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Técnicas para la
realización de test
pretransfusionales
tema María Casanova Espinosa
1. NORMAS GENERALES. CONCENTRACIÓN DE HEMATÍES Y SUERO
Los antígenos (Ag) de los hematíes más los anticuerpos (Ac) del suero forman complejos
antígeno-anticuerpo que provocan la aglutinación.
Si aumentamos la cantidad de hematíes, la concentración de antígenos es mayor, por lo
que aumentan los complejos antígeno-anticuerpo, pero disminuye el número de anticuerpos
por hematíes, disminuyendo al mismo tiempo la sensibilidad del test.
Si aumentamos la cantidad de suero, aumenta el número de moléculas de anticuerpos,
con lo que aumenta no sólo el número de complejos antígeno-anticuerpo, sino el número de
anticuerpos por hematíes, con lo que se incrementa la sensibilidad del test.
1.1. En medio de baja fuerza iónica Liss.
Cuando los hematíes están en suspensión en una solución salina de potencial iónico
bajo (LISS), la nube de cationes que rodea los hematíes es menos densa que si éstos están en
suspensión en suero salina isotónica normal. La concentración reducida de cationes alrededor
de los hematíes permite a las moléculas de anticuerpo cargadas positivamente tener más
fácil acceso a los lugares antigénicos de la membrana eritrocitaria, aumentando así la tasa de
sensibilización.
Este medio es el único en el que se recomienda utilizar la misma cantidad de sangre y
suero: una gota de cada uno, debido a las características especiales del mismo.
1.2. Con albúmina.
La albúmina dispersa algunas cargas positivas situadas alrededor de los hematíes; por
tanto, habrá menos cationes rodeando los hematíes y permitirá un mayor acercamiento entre
ellos y se facilitará la aglutinación.
Tema 3. Técnicas para la realización de test pretransfusionales 57
Antisueros comerciales.
Utilizar siempre dos gotas.
1.3. Lavado de hematíes.
Con el lavado de hematíes se pretende eliminar:
- Restos de proteínas, como el fibrinógeno, que pueden interferir con la reactividad
específica de los hematíes.
- Los hematíes más frágiles que pueden hemolizarse.
- Sustancias solubles que pueden inhibir anticuerpos: A, B, Chido o Lewis.
- Anticoagulante que actúa como anticomplemento.
- Soluciones conservadoras presentes en los hematíes test comerciales, que pueden
reaccionar con un anticuerpo presente en el suero del paciente.
Desde el punto de vista práctico, es indispensable lavar los hematíes tres veces antes
de utilizar antiglobulina.
1.4. Preparación de suspensión de hematíes.
- Tras, al menos, un lavado con solución salina, los hematíes deben resuspenderse
en una concentración del 5 %, o menor (2-5 %), en salina.
- Si van a ser utilizados durante varios días, deben conservarse refrigerados
mientras no se estén usando.
- Tras 12 horas en nevera, la suspensión de hematíes se conserva mejor si se elimina
el sobrenadante salino y se reconstituye de nuevo.
1.4.1. Técnica de adición de salina, resuspensión y decantación.
- Dirigir el chorro directamente al botón para resuspenderlo.
- No tocar el borde de los tubos con el dispensador.
- Llenar el tubo hasta 1-1,5 cm del borde.
- La centrifugación debe ser la suficiente para sedimentar los hematíes
completamente, pero sin que estos formen una masa pseudoaglutinada.
- Decantar la salina lo más completamente posible volcando el tubo con un
movimiento rápido de la mano.
- La última gota que se adhiere al extremo del tubo debe ser sacudida para que
se desprenda.
1.4.2. Técnica de adición de reactivos a los tubos.
Las pipetas no deben contactar los lados del tubo ni ser introducidas dentro de éstos.
Los reactivos deben caer libremente al fondo del tubo.
58 Tema 3. Técnicas para la realización de test pretransfusionales
2. Determinación del grupo sanguíneo AB0 y RH
2.1. Método en tubo (determinación grupo AB0 sérico y hemático).
2.1.1. Aplicación.
Este método se utilizará para todos los receptores de sangre y para la determinación
del grupo en embarazadas. Permite una determinación precisa del grupo AB0.
