, they only differ animal origin are commercial references, and have the
by the way the test is undertaken (see the corresponding certificate that evidences they are not infectious.
“Procedure” sections later in the document). 3. Do not store or prepare food, eat, drink, or smoke
These instructions for use apply to any trade reference for in the area where the reagents and samples are
the product: [Link] handled.
4. On completing the task, clean all work surfaces with
MATERIALS INCLUDED IN THE KIT soap and water, and disinfect them with a suitable
solution. Lastly, dispose of the protective gloves
Stick format:
correctly and wash your hands with soap and water,
- 20 reaction devices.
rubbing them well.
- 1 vial containing the sample dilution buffer.
- Instructions for use (complete and/or summarised). 5. Do not exchange components from kits with different
batch numbers.
6. If the test is stored refrigerated, allow all kit’s
Simple format:
components and samples to reach room temperature,
- 20 reaction devices.
as cold reagents and/or samples may reduce the test’s
- 20 vials containing sample dilution buffer.
functionality. Waiting for 20 to 30 minutes to reach
- Instructions for use (complete and/or summarised).
room temperature is recommended.
- Datamatrix (depending on the commercial reference – for
interpretation of results with reader). 7. Only use the reagents in vitro.
8. The immunochromatographic strips are single use.
One strip is used for each sample requiring analysis.
The product's safety sheet contains information about the
9. Do not use any of the kit’s components after the
composition of the reagents. An electronic copy of the
use-by-dates.
sheet can be requested via email to msds@[Link]
10. If the outer box is damaged, the product can still
be used providing none of the components have been
MATERIALS NOT INCLUDED IN THE KIT
damaged.
- A stopwatch. 11. Throw the test away if the primary packaging is
- Suitable devices for sampling stools (for the Stick format). either broken or impaired.
- Test tubes/microtubes (for the Stick format). 12. Remove the strip or device from the aluminium bag
- Graduated pipettes (for the Stick format). when the test is going to be performed to avoid
- A vortex mixer. unnecessary excessive exposure of the product to any
potentially damaging environmental factors.
Controls are available for the user to validate the results, 13. Adding the correct volume of extracted sample to
and can be purchased as a separate trade reference. the reaction device is very important for the Simple
format. If lower than indicated, the chromatography
EQUIPMENT FOR INTERPRETING THE RESULTS may not develop because insufficient sample reached
The test can be interpreted visually or using OPERON’s the reaction zone; if higher than indicated, excessive
immunochromatographic test reader. volume could spill inside the device, and the
For this diagnosis, there is evidence of a > 99.9% chromatography may not develop correctly.

