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ABIERTO
Desarrollo de modelos humanizados de
ratón y rata con piel humana de espesor
completo y células inmunes
autólogas
Yash Agarwal 1,4, Cole Beatty 1,4, Sara Ho 1,4, Lance Thurlow 2, Antu Das1, Samantha Kelly1 ,
Isabella Castronova1Rajeev Salunke1, Shivkumar Biradar1, TsetenYeshi3,
Anthony Richardson2 y Moses Bility 1*

La piel humana constituye una barrera de protección importante contra la transmisión de patógenos. Los modelos de roedores
utilizados para investigar patógenos específicos de humanos que atacan la piel se generan mediante la introducción de
injertos de piel humana en cepas de roedores inmunodeprimidas. La inmunopatogenia inducida por infecciones se ha estudiado
por separado en modelos humanizados de roedores desarrollados con tejido linfoide humano y trasplantes de células madre
hematopoyéticas. Aún no se ha logrado un co­injerto exitoso de piel humana, tejido linfoide autólogo y células inmunitarias
autólogas en un modelo de roedor, aunque podría proporcionar un medio para estudiar la respuesta inmunitaria humana a la
infección en la piel humana. En este trabajo, presentamos los modelos de ratón NOD­scid IL2Rγnull (NSG) humanizado con
piel y sistema inmunitario humano (hSIS) y de rata Sprague­Dawley­Rag2tm2hera Il2rγtm1hera (SRG), coinjertados con piel
fetal humana de espesor completo, tejido linfoide fetal autólogo y células madre hematopoyéticas autólogas derivadas de hígado
fetal. Los roedores humanizados con hSIS demuestran el desarrollo de piel humana de espesor completo, junto con tejido linfoide
autólogo y células inmunitarias autólogas. Estos modelos también respaldan la infección cutánea humana tras la inoculación
intradérmica con Staphylococcus aureus resistente a la meticilina asociado a la comunidad. El coinjerto de estos componentes
de piel y sistema inmunitario humanos en un único modelo de roedor humanizado podría proporcionar una plataforma para
el estudio de las infecciones cutáneas humanas.

La piel humana proporciona la primera línea de protección del huésped contra daños ambientales y defensa del huésped contra
patógenos1, 2 Varios patógenos emergentes, incluido el Staphylococcus aureus resistente a la meticilina asociado a la comunidad
(SAMR­CA), atacan la piel y provocan infecciones y enfermedades1, 3–5 Además, enfermedades infecciosas transmitidas
por vectores, como la enfermedad de Lyme y el dengue, se transmiten mediante inoculación cutánea por garrapatas y mosquitos,
respectivamente . Las interacciones entre queratinocitos, fibroblastos cutáneos y células inmunitarias cutáneas participan en el inicio
de la respuesta inmunitaria sistémica e impiden la replicación y diseminación de patógenos a otros sitios de replicación. Por lo tanto,
la piel constituye una diana de vacunación ideal para inducir inmunidad contra diversos patógenos, como lo refleja el desarrollo de
varias tecnologías novedosas de vacunas dirigidas a la piel, incluidas las vacunas intradérmicas con parche cutáneo .

Los modelos in vivo para estudiar las agresiones ambientales y los patógenos que atacan la piel y las células inmunes cutáneas
asociadas involucran principalmente ratones y ratas3 . Estos modelos de roedores han mejorado la comprensión mecanicista de
las enfermedades humanas; sin embargo, existen diferencias significativas entre la piel y el sistema inmunológico de los humanos y
los roedores3, 13. La microanatomía de la piel de los roedores difiere de la microanatomía de la piel humana debido a que la piel de
los roedores carece de una epidermis multicapa, glándulas ecrinas y apocrinas, y las regiones papilares, reticulares e hipodérmicas
de la capa dérmica14. La microanatomía de los tejidos linfoides primarios y secundarios humanos también difiere significativamente
de la de los tejidos linfoides de los roedores, con diferencias significativas en la proporción de pulpa roja a pulpa blanca en el bazo y
la lobulación del timo15­17. Está bien establecido que el microambiente del tejido linfoide, incluidas las células del estroma,
desempeña un papel significativo en el desarrollo de las células inmunes18. Las interacciones entre las células inmunitarias y las
células del estroma en tejidos no linfoides, como la piel, desempeñan un papel importante en la modulación de las respuestas
inmunitarias asociadas a los tejidos14. Pueden surgir lagunas translacionales entre los estudios clínicos realizados con modelos tradicionales de ro