2.1.2. Técnica.
- Poner 7 tubos en una gradilla.
- Rotular los tubos anti-A, anti-B, anti-AB, anti-D, control Rh, A1 y B.
- Añadir dos gotas de anti-A, anti-B, anti-AB, anti-D y Rh control a los tubos
rotulados com cada nombre respectivamente.
- Añadir dos gotas del suero problema a los tubos rotulados con A1 y B.
- Añadir una gota de hematíes lavados 1 vez y diluidos al 5 % de la persona a
estudiar a los tubos rotulados con anti-A1, anti-B, anti-AB, anti-D y control Rh.
- Añadir una gota de hematíes A1(Rh-) al tubo rotulado A1 y una gota de hematíes
B(Rh-) al tubo rotulado B (suspensión de hematíes lavados y diluidos al 5 %,
preparada previamente que se guarda a 4 ºC).
- Mezclar bien cada tubo y centrifugar durante 30-45”.
- Leer la aglutinación macroscópica.
- Anotar los resultados (tablas 1 y 2).
Anti-A Anti-B Anti-AB Hematíes A1 Hematíes B Grupo
0 0 0 + + 0
+ 0 + 0 + A
0 + + + 0 AB
+ + + 0 0 AB
Tabla 1. Interpretación de la determinación del Grupo AB0.
Anti-D Control Rh Grupo
+ - Rh +.
+ + No valorable.
- - Rh -.
- + Resultado no valorable. Tabla 2. Interpretación del Rh.
Tema 3. Técnicas para la realización de test pretransfusionales 59
3. Escrutinio de anticuerpos irregulares y prueba
cruzada con LISS
3.1. Aplicación.
Se realizará esta técnica en aquellos casos en los que el hematólogo responsable lo
indique para estudio de resultados irregulares en la técnica realizada con tarjeta.
3.2. Muestras.
- No utilizar sangre hemolizada, contaminada o con presencia de coágulo. Utilizar
preferentemente suero y hematíes procedentes de sangre total en anticoagulante
y extraídos recientemente.
- Puede utilizarse plasma cuando sea difícil la obtención de suero por activación
de la coagulación (pacientes en UCI, hemodiálisis, etc.).
- Pueden utilizarse suero y hematíes conservados entre 2.8 ºC hasta 48 horas
después de su extracción.
3.3. Técnica.
- Rotular un tubo como S-1 y otro como S-2 y otros tantos como bolsas vayan a
cruzarse con el número de la bolsa.
- Lavar los hematíes de las bolsas 3 veces con salina normal y resuspender al 5 %.
- Añadir dos gotas de suero problema a cada tubo.
- Añadir una gota de la suspensión de hematíes serocyte I y II y de los hematíes
de las bolsas a cruzar, en sus tubos respectivos.
- Añadir cuatro gotas de LISS (dependiendo de las instrucciones del fabricante),
a todos los tubos. Mezclar bien.
- Centrifugar inmediatamente 30-45”. Examinar el sobrenadante para ver si hay
hemólisis; resuspender los hematíes para ver si existe aglutinación. Anotar
resultados.
- Incubar los tubos 15 minutos a 37 ºC.
- Centrifugar y examinar el sobrenadante para ver si hay hemólisis, resuspender
los hematíes para ver si existe aglutinación. Anotar resultados.
- Lavar los tubos tres veces con salina.
- Después del último lavado, decantar bien toda la salina. Secar el borde del tubo.
- Añadir al botón de células dos gotas de antiglobulina. Mezclar bien.
- Centrifugar 20-30”, resuspender los hematíes suavemente y observar si hay
aglutinación. Anotar los resultados.
60 Tema 3. Técnicas para la realización de test pretransfusionales
- Observar al microscopio (objetivo de 40) los hematíes de los tubos que no
presentan aglutinación macroscópica.
- Añadir 1 gota de células sensibilizadas con IgG (Coombs control) a todos los test
negativos. Centrifugar 20-30” y leer. Si las células sensibilizadas con IgG no son
aglutinadas, el test no es válido y hay que repetir las pruebas.
