Citometría de flujo
Tuberculosis
Inma Arellano y Lucía Moreno
ÍNDICE
01 Fundamento 02 Tipo de muestra
03 Protocolo 04 Calibración
05 Mantenimiento 06 Controles
07 Resultados 08 Precauciones
Introducción
La citometría de flujo es una técnica usada
para analizar células en suspensión. Permite
caracterizar subpoblaciones de linfocitos con
alta resolución. Se usa en diagnóstico y
estudios funcionales celulares.
Fundamento
La tuberculosis (TB) es una enfermedad infecciosa causada
por Mycobacterium tuberculosis.
Su diagnóstico tradicional se basa en la prueba de
tuberculina, cultivos bacterianos y PCR, pero la citometría de
flujo permite una evaluación más rápida y específica del
estado inmunológico del paciente.
Se usa principalmente para analizar la respuesta inmunitaria
de los linfocitos T frente a M. tuberculosis, mediante la
detección de marcadores específicos como la producción de
citocinas.
Funcionamiento del citometro de flujo
Se basa en dirigir una suspensión de células haciendo que pasen de
manera alineada y una por una frente a detectores capaces de medir
diversas características físicas y químicas mientras son iluminadas por un
láser.
Las características que se analizan en la citometría de flujo se dividen en
dos grupos:
La luz dispersada al incidir sobre la célula; tamaño y la granularidad.
Luz generada por la presencia de fluorocromos sobre la célula o
partícula, ya sea de manera natural (autofluorescencia) o artificialmente
mediante anticuerpos marcados.
La particularidad clave de esta tecnología es que las mediciones se realizan
individualmente en cada célula o partícula, no en un promedio de toda la
población, ya que pasan una a una a través de un punto específico de
análisis.
Funcionamiento del citometro de flujo
Forward Scatter
(FSC): Mide el
tamaño de la célula.
Side Scatter (SSC):
Indica la complejidad
interna o granularidad
de la célula.
Tipo de muestra
En el caso de la tuberculosis, la citometría de flujo se
realiza sobre muestras de sangre periférica.
Se aíslan linfocitos T mediante el método de gradiente
de densidad o lisis de eritrocitos.
Otras muestras posibles: esputo o lavado
broncoalveolar en TB pulmonar.
Protocolo
1. Recolección de la muestra
Se obtiene sangre periférica del paciente en tubos con anticoagulante
(ej. heparina o EDTA).
La sangre se mantiene a temperatura ambiente hasta su
procesamiento (máximo 6 horas después de la extracción).
2. Aislamiento de linfocitos
Se realiza separación por gradiente de densidad con Ficoll para
obtener células mononucleares de sangre periférica.
Se lava la muestra con tampón PBS.
Se cuantifican las células y se ajusta la concentración celular.
3. Estimulación con antígenos específicos
Se divide la muestra en tres tubos:
1. Muestra experimental: Se añaden antígenos específicos de M.
tuberculosis como ESAT-6 y CFP-10.
2. Control positivo: Se usa un mitógeno (ej. PMA/Ionomicina) para
verificar que las células pueden responder.
3. Control negativo: No se añade ningún estímulo, solo el medio de
cultivo.
Se incuban las muestras a 37°C con 5% de CO₂ durante 12-24 horas.
4. Bloqueo de secreción de citocinas (opcional)
Para detectar citocinas intracelulares, se añade un inhibidor de
secreción como Brefeldina A o Monensina, que evita que las citocinas
salgan de la célula.
Se incuba por 4-6 horas adicionales.
5. Marcaje con anticuerpos fluorescentes
Se añaden anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromos.
Se incuba en oscuridad a 4°C durante 30-60 minutos.
Se lava con PBS para eliminar anticuerpos no unidos.
6. Fijación y permeabilización
Se usa una solución de fijación con paraformaldehído para preservar
las células.
Para detectar citocinas intracelulares, se realiza una permeabilización
con detergentes suaves (ej. Saponina).
7. Análisis en el citómetro de flujo
Se ajustan los parámetros del citómetro:
Tamaño (FSC) y granularidad (SSC) para identificar linfocitos.
Compensación de fluorescencias para corregir solapamiento entre
fluorocromos.
Se analizan 10,000 – 50,000 por muestra.
8. Interpretación de datos
Calibración
Para asegurar resultados precisos en un citómetro de flujo, es
crucial llevar a cabo una serie de procedimientos que
garanticen su correcto funcionamiento y calibración.
Se realiza utilizando estándares o patrones de normalidad con
valores conocidos de fluorescencia o dispersión de la luz. Estos
estándares incluyen microesferas marcadas con fluorocromos que
emiten fluorescencia al ser excitados por distintos láseres. La
calibración busca maximizar la resolución, establecer el nivel de
ruido de fondo y determinar la línea base para una adecuada
detección de fluorescencia, disminuyendo las interferencias y
aumentando la reproducibilidad de los resultados.