1 2
Departamento de Enfermedades Infecciosas y Microbiología, Universidad de Pittsburgh, Pittsburgh, EE. UU. Departamento de
3
Microbiología y Genética Molecular, Universidad de Pittsburgh, Pittsburgh, [Link]. Hera Biolabs, Inc., Lexington,
EE. UU. 4Los siguientes autores contribuyeron por igual: Yash Agarwal, Cole Beatty y Sara Ho. *Correo electrónico: mtbility@[Link]

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lo que resalta la necesidad de modelos de roedores humanizados que puedan apoyar el injerto de componentes tanto de la piel humana
como del sistema inmunológico1 .
Para abordar la brecha de especies entre roedores y humanos, los investigadores han injertado el modelo de ratón inmunodeficiente
NOD­scid IL2Rγnull (NSG), que carece de linfocitos maduros y células asesinas naturales (NK) y posee defectos en la inmunidad
innata, con varias células y tejidos humanos19, 20. Denominados ratones NSG humanizados, estos modelos exhiben tanto la
reconstitución de células inmunitarias humanas como el crecimiento de tejido linfoide humano y se han utilizado para recapitular las
características clínicas de enfermedades humanas (incluidas las enfermedades asociadas a la piel)21–25. Varios informes separados
demuestran que los ratones inmunodeficientes apoyan el injerto de piel humana26, 27. La piel humana adulta derivada de desechos
médicos (cirugía plástica electiva)28, 29 o piel modificada genéticamente derivada de cultivo de tejidos (queratinocitos y fibroblastos)24
se injerta con éxito en ratones inmunodeficientes. Se han introducido células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas
adultas alogénicas en estos modelos para imitar las interacciones entre la piel y las células inmunitarias humanas con agentes
infecciosos24, 29. Si bien estos modelos murinos demuestran un injerto y desarrollo exitosos de piel humana trasplantada y son
susceptibles al trasplante de PBMC alogénicas, dichas plataformas no están actualmente acopladas al injerto de tejidos linfoides
autólogos, que son cruciales para una respuesta inmunitaria de novo. Aún no se han establecido modelos murinos humanizados que
combinen piel humana, células inmunitarias humanas y estructuras linfoides humanas, a pesar de su potencial para desarrollar un
sistema funcional in vivo, lo que podría permitir estudios sobre las interacciones entre la piel humana y las células inmunitarias30. Los
modelos murinos humanizados con sistema hematopoyético fetal humano y tejidos linfoides autólogos están bien establecidos19, 20.

Además, la piel fetal humana de espesor completo se injerta fácilmente en ratones inmunodeficientes y se desarrolla hasta convertirse
en piel similar a la de los adultos debido a su alta capacidad regenerativa31, 32. Además, la piel fetal humana exhibe niveles bajos de
expresión del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) I y II, lo que resulta en una inmunogenicidad reducida en comparación con
la piel adulta31, 32. Por lo tanto, los tejidos y células derivados de fetos humanos proporcionan un medio factible para desarrollar un
modelo de ratón humanizado con piel humana autóloga y sistema inmunológico.
Las ratas son una especie modelo importante para estudios a largo plazo (más de un año)33; por lo tanto, los modelos humanizados
de rata que combinan piel humana, células inmunes humanas y estructuras linfoides humanas se están explorando para su uso en
estudios in vivo a largo plazo de interacciones inmunológicas de la piel humana. Los informes han demostrado que las ratas desnudas
(con inmunodeficiencia moderada) apoyan el injerto y desarrollo de piel humana adulta (piel de espesor parcial), aunque el rechazo
inmunológico mediado por el huésped ocurre en unos pocos meses34­36. La evidencia también sugiere que las ratas desnudas apoyan
el injerto y desarrollo del prepucio neonatal de espesor completo37. Recientemente, una rata inmunodeficiente, denominada rata
Sprague–Dawley­Rag2tm2hera Il2rγtm1hera (SRG), se desarrolló para apoyar el injerto de células y tejidos humanos en un modelo de
roedor más grande y de mayor esperanza de vida; Este modelo carece de células T, B y NK maduras38, 39. Hasta la fecha, aún
quedan por desarrollar y establecer modelos de ratas humanizados co­injertados con piel humana de espesor completo y tejidos
linfoides autólogos y células inmunes (incluidas las células inmunes cutáneas)28, 40–42.
En este estudio, utilizamos los modelos de ratón NSG inmunodeficiente y rata SRG para generar modelos de roedores con piel
humana, junto con tejido(s) linfoide(s) autólogo(s) y células inmunitarias autólogas, denominados ratones NSG de Piel y Sistema
Inmunitario (hSIS) y ratas SRG. Los roedores adolescentes recibieron cotrasplantes de piel fetal humana de espesor completo, tejido
linfoide autólogo y células madre hematopoyéticas autólogas. Además, los xenógrafos de piel humana se inocularon con SARM­AC
para determinar la susceptibilidad de estos modelos de roedores humanizados con hSIS a patógenos cutáneos humanos.