4. Identificación de anticuerpos
4.1. Aplicación.
Identificación de especificidad de aloanticuerpos cuando el escrutinio de anticuerpos
irregulares es positivo.
4.1.1. Técnica.
El método consiste en enfrentar el suero, que nos ha dado resultados positivos en el
escrutinio de anticuerpos irregulares, con un panel comercial de células que dispongan de una
colección equilibrada de fenotipos positivos y negativos para determinar la especificidad de
los anticuerpos, sobre todo de aquellos que son clínicamente significativos. Todas las células
que contengan el antígeno darán una aglutinación positiva, y las que no lo tengan, no. De
esta forma se obtienen unos patrones específicos de reacción que suelen ser característicos
de cada anticuerpo, sobre todo si se tienen en cuenta las condiciones en las que se produce
la aglutinación.
4.1.2. Método.
Medio salino:
- Rotular 12 tubos limpios del 1 al 12.
- Añadir a cada tubo dos gotas del suero a estudiar.
- Añadir a cada tubo una gota de los distintos viales de células del panel del 1
al 11 respectivamente. Al tubo 12 añadir una gota de los hematíes del propio
individuo lavados y suspendidos al 5 % (autocontrol).
- Mezclar suavemente todos los tubos.
- Centrifugar 25 segundos.
Medio hiperproteico:
- Añadir a cada tubo dos gotas de Albúmina bovina al 22 % o LISS y mezclar.
- Centrifugar 45”.
Tema 3. Técnicas para la realización de test pretransfusionales 61
- Leer y anotar los resultados.
- Incubar a 37 ºC durante 30 minutos si hemos utilizado albúmina o 15 minutos
si es LISS.
- Centrifugar 45 segundos.
- Leer y anotar los resultados.
Fase antiglobulina:
- Lavar los tubos tres veces.
- Añadir dos gotas de antiglobulina poliespecífica a cada tubo. Mezclar bien
- Centrifugar 20 segundos.
- Leer y anotar resultados.
4.2. Interpretación del estudio de anticuerpos.
Entre las posibilidades a tener en cuenta en la interpretación, destacan:
- Presencia de alo-anticuerpos: anticuerpos formados por una persona al ponerse
en contacto con un antígeno del que ella carece.
- Presencia de auto-anticuerpo: anticuerpos formados por una persona que
reacciona también frente a los hematíes propios (autocontrol positivo).
- Rouleaux: apilamiento de unos hematíes sobre otros. Se produce por factores
plasmáticos: hiperproteinemia, presencia de proteínas anormales, presencia de
expansores plasmáticos. Desaparece al diluir el suero con salino.
- Presencia de crioaglutininas: anticuerpos que reaccionan en frío. Son muy
frecuentes y no tienen implicación clínica. Su importancia radica, únicamente,
en que pueden enmascarar un aloanticuerpo que si tenga significación clínica.
- Problemas con los reactivos: algunas personas pueden tener anticuerpos frente
a algunos de los componentes de los reactivos utilizados, por ejemplo, frente al
caprilato que lleva la albúmina. Se resuelve no utilizándola o utilizando otros
potenciadotes como el LISS.
4.3. Tipo de anticuerpos que podemos encontrar.
- Aloanticuerpos simples. Se trata de un anticuerpo único. Si es lo suficientemente
potente, no suele ser difícil su identificación, basada en el patrón de reacción
frente a las células del panel y en las condiciones en que ésta se produce. Pueden
existir problemas si:
· El anticuerpo reacciona en fase no esperada.
· Reacciona solo con las células homocigotos para ese antígeno.
62 Tema 3. Técnicas para la realización de test pretransfusionales
· No se obtiene una especificidad discernible.
· Se trata de un anticuerpo del grupo AB0 (anti-H, anti-IH)
- Aloanticuerpos múltiples. En general, es difícil su identificación y, para ello,
se requiere la realización de pruebas más complejas. Se sospecha cuando:
· El patrón de aglutinación no corresponde a un anticuerpo único.