9
14. Once it is used, it is advisable to manipulate the ▪ Pay special attention when analysing haemorrhagic
reaction device taking into account the same samples since they usually cause non-specificity
considerations as for the sample. It should be managed as problems when the blood content is high. An indication
a potential biohazardous material. of this test instability is usually a change in the green
15. Please dispose of the used product in accordance with colour of the control line.
current legislation. ▪ Allow any frozen samples to fully thaw to room
16. Do not use the test if there are any coloured lines in temperature before analysing them.
the results zone prior to use. ▪ Avoid freeze-thaw cycles with stool samples as this
17. Sampling a suitable amount is very important: around may affect the immunological recognition of the virus.
75 mg if they are solid or semi-solid samples (a small
pellet around 4 mm in diameter) or 150 µl if they are SAMPLE PREPARATION
liquid samples; these amounts are extracted in 1.5 ml of General Note: use disposable gloves throughout the
the sample diluent included in the kit. test as potential infectious samples are being handled.
Too much sample could prevent the chromatography from On completion, follow the hygiene procedures in point
developing correctly. This is especially critical with solid 4 of the “Precautions” section.
samples, as sampling the recommended amount is not that
simple. A sample becomes defective when an incorrect Simple format
quantity of buffer is added to it. This inaccuracy can affect 1. Mix well in order to obtain as representative a
the test result and is especially critical for samples with a sample as possible.
low concentration of analyte. 2. Carefully unscrew the vial cap to avoid spilling the
18. Do not discard the kit's outer box until all the content extraction buffer. If the stool is solid or semi-solid,
has been used. The box contains essential information sample 75 mg using the end of the applicator (a small
about the product’s CE marking and the batch number. pellet around 4 mm in diameter) If the stool is liquid,
19. Any serious incident involving the product must be use a pipette to sample 150 µl and transfer it to the
reported to the manufacturer and the relevant authority in vial.
the member state where the user and/or patient are 3. Introduce the applicator with the sample into the
located. vial. Screw the cap on tightly and agitate vigorously to
ensure a homogeneous mixture.
STORAGE 4. Analyse the sample as soon as possible with the
The Stick/Simple Rotavirus product can be stored at any Stick/Simple Rotavirus test (please see the “Test
temperature from +2 to +30 ºC. Procedure” section).
The use-by date is printed on the tubes or aluminium
wrappers. Stick format
The reagent strips must be used once the protective 1. Mix well in order to obtain as representative a
packaging has been opened after reaching room sample as possible.
temperature (if stored refrigerated). 2. Use one test tube or microtube per sample. Add
The product maintains the claimed stability once open. approximately 1.5 ml of buffer.
3. Then, if the stool is solid or semi-solid, sample 75
SAMPLES mg of stool (a small pellet around 4 mm in diameter)
▪ This test is designed to analyse human stool samples. and suspend it in the buffer. If the stool is liquid, use a
▪ Collecting the stool sample as soon as symptoms appear pipette to sample 150 µl.
is recommended (especially with diarrhoea and vomiting). 4. Agitate vigorously to suspend the sample in the
▪ Do not use samples that have been collected in transport diluent (or use a vortex for 15 seconds).
media, or after adding either preservative agents (such as [Link] for at least 3 minutes until the solid particles
PVA or similar) or enrichment media, as their presence have settled on the bottom, or centrifuge for 1 minute
could prevent the test from processing correctly. at 700 xg. Then use a pipette to transfer 150 µl of the
▪ Analysing fresh, untreated samples is recommended. If supernatant to another test tube, microtube, or one of
they need to be kept for a certain amount of time, they can the 96-well flat-bottomed microplates.
be stored in a refrigerator (+2 to 8ºC) for 1 or 2 days. 6. Analyse the sample as soon as possible with the
Longer time periods will require freezing them at -20ºC, Stick/Simple Rotavirus test (please see the “Test
bearing in mind that some samples lose their Procedure” section).
immunoreactivity after being frozen.
▪ Although analysing the sample treated with the test’s SIMPLE PROCEDURE
dilution buffer as soon as possible is recommended, After preparing the samples as indicated in the previous
diluted samples have been found to remain stable at - sections, proceed as follows:
20ºC and at +2 to +8ºC for up to 4 days. Using higher 1. Remove the reaction device from the aluminium bag.
temperatures such as room temperature is not Discard the small desiccant sachet as its sole purpose is
recommended. to keep the test dry and it is not used to perform the test.