Compensación de colores
Es una técnica para corregir la superposición de espectros de
fluorescencia cuando se usan múltiples fluorocromos en una
muestra.
Mantenimiento
El mantenimiento del citómetro de flujo es
fundamental para su correcto funcionamiento,
precisión y vida útil.
Existen varios tipos dependiendo de la
periodicidad con que se haga: mantenimiento
diario, semanal, mensual y preventivo
programado.
1. Mantenimiento diario:
Limpieza de fluidos. Administrar soluciones de limpieza (agua
destilada, detergentes suaves y etanol 70%) para evitar obstrucciones
en los tubos capilares y la celda del flujo.
Verificación de presión y flujo. Asegurar que no haya burbujas o
bloqueos en los sistemas de fluidos.
Limpieza de la aguja de muestreo. Evita la contaminación cruzada
entre muestras.
Revisión de láseres y detectores. Comprobar que las señales sean
estables y sin variaciones.
2. Mantenimiento semanal:
Descontaminación del sistema de fluidos con soluciones
específicas (hipoclorito de sodio diluido o detergentes
enzimáticos).
Limpieza de filtros ópticos y lentes con alcohol isopropílico o
productos recomendados por el fabricante.
Verificación de alineación de láseres con cuentas de
calibración.
3. Mantenimiento mensual:
Desmontaje y limpieza de la celda de flujo para evitar
acumulación de residuos.
Pruebas de calidad (calibración y alineación) con
microesferas fluorescentes.
Revisión de precisión y vacío en el sistema de fluidos.
4. Mantenimiento preventivo programado (cada 6-12 meses):
Lo realizan técnicos especializados. Incluye:
Revisión de componentes electrónicos.
Alineación de láseres.
Reemplazo de filtros.
Limpieza profunda de los sistemas ópticos y de fluidos.
Controles
Para obtener resultados fiables y reproducibles, es importante
aplicar los controles adecuados.
Los controles usados en citometría deflujo son anticuerpos.
Estos se usan para identificar marcadores de la superficie
celular, ya que permiten la detección de antígenos específicos.
Estos Ac específicos están marcados con fluoróforos
específicos, lo que hace que las células puedan clasificarse y
analizarse a la vez.
Controles de isotipo
Los controles de isotipo son Ac conjugados que
carecen de especificidad para la diana y se pueden
utilizar como controles negativos para estimar el nivel
de fondo de la tinción y la unión no específica de un
experimento.
Resultados
Los resultados obtenidos se pueden
representar por diferentes estilos, la
clave está en seleccionar los gráficos que
reflejen los resultados con precisión. Los
más usados son: gráficos de puntos,
gráficos de densidad, histogramas y
gráficos tridimensionales (3D).
1. Gráficos de puntos:
Relaciona 2 marcadores diferentes,
representando cada punto como un
evento (partícula excitada por el láser).
El movimiento de los puntos indica:
Hacia la derecha: expresión del
marcador X.
Hacia arriba: expresión del
marcador Y.
2. Gráficos de densidad:
Muestran la frecuencia relativa
(densidad) de las poblaciones.
Pueden incluir gráficos de zebra,
gráficos pseudocolor y gráficos
de contornos para ver de manera
efectiva las distribuciones de las
poblaciones celulares.
3. Histogramas:
Representan la intensidad de
expresión de un marcador en
función del número de eventos. El
desplazamiento hacia la derecha de
la curva indica una mayor expresión
del marcador, y la altura del pico
indica la frecuencia de las células
capturadas.
4. Gráficos tridimensionales (3D):
Permiten comparar las poblaciones
en función de la expresión de 3
marcadores diferentes y su
frecuencia relativa. También es
posible representar histogramas en
3D, lo que facilita la comparación de
la expresión de 2 marcadores
diferentes en relación con el número
de eventos.
Precauciones
Es importante tomar precauciones para asegurar nuestra seguridad, la
integridad de las muestras y la precisión de los resultados. Algunas de estas
precauciones son:
1. Protección personal: Usar EPIs adecuados, evitar el contacto directo con
muestras y reactivos.
2. Mantenimiento del equipo: asegurarnos de que está en buenas
condiciones antes de usarlo, realizando calibraciones y controles, además
de limpiarlo regularmente para evitar contaminaciones.
3. Manipulación de muestras: utilizar materiales estériles y preparar las
muestras según los protocolos específicos para cada tipo de análisis.
4. Operación del citómetro: seguir las instrucciones del fabricante para su
manejo y ajustar los parámetros para obtener resultados precisos.
5. Eliminación de desechos: usar un sistema adecuado para eliminar
residuos.
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