· Hay variaciones en el patrón de aglutinación que no se justifican por el efecto
dosis.
- Anticuerpo frente antígeno de alta incidencia. Se sospecha cuando la
reacción es uniforme y clara con todas las células del panel y no con las propias.
En general, hay que remitir la muestra a un centro de referencia para confirmar
el diagnóstico e identificar la especificidad del anticuerpo.
- Anticuerpos frente a antígenos compartidos con otras células. Se trata
de anticuerpos frente al sistema HLA, que se encuentra también presente en
plaquetas y los leucocitos. No tienen mucha importancia desde el punto de vista
transfusional. Estos anticuerpos suelen tener un título alto, pero baja avidez y
reaccionan en fase antiglobulina. Se inhiben parcialmente al añadir un pool de
plasma.
- Autoanticuerpos. Son aquellos anticuerpos que reaccionan con los hematíes
antólogos, además de con todas las células del panel. Aparecen en personas con
enfermedades autoinmunes y pueden dar lugar a anemias hemolíticas.
4.4. Técnica de precalentamiento.
4.4.1. Aplicación.
Esta técnica se realiza cuando se sospecha la existencia de autoanticuerpos fríos o
crioaglutininas: el escrutinio de anticuerpos irregulares (SI y SII) es positivo y las bolsas no
cruzan desde la lectura a temperatura ambiente.
Antes de realizar el estudio con precalentamiento, debe montarse un autocontrol
(hematíes del receptor enfrentados con su propio suero). Cuando existen crioaglutininas el
autocontrol suele ser positivo a temperatura ambiente (10-15’ a 22 ºC) sin potenciador, es
decir, sin LISS.
4.4.2. Descripción de la técnica.
- Introducir en el baño a 37 ºC el suero del receptor y una gota de hematíes de
los SI y SII, una gota de los hematíes lavados de las bolsas que se van a cruzar y
una gota de los hematíes lavados del propio receptor (autocontrol), e incubarlos
cada uno en su tubo correctamente identificado durante 15 minutos.
Tema 3. Técnicas para la realización de test pretransfusionales 63
- Una vez transcurrido este tiempo, añadir cuatro gotas del suero del receptor a
cada tubo de hematíes, mezclar bien e incubar 30 minutos.
- Sacar del baño, centrifugar 30 segundos y leer.
- Lavar tres veces, añadir dos gotas de anti-IgG monoespecífica, centrifugar
durante 20 segundos y leer.
- Observar al microscopio.
4.4.3. Interpretación.
- Habitualmente los anticuerpos fríos desaparecen con esta técnica, negativizándose
todos los tubos y pudiéndose transfundir sin problema alguno.
- Si la prueba cruzada, el escrutinio de anticuerpos irregulares y el autocontrol
siguen siendo positivos tras el precalentamiento pensar en la presencia de
autoanticuerpos calientes IgG: realizar coombs directos y descartar anemia
hemolítica autoinmune del receptor.
- Si el autocontrol es negativo y el escrutinio de anticuerpos irregulares es positivo,
y no cruza alguna bolsa, pensar en la presencia de aloanticuerpo y realizar panel
con precalentamiento.
- Siempre se debe anotar en la ficha del receptor que éste presenta una
crioaglutinina y que se debe cruzar con precalentamiento, para ahorrar tiempo
y reactivos en futuras transfusiones.
4.5. Identificación de anticuerpos en tubo.
4.5.1. Aplicación.
Identificación de especificidad de aloanticuerpos cuando el escrutinio de anticuerpos
irregulares es positivo.
4.5.2. Técnica.
El método consiste en enfrentar el suero, que nos ha dado resultados positivos en el
escrutinio de anticuerpos irregulares, con un panel comercial de células que dispongan de una
colección equilibrada de fenotipos positivos y negativos, para determinar la especificidad de
los anticuerpos, sobre todo, de aquellos que son clínicamente significativos. Todas las células
que contengan el antígeno darán una aglutinación positiva, mientras que las que no lo tenga
ésta serán negativas.