10
LIMITATIONS OF THE PROCEDURE DETECTION CAPABILITY
1. The Stick/Simple Rotavirus test is design to help in the It has been determined using viral particles of the
diagnosis of the gastrointestinal infection caused by Nebraska Calf Diahorrea virus (NCDV) from the
rotavirus, detecting its presence in human stools as long as company Ingenasa. The Stick/Simple Rotavirus test,
the virus’s load is equal to or above the assay's limit of interpreted visually and with the OPERON Lateral Flow
detection. Reader, achieves a detection capacity of 8 ng/ml when
2. This test is qualitative, not quantitative, although the using this virus preparation.
intensity of the positive line does relate to the amount of
detectable virus in the stool sample. ANALYTICAL SPECIFICITY
3. The test shows good correlation with other techniques The monoclonal antibodies used in the Stick/Simple
(RT-PCR, ELISA and rapid test) after analysing a large Rotavirus product present unique specificity for the
number of stool samples. However, this study does not rule rotavirus VP6 protein (the main capsid protein). No
out any potential interference to the test’s functionality cross reactions with other antigens and/or micro-
when analysing other stool samples. organisms present in stool samples have been detected.
4. Using the correct amount of sample is important. See the cross-reactivity section.
A defective sample may lead to very weak positive results.
In this case, the test should be repeated with more sample, DIAGNOSTIC SENSITIVITY AND SPECIFICITY
while maintaining the recommended proportion with 1. Internal evaluation vs RT-PCR
respect to the sample diluent. On the other hand, excess A comparison between the Stick/Simple Rotavirus rapid
sample could cause the test to develop very slowly and test and RT-PCR has been performed. The study
even prevent it from developing correctly (control line not included the analysis of a total of 37 samples, of which
visible). In this case, the test should be repeated with a 20 were negative and 17 were positive by RT-PCR.
smaller amount of sample (see the “Sample preparation” The results obtained by visual interpretation of the test
section). were as follows:
5. A negative result does not rule out a potential rotavirus
infection. Not detecting this virus may result from factors RT-PCR
such as sampling during an unsuitable phase of the ROTAVIRUS
Positive Negative
disease (very small amounts of virus are excreted in stools);
incorrect storage of the sample; unsuitable transportation Positive 20 0
Stick/Simple
of the sample, and so on.
Rotavirus
6. A positive result does not rule out the presence of other Negative 0 17
pathogenic agents, which may lead to a co-infection of
rotavirus with other micro-organisms. In any case, co- Sensitivity concordance = 20/(20+0)*100 > 99.9 %
infections can only be clarified by differential diagnosis. Specificity concordance = 17/(17+0)*100 > 99.9 %
7. Analysing some samples can produce unclear and
undefined coloured lines, caused by negative samples in 2. Internal evaluation vs RIDASCREEN® Rotavirus ELISA
most cases. The test should be repeated if undefined The Stick/Simple Rotavirus rapid test and the
coloured lines appear. If the same result is obtained again, commercially available RIDASCREEN® Rotavirus ELISA
the analysis should be performed using another analytical were compared. The study included the analysis of 179
method. samples, 140 of which were negative and 39 were
8. Monitoring the reaction time is important. If the reaction positive by RIDASCREEN® Rotavirus ELISA.
time is shorter than indicated, samples containing a The results obtained by visual interpretation of the test
quantity of rotavirus above the limit of sensitivity will be were as follows:
clearly observed, but those on the limit will not appear. If
the reaction time is longer than indicated, the test’s RIDASCREEN® Rotavirus
sensitivity will be affected and can give rise to incorrect ELISA
ROTAVIRUS
interpretations.
Positive Negative
9. The test results must be interpreted alongside the
available data from epidemiological studies, the patient’s Positive 37 3
Stick/Simple
clinical evaluation, and other diagnostic procedures.
Rotavirus
10. The test can show positive results in the stools of Negative 2 137
healthy individuals who received the oral solution RotaTeq
vaccine in the previous 15 days. Sensitivity concordance = 37/(37+2)*100= 94.9 %
11. The performance of the assay has not been Specificity concordance = 137/(137+3)*100 = 97.9 %
established on neonates and premature babies.
12. Test results to verify the eradication efficacy (test of Two of the three false positive discrepant samples were
cure) have not been established. analyzed by RT-PCR. One of them gave a positive result
in rotavirus, suggesting that it is a false negative by the