Resultados
El modelo de ratón NSG humanizado hSIS promueve el desarrollo de piel humana de espesor completo, tejidos linfoides autólogos
(timo y bazo) y células inmunitarias humanas. Previamente, demostramos que los ratones NSG promueven el desarrollo de tejidos
linfoides humanos (timo y bazo) junto con células inmunitarias autólogas tras el injerto de tejidos fetales y células madre hematopoyéticas
autólogas17. Varios informes demostraron que los ratones inmunodeficientes promueven el desarrollo de piel humana tras el injerto de
piel fetal humana43, 44. En este estudio, planteamos la hipótesis de que los ratones NSG promoverán el co­injerto de piel fetal
humana de espesor completo, tejidos linfoides fetales autólogos y células madre hematopoyéticas autólogas.

Además, planteamos la hipótesis de que los ratones NSG facilitarán el desarrollo de la piel y el tejido linfoide humanos, así como la
reconstitución sistémica de células inmunitarias humanas en tejidos humanos trasplantados y en la sangre. Procesamos bazo, timo y
hígado fetal humano en fragmentos de aproximadamente 1 mm³ y aislamos CD34+ humanos autólogos.
Se obtuvieron células madre hematopoyéticas del hígado fetal, y posteriormente se trasplantaron los tejidos y las células madre
hematopoyéticas a ratones NSG irradiados. Se obtuvieron tejidos de piel humana del cuero cabelludo y el dorso de donantes, que se
utilizaron para desarrollar injertos de piel humana con y sin pelo en el modelo murino, respectivamente. Se procesó piel fetal humana
de espesor completo mediante la eliminación del exceso de tejido graso adherido a la capa subcutánea, y posteriormente se injertó
sobre la caja torácica, donde previamente se extirpó la piel del ratón. En tres cohortes, el éxito general del desarrollo y mantenimiento
del sistema inmunitario humano y de la piel autóloga de espesor completo durante diez semanas o más fue superior al 75 % (Fig. 1 del
Suplemento). El análisis macroscópico del xenoinjerto de piel humana en el modelo murino hSIS­NSG, a partir de las dos semanas
posteriores al trasplante, demuestra la cicatrización de la herida y la maduración hasta alcanzar la piel humana adulta, lo cual es
evidente a las diez semanas posteriores al trasplante (Fig. 1A, Fig. 2 del Suplemento). Una limitación de la piel humana en el modelo
murino hSIS­NSG es el desarrollo de piel seca (que resulta en endurecimiento) y signos tempranos de pérdida de cabello murino
(sugestivo de enfermedad de injerto contra huésped) a las 20 semanas después del trasplante (Fig. 2 suplementaria). La piel humana
en ratones hSIS­NSG también desarrolla apéndices de piel humana, con cabello humano evidente a las 12 semanas después del
trasplante (Fig. 1B). El análisis macroscópico de xenógrafos humanos de bazo y timo en ratones NSG humanizados con hSIS a las
diez semanas después del trasplante demostró el crecimiento de esos tejidos linfoides debajo de la cápsula renal (Fig. 1C)17. Además
de apoyar el crecimiento de los tejidos de bazo y timo humanos, el modelo murino NSG humanizado con hSIS apoya la reconstitución
de los ganglios linfáticos y el bazo murinos inmunodeficientes (Fig. 1C)17. Análisis histoquímico de la piel humana en ratones NSG
humanizados con hSIS