De esta forma se obtienen unos patrones específicos de reacción que suelen ser
característicos de cada anticuerpo, sobre todo, si se tienen en cuenta las condiciones en las
que se produce la aglutinación.
64 Tema 3. Técnicas para la realización de test pretransfusionales
4.5.3. Método.
- Medio salino.
· Rotular los 12 tubos limpios del 1 al 12.
· Añadir a cada tubo dos gotas del suero a estudiar.
· Añadir a cada tubo una gota de los distintos viales de células del panel del 1
al 11 respectivamente. Al tubo número 12 añadir una gota de los hematíes
del propio individuo lavados y suspendidos al 5 % (autocontrol).
· Mezclar suavemente todos los tubos.
· Centrifugar 25 segundos.
· Leer y anotar los resultados en el caso de que sean positivos la fuerza de
aglutinación.
- Medio hiperproteico.
· Añadir a cada tubo dos gotas de albúmina bovina al 22 % o LISS y mezclar.
· Centrifugar 45 segundos.
· Leer y anotar los resultados.
· Incubar a 37 ºC durante 30 minutos si hemos utilizado albúmina o 15 minutos
si es LISS.
· Centrifugar 45 segundos.
· Leer y anotar los resultados.
- Fase antiglobulina.
· Lavar los tubos tres veces.
· Añadir dos gotas de antiglobulina poliespecífica a cada tubo. Mezclar bien.
· Centrifugar 20 segundos.
· Leer y anotar resultados.
4.6. Identificación de anticuerpos en tarjeta.
4.6.1. Aplicación.
Identificación de especificidad de aloanticuerpos cuando el escrutinio de anticuerpos
irregulares es positivo.
4.6.2. Muestras.
- No utilizar sangre hemolizada, contaminada o con presencia de coágulos.
- Utilizar preferentemente suero y hematíes procedentes de sangre total en
anticoagulantes extraídos recientemente.
Tema 3. Técnicas para la realización de test pretransfusionales 65
- Puede utilizarse plasma cuando sea difícil la obtención de suero por activación
de la coagulación (pacientes en UCI, hemodiálisis).
- Puede utilizarse suero y hematíes conservados entre 2-8ºC hasta 48 horas después
de su extracción.
- Dejar atemperar muestras y reactivos.
4.6.3. Método.
- Rotular del 1 al 11, once pocillos de una tarjeta Dianagel Coombs para los
hematíes reactivo del Identisera Diana y posteriormente otro pocillo para la
sangre diluida del receptor (1ml diluyente y 10 ml de sangre del receptor).
- Levantar el adhesivo que cubre la tarjeta solo de los pocillos que van a ser
utilizados y no volver a cubrir, con dicho adhesivo.
- Dispensar en los pocillos correspondientes, con pipeta repetidora, 50 ml de los
hematíes reactivo Identisera del 1 al 11 y 50 ml de los hematíes previamente
diluidos del receptor en el pocillo nº 12.
- Añadir a cada pocillo 25 ml de suero del paciente.
- Incubar la tarjeta Dianagel Coombs 15 minutos en el incubador a 37 ºC.
- Posteriormente centrifugar la tarjeta y leer.
4.6.4. Interpretación.
La lectura de la tarjeta se realiza de forma idéntica a la del escrutinio de anticuerpos
irregulares y prueba cruzada.
Junto con los hematíes reactivos del Identisera Diana, existe un papel para anotar una
a una las reacciones visualizadas en cada tubo. En ese papel debe siempre anotarse el nombre
del paciente y la fecha del estudio, ya que se guardará como documento en un archivo.
Para cada antígeno existe una combinación de positividades que debe coincidir con la
obtenida en la lectura de la tarjeta. Una vez identificado el antígeno que está presente en los
pocillos que nos han dado positivo, podemos establecer que el anticuerpo del receptor reacciona
frente a dicho antígeno. La interpretación de unos resultados debe ser siempre contrastada
con el hematólogo responsable.
66 Tema 3. Técnicas para la realización de test pretransfusionales
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68 Tema 3. Técnicas para la realización de test pretransfusionales