Reacción en Cadena de la Polimerasa y Electroforesis
Ericka Rojas Romero1; Kemberly Vargas Zamora2.
Laboratorio instrumentación y técnicas Biotecnológicas, Universidad de Costa Rica, Sede Occidente,
Recinto de Grecia. 1 ericka_cr14@[Link]; 2kimvz_15@[Link]
Resumen
Las técnicas moleculares actuales han sido desarrolladas, en solo pocos años
de investigación académica básica en muchos campos de la ciencia, la reacción en cadena
de la Polimerasa (PCR) es una técnica que se utiliza comúnmente en los laboratorios de
investigación médicos y biológicos para amplificar, es decir crear copias múltiples del ADN,
sin utilizar un organismo vivo. Por esta razón el objetivo de la práctica radica comprender las
fases de desnaturalización, hibridación y elongación o extensión que comprende la PCR, así
como cada uno de los componentes necesarios para la realización de una amplificación de
ADN. De esta forma se realizaron las mezclas de PCR que se colocaron junto con el ADN
extraído anteriormente en el gel de agarrosa, logrando conocer en detalle el procedimiento
adecuado para esta técnica.
Palabras Claves: Reacción en cadena de la Polimerasa, PCR, ADN, primers,
desnaturalización, hibridación, elongación.
Introducción secuencias de ADN específicas dentro de
La reacción en cadena de la polimerasa una muestra. Habitualmente la reacción se
PCR, es una forma de clonación del ADN, diseña para permitir la amplificación
puramente enzimática que se realiza selectiva de una o varias secuencias diana
totalmente in vitro. Representa uno de los de ADN presente en una mezcla compleja
avances más importantes y actuales de la de secuencias (UNED, 2000)
historia de la biotecnología. Es un método Al finalizar se cuenta con dos copias del
rápido de amplificación in vitro de segmento, la que sirvió como base de la
síntesis y la recién sintetizada y a su vez, Cuando se aplica una diferencia de
nuevos sitios para que se coloque el potencial, las moléculas que poseen
iniciador son generados con cada cadena distintas cargas globales comenzarán a
de ADN nueva, esto puede repetirse y en separarse debido a sus diferentes
pocas horas contar con miles de copias de movilidades electroforéticas. La movilidad
ADN. Esta técnica es muy sensible, electroforética es un parámetro significativo
permite amplificar secuencias específicas a y característico de las moléculas o
partir de muy poco material inicial, lo que partículas cargadas (Padilla et al., 2012)
brinda las características idóneas para
Los ácidos nucleídos separados en geles
que la PCR tenga múltiples aplicaciones en
de agarosa pueden visualizarse mediante
diversos campos (Leal, 2007)
tinción con colorantes fluorescentes, lo
Para detectar los productos del PCR se cual permite evaluar su integridad y
utiliza la electroforesis, la cual se emplea estimar su concentración mediante un
para separar macromoléculas en función análisis comparativo con patrones de
del tamaño, la carga eléctrica y otras concentración conocida. Los colorantes
propiedades físicas. El término fluorescentes actúan mediante inserción
electroforesis describe la migración de las entre las pares de bases que conforman el
partículas cargadas bajo la influencia de un ácido nucleíco. El cálculo de las
campo eléctrico (Somma y Querci, 2003). concentraciones se hace bajo la luz
ultravioleta según la fluorescencia (García,
La electroforesis en gel es una técnica que
2001)
consistente en aplicar corriente eléctrica a
las moléculas para que atraviesen una Los objetivos de la práctica son
placa de gel. La fuerza motriz de la comprender las fases de desnaturalización,
electroforesis es la tensión eléctrica hibridación y elongación o extensión que
aplicada a los electrodos en ambos comprende la PCR, así como cada uno de
extremos del gel. Las propiedades de una los componentes necesarios para la
molécula determinan la velocidad con que realización de una amplificación de ADN.
un campo eléctrico puede desplazarla a
través de un medio gelatinoso. La
separación de las macromoléculas
Materiales y Métodos
depende de dos variables carga y masa
(Posso y Ghneim 2008).
Del Laboratorio de Biotecnología de la
Universidad de Costa Rica, se procedió a Cuadro II
realizar la mezcla maestra de PCR, Condiciones de la PCR
Espaci Ciclo Desnatu Hibri Exten Numero Ciclo
utilizando para ello la concentración ador Inicia ralización dación sión Ciclos Final
Intérge l
nico
obtenida del mismo a 260nm mediante la 95°C 95ºC por 55ºC por 72ºC por 72ºC
trnH- 3 32 30 30 34 por 7
psbA minu segundos segundo segundos minut
técnica de espectrofotometría, como se tos s os
muestra en el siguiente cuadro
Cuadro I
Resultados
Volúmenes Requeridos Mezcla Maestra
Elemento Volumen Volumen Equipo Para obtener dichos volúmenes se
1X 2X Utilizado
realizaron los siguientes cálculos:
Dream 12.5 µL 25 µL Micropipeta
Taq PCR 20-200 µL
Master Concentración de ADN
Mix
Primer F 1 µL 2 µL Micropipeta ng
0.5-10 µL ∗1 µg
|¿| FD∗50 ͢ 0.6896∗50∗50=1724
µL
Primer R 1 µL 2 µL Micropipeta =1.7 µg /µL
0.5-10 µL
1000 ng
ADN 2 µL - Micropipeta
0.5-10 µL µg µg
C 1∗V 1=C 2∗V 2 ͢ 1.7 ∗V =0.04 ∗25 µL=0.6 µL
Agua 8.5 µL 17 µL Micropipeta µL µL
destilada 5-50 µL
Volumen 25 µL 50 µL
Final
µg
C 1∗V 1=C 2∗V 2 ͢ Cn∗2 µL=0.04 ∗25 µL=0.5 µg /µL
µL
Finalmente se colocó la mezcla con el ADN
y el control negativo en el termociclador de
gradientes, utilizando las temperaturas y Dilución ADN
tiempos descritos en el siguiente cuadro. µg µg
C 1∗V 1=C 2∗V 2 ͢ 1.7 ∗V =0.5 ∗10 µL=2.