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Figura 1. Desarrollo de piel humana y tejidos linfoides en el modelo murino NSG humanizado con piel y sistema
inmunitario humano. El trasplante de piel humana de espesor completo (derivada del cuero cabelludo para piel con pelo, o
derivada del dorso para piel sin pelo) en el dorso (A, B) y tejidos linfoides autólogos en la cápsula renal (C) de ratones
NSG da como resultado el injerto y desarrollo de piel humana de espesor completo y tejidos linfoides. (A) Fotografías
macroscópicas representativas a las 0 (día del trasplante), 2, 4 y 10 semanas después del trasplante, con piel de ratón
intacta como control (n = 4 por grupo). (B) El trasplante de piel humana de espesor completo de regiones con folículos
pilosos significativos (cuero cabelludo) en el modelo murino NSG humanizado con piel y sistema inmunitario humano da
como resultado el desarrollo de cabello humano, como se muestra en fotografías macroscópicas representativas a las 12
semanas después del trasplante (n = 6). (C) Fotografías macroscópicas representativas de tejidos linfoides humanos
(tejidos del bazo y del timo) y de tejidos linfoides humanizados (ganglio linfático y bazo murinos inmunodeficientes
reconstituidos) diez semanas después del trasplante (n = 4).

Se demuestra el desarrollo del xenógrafo de piel humana. La microanatomía de la piel humana a las diez semanas del
trasplante es comparable a la de la piel humana adulta, con múltiples capas de células presentes en la epidermis (Fig. 2A, Fig.
3 suplementaria). El xenógrafo de piel humana mostró múltiples capas de queratinocitos humanos (AE1/AE3, células con
anticuerpos anti­citoqueratina+) en la epidermis y fibroblastos dérmicos (células con anticuerpos anti­fibroblastos+) en la
dermis (Fig. 2B). Además, la piel humana mostró repoblación de células inmunitarias humanas ( células CD45+ humanas),
incluyendo células de Langerhans (células hCD207+), macrófagos (hCD68+) y linfocitos T (hCD3+) (Fig. 2B, Figs. 4 y 5
suplementarias). La piel humana en ratones NSG humanizados con hSIS también mostró una regulación positiva de las células
alfa­actina de músculo liso (α­SMA+) (es decir, células de los vasos sanguíneos) durante la revascularización y la cicatrización
de la herida (aproximadamente 2 semanas después del trasplante), seguida de una reducción de las células α­SMA+ en la piel
cicatrizada (aproximadamente 10 semanas después del trasplante) (Fig. 2B). El análisis histoquímico demuestra el desarrollo
de los tejidos linfoides humanos cotrasplantados (bazo y timo) en la cápsula renal (aproximadamente 10 semanas después
del trasplante) (Fig. 2C)17. El tejido del timo humano en ratones NSG humanizados con hSIS exhibe una reconstitución de
células T ( células CD3+ humanas), con pocas células B en el tejido (Fig. 2C)17, 46, 47. La reconstitución de macrófagos
( células CD68+ humanas) en el tejido del timo humano está restringida a la médula (Fig. 2C)17, 46, 47. El tejido del bazo
humano en ratones NSG humanizados con hSIS exhibe una reconstitución de macrófagos, con macrófagos predominantemente en la pulpa
El tejido esplénico humano en ratones NSG humanizados con hSIS exhibe repoblación de células T y B (células CD3+ y
CD20+ humanas ), con linfocitos predominantemente en la pulpa blanca (Fig. 2C)15. El análisis de las PBMC en ratones
NSG humanizados con hSIS mostró una reconstitución de células inmunitarias humanas (células hCD45+) (Fig. 3A, B). Se
reconstituyeron varios subtipos de células inmunes humanas (hCD45+), a saber, células T αβ (células T hαβ con una relación
CD4:CD8 promedio de 1,34:1), células T γδ (γδ T), células NK (hNK), células B (hB), monocitos (hMo) y granulocitos/neutrófilos
polimorfonucleares (hPMN) en la sangre periférica del modelo de ratón NSG humanizado hSIS (Fig. 3C,D), y el análisis se
realizó utilizando controles de ensayo de citometría de flujo adecuados (Fig. 6 suplementaria).

El modelo de rata SRG humanizada con hSIS facilita el desarrollo de piel humana de espesor completo, tejido tímico y células
inmunitarias humanas. Si bien los ratones humanizados han proporcionado plataformas in vivo para el modelado de
enfermedades humanas, su corta esperanza de vida y el pequeño tamaño/volumen tisular de los ratones constituyen una
limitación importante para los estudios a largo plazo y preclínicos, respectivamente. Planteamos la hipótesis de que un modelo
de roedor inmunodeficiente más grande, con una esperanza de vida más larga, concretamente la rata, facilitaría el desarrollo
de un modelo in vivo para estudios a largo plazo (más de 6 meses) y proporcionaría un gran volumen/tamaño tisular. Además,
planteamos la hipótesis de que el cotrasplante de piel fetal humana de espesor completo, tejido tímico fetal autólogo, tejido
hepático fetal autólogo y células madre hematopoyéticas derivadas de hígado fetal autólogas en ratas SRG permitiría el
desarrollo de un modelo que contiene piel humana, timo autólogo y células inmunitarias humanas autólogas, denominado rata SRG humaniz

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Figura 2. Desarrollo de la piel humana y células inmunes en el modelo de ratón NSG humanizado de piel y sistema inmune
humano. (A) El análisis histológico representativo (H&E) de la piel humana en ratones NSG humanizados de piel y
sistema inmune humano (n = 4) demuestra el desarrollo de la piel adulta humana, incluyendo la dermis, la capa
multicelular (> 5 capas) de la epidermis y la envoltura cornificada. El análisis histológico representativo (H&E) de la
piel del ratón demuestra una capa delgada de células epidérmicas, con una capa dérmica delgada. (B) Varias células de la
piel humana están presentes en la piel humana, incluyendo queratinocitos (células AE1 / AE3 +, células hCytokeratins
+), fibroblastos dérmicos (células TE7 +, células hFibroblast +), células inmunes cutáneas (células hCD45 +) y
células de Langerhans (hCD207 +); Las células vasculares que expresan actina de músculo liso alfa (células hα­SMA+)
están presentes en el xenoinjerto de piel humana y se expanden durante la cicatrización de la herida y se contraen
después de ella (n = 4). Las flechas negras indican células IHC+ representativas. (C) El análisis histológico e
inmunohistoquímico representativo del bazo y el timo humanos (ambos bajo la cápsula renal) en ratones NSG
humanizados con piel y sistema inmunitario humano demuestra el desarrollo de dichos tejidos linfoides a las diez semanas
del trasplante, con macrófagos humanos (hCD68+), linfocitos T (hCD3+) y linfocitos B (hCD20+) presentes en los tejidos (n =
4). Barras de escala: 200 μm.

Se implantaron tejidos fetales de timo y hígado ( fragmentos de aproximadamente 1 mm³) en las cápsulas renales de ratas
SRG irradiadas, y estas ratas fueron trasplantadas inmediatamente con células madre hematopoyéticas autólogas. Se extrajo
el exceso de tejido graso de la piel fetal humana y, posteriormente, se injertó sobre la caja torácica, donde previamente se
extirpó la piel de la rata. Las ratas SRG fueron trasplantadas con piel humana más células madre hematopoyéticas humanas
CD34+ y tejido de timo, o solo con piel humana; el 100 % de las ratas injertó y desarrolló con éxito los tejidos humanos
trasplantados (Fig. 7 suplementaria). Sin embargo, no se observó una reconstitución de células inmunitarias humanas en la
sangre de las ratas trasplantadas en ningún grupo que utilizó esta metodología de trasplante (datos no mostrados).
El análisis macroscópico de la piel humana en ratas trasplantadas con células madre hematopoyéticas humanas CD34+, timo
y piel, demostró cicatrización de heridas a las tres semanas del trasplante y maduración progresiva hasta alcanzar la piel
adulta (Fig. 4A). La piel humana trasplantada sobre SRG (con o sin tejido linfoide, además de células madre hematopoyéticas
humanas CD34+) también favorece el desarrollo de apéndices cutáneos humanos (cabello) (Fig. 4B). El análisis macroscópico
de los tejidos linfoides en ratas SRG humanizadas con hSIS, a los nueve meses del trasplante, mostró el crecimiento del tejido
tímico humano en la cápsula renal y un aumento marginal del tamaño del bazo de la rata (Fig. 4C). La piel humana de ratas
SRG humanizadas con hSIS mostró el desarrollo de queratinocitos humanos multicapa (AE1/AE3, células con anticuerpos anti­
citoqueratina+) en la epidermis y fibroblastos dérmicos (células con anticuerpos anti­fibroblastos+) en la dermis. Ambos son
comparables a la piel humana adulta (Adult­hSkin) y difieren de la piel de rata (Fig. 5A, Fig. Suplementaria 8). La piel humana
de ratas SRG humanizadas con hSIS mostró una reconstitución de células inmunitarias humanas ( células hCD45+), incluyendo
células de Langerhans (hCD207+).
células), comparable a la piel humana adulta (Adult­hSkin) (Fig. 5A). El análisis histoquímico del tejido del timo humano en
ratas SRG humanizadas con hSIS a los nueve meses del trasplante demuestra el desarrollo del timo, incluyendo la presencia
de lóbulos tímicos (Fig. 5B). Los tejidos del timo humano en la rata SRG humanizada con hSIS exhiben reconstitución de
células inmunitarias humanas (células CD45+ humanas), incluyendo la reconstitución de células T (células CD3+ humanas ) y
macrófagos ( células CD68+ humanas ) (Fig. 5B,C). Además, las células T tímicas humanas exhiben respuesta a citocinas a
la estimulación con microesferas CD3/CD28 (Fig. 9 suplementaria). Las células inmunitarias humanas en la rata SRG
humanizada con hSIS también reconstituyen el bazo de la rata inmunodeficiente (Fig. 5D).