12
RIDASCREEN® Rotavirus ELISA. The other sample gave a INTER-OPERATOR / INTER-LABORATORY PRECISION
negative result in rotavirus. The third false positive sample Three persons measured visually a sensitivity curve in
was analyzed by another Immunochromatographic test for duplicate. The differences were not observed to be
the detection of Rotavirus antigens, giving a negative more than one ½ dilution in any case, which is
result. These results suggest that both samples are false acceptable and tolerable for the technique.
positives with the OPERON test.
INTER-BATCH PRECISION
Regarding the two discrepant false negative samples, one A sensitivity curve was measured visually and with
of them was tested by RT-PCR with a negative result, OPERON Lateral Flow reader in triplicate using three
suggesting that it is a false positive by the RIDASCREEN® different batches of the Stick/Simple Rotavirus test. The
Rotavirus ELISA. The other sample was tested by another analysis was performed by one person on the same
rapid test, also giving a negative result. day. The differences were observed to be equal or less
than one ½ dilution, which is acceptable and tolerable
3. Internal evaluation vs Rota-Strip from Coris BioConcept for the technique.
The Stick/Simple Rotavirus rapid test and the commercially
available Rota-Strip from CorisBioConcept were THE HOOK OR PROZONE EFFECT
compared. The study included the analysis of 179 There is evidence that the Stick/Simple Rotavirus test
samples, 143 of which were negative and 36 were positive does not present a Hook effect when evaluating visually
by Rota-Strip test. strong positive samples of rotavirus with a viral load
The results obtained by visual interpretation of the test were equivalent of up to 8,192 ng/ml of viral particles, and
as follows: with the rotavirus internal standard up to a
concentration of 65,000 ng/ml.
Rota-Strip
ROTAVIRUS INTERFERING SUBSTANCES
Positive Negative
The following substances did not affect the test visual
Positive 36 4 results when added to stool samples (positive and
Stick/Simple
Rotavirus negative) at the concentrations shown in the following
Negative 0 139
table:

Sensitivity concordance = 36/(36+0)*100 > 99.9 %

Bilirubin 1 mg/ml Ascorbic acid 20 mg/ml
Specificity concordance = 139/(139+4)*100 = 97.2 %
Atropine
Three of the four discrepant false positive samples were sulphate (B.
Haemoglobin 10 mg/ml 0.5 mg/ml
tested by RT-PCR. Two of them were positive for rotavirus, Braun
suggesting that they are false negatives by the Rota-Strip atropine)
test. The other sample tested by RT-PCR was negative. The Acetaminophen 1 mg/ml Caffeine 2.5 mg/ml
fourth false positive sample was tested by enzyme-linked
immunoassay (ELISA), giving a negative result. These Acetylsalicylic acid 2 mg/ml Glucose 20 mg/ml
results suggest that both samples are false positives by the
Ampicillin 0.5 mg/ml
OPERON test.

REPEATABILITY CROSS-REACTIVITY
INTRA-ASSAY PRECISION By visual interpretation of the Stick/Simple Rotavirus test,
Five replicates from a series of ½ dilutions of a there is no evidence for cross-reactivity with the
characterised internal standard were analysed visually and following micro-organisms:
with the OPERON Lateral Flow Reader. The measurements - Bacteria: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae,
were taken using 1 batch of the product on the same day Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus,
by the same person. 100% repeatability was obtained. Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus
haemolyticus, Group B streptococcus, Group C
REPRODUCIBILITY streptococcus, Group G streptococcus, Streptococcus
agalactiae, Streptococcus mutans, Streptococcus
INTER-DAY PRECISION pneumoniae, Serratia marcescens, Pseudomonas
Using the same batch of the Stick/Simple Rotavirus test, a
aeruginosa, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus
sensitivity curve was visually measured at regular intervals
influenzae, Candida albicans, Branhamella catarrhalis,
over a ten day period. The results were very reproducible
Bordetella pertussis, Proteus vulgaris, Staphylococcus
as the same sensitivity was obtained for both analytes on
saprophyticus, Streptococcus milleri, Enterococcus
every day of analysis.
faecium at a concentration of 0.5x108 cells/ml.

13