µL µL
Discusión y Conclusiones
Para poder realizar la practica fue
necesario realizar la dilución del ADN ya
que el que se obtuvo estaba en
concentraciones de 1.7 µg/ µL y para una parte, se unirán a esa zona y darán
realizar la práctica se necesitaba tener en otros productos de la PCR, los productos
concentraciones menores entre 0.1 µg /µL secundarios.
y 1 µg /µL, por lo que se diluyo hasta
La temperatura se subió hasta 72 ºC para
0.5 µg/ µL
que la polimerasa empezará a crear la
La temperatura se subió 95º para romper cadena a partir de los extremos que le
la unión entre las cadenas y así separar las marcan los cebadores o primers.
hebras del ADN , ya que cuanto más calor,
En la práctica lo que se siguió fue el
más vibra la molécula de ADN y más se
procedimiento indicado subimos, bajamos
rompen las uniones entre las dos hebras.
y subimos la temperatura, sin embargo a
Además por que la enzima utilizada fue la
pesar de que se siguió los pasos no se
Taq polimerasa, que proviene de la
pudo obtener buenos resultados ya que no
bacteria Thermus Aquaticus que es estable
se pudo multiplicar el ADN como se
hasta 95º (UNED, 2000)
esperaba.
La temperatura se bajó a 60 ºC para que La PCR es una fotocopiadora. Pero
los cebadores o primers se unan al fotocopia sólo una página del libro, la que
ADN Delimitaremos la zona de inicio y de nosotros le indiquemos. Así, si en una
final con secuencias que las marquen, cadena de ADN le delimitamos el inicio y el
llamadas primers o cebadores (inician la final de lo que debe multiplicar, la copiará
reacción). Los cebadores son trocitos muy del tirón, en una reacción, es por esto que
pequeños de ADN de una sola hebra, tan no siempre se logra realizar una PCR
pequeños que podemos sintetizarlos en un correctamente. (Rodriguez, 2010)
laboratorio de química, sin ayuda de El ADN puede estar contaminado con
enzimas. Para amplificar zona del ADN proteínas o alguna sustancia que inhibe la
solamente se sintetizaron dos cebadores reacción de PCR, por lo que para evitar
con la secuencia adecuada. Sin embargo esta situación se recomienda extraer el
los primers pueden ocasionar problemas ADN con un kit comercial que esté
en la PCR ya que si la secuencia de estos diseñado específicamente para el tipo de
primers está repetida en el genoma organismo con el que trabajemos. (Castro,
multiplicaríamos también otras zonas. A 2004)
veces no es necesario que toda la Un posible error fue que no se tuvo
secuencia esté repetida, con que lo esté siempre la muestra y los reactivos
empleados a -20 ºC lo que pudo ocasionar Las concentraciones y el manejo de los
un posible contaminante de la muestra. dNTPs puede que no se manejaron de la
Una causa muy común de errores la mejor manera y si se incrementó la
encontramos aquí, el congelar y cantidad requerida ya que pequeños
descongelar cambia las concentraciones incrementos en la concentración de dNTPs
de los reactivos y/o forma gradientes pueden inhibir la reacción
dentro de los tubos, y al homogeneizarlos porque atraparán el magnesio necesario
aseguramos obtener resultados para que la polimerasa trabaje, además no
reproducibles. Una causa de error se pudo se conocía que los dNTPs son muy
encontrar en la temperatura de inestables, si se descongelan más de 3 a 5
alineamiento que podría ser que no se veces pueden no funcionar tan bien.
eligió la mejor para nuestros oligonucleicos (Asuar, 2010)
Además cada tipo de célula o tejido tiene Se concluye que la principal razón por la
una guía que a veces no podemos quitar y que no se pudo realizar una correcta
que también inhiben la reacción de PCR. reacción en cadena de la polimerasa fue
(Jhopsson, 2009) por el estado del ADN utilizado, además
por la falta de experiencia sin embargo, se
La cantidad agregada de magnesio puede
coincide con García al decir que la PCR es
causar problemas en el PCR ya que
una realidad, y se usa cada día en
aunque la polimerasa necesita de iones de
cualquier laboratorio de Biología
magnesio para funcionar adecuadamente Molecular., pero sí es cierto que el día en
pero si se le agrega mucho magnesio que te cruzas con una PCR que dé
inhibe a la polimerasa, y poco puede problemas… te traerá dolor de cabeza , ya
generar productos inespecíficos. (Solis, que son muchos los factores los que la
pueden afectar. (Garcia, 2008)
2007)
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