El xenoinjerto de piel humana en modelos de roedores inmunodeficientes respalda la infección

comunitaria por Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SAMR­AC) . Esta infección
representa una amenaza significativa para la salud pública . Por lo tanto, los modelos
in vivo que permiten la investigación de infecciones cutáneas humanas son importantes. Para demostrar que los xenógrafos de
piel fetal humana en roedores inmunodeficientes proporcionan un medio para investigar infecciones cutáneas humanas,
inoculamos (intradérmicamente) los xenógrafos de piel humana similar a la de adultos con CA­MRSA USA300. Observamos
lesiones en la piel humana de ratas SRG inoculadas con CA­MRSA, comparables a las lesiones en pacientes con CA­MRSA;
estas lesiones cutáneas en las ratas mostraron crecimiento bacteriano de CA­MRSA (Fig. 6). La inoculación de CA­MRSA en
el xenógrafo de piel humana en el modelo murino NSG a las 10­12 semanas postrasplante también apoya el crecimiento
bacteriano (Fig. 10 suplementaria).

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Figura 3. Desarrollo de células mononucleares de sangre periférica humana en el modelo murino NSG humanizado con piel y sistema
inmunitario. (A) El análisis representativo por citometría de flujo de la reconstitución de células inmunitarias humanas (hCD45+) en células
mononucleares de sangre periférica (PBMC) de ratones NSG humanizados con piel y sistema inmunitario, a las 10­12 semanas postrasplante,
muestra niveles elevados (>10 %) de células inmunitarias humanas en sangre. (B) Cuantificación de la reconstitución de células
inmunitarias humanas (n = 22; 3 experimentos independientes) en PBMC de ratones humanizados con hSIS a las 10 semanas
postrasplante. (C) El análisis representativo de citometría de flujo de PBMC humanas (PBMC hCD45+) en ratones humanizados con piel y
sistema inmunitario humanos a las 10­12 semanas después del trasplante demuestra niveles fácilmente detectables de varios tipos de
células inmunitarias humanas (células B­PBMC humanas hCD19+hCD3­, células T αβ­PBMC humanas hCD3+, células T hCD4+,
células T hCD8+, células T hγδTCR+­PBMC humanas hγδ TCR+ CD3+, células asesinas naturales (NK)­PBMC humanas hCD57+ hCD3­,
monocitos (hMo)­PBMC humanas hCD14+ CD3­ y granulocitos (hPMN)­PBMC humanas hCD66b+ hCD3­). (D)

Cuantificación de subtipos de células inmunes humanas (n = 4) en PBMC humanas (PBMC hCD45+) de ratones humanizados con piel y
sistema inmunológico humano a las 10­12 semanas después del trasplante.

Discusión
Los modelos de roedores son las principales plataformas para investigar infecciones, lesiones y enfermedades asociadas a la piel humana10,
43. Si bien los modelos de roedores brindan información sobre los mecanismos de las enfermedades humanas y la respuesta/defensa del
huésped contra agentes infecciosos asociados a la piel, existen varias limitaciones en los modelos de roedores10, 43. Está bien establecido
que la piel humana exhibe diferencias estructurales significativas en comparación con la piel de roedores10, 43. Estas diferencias estructurales
podrían desempeñar un papel crítico en las interacciones piel­microbios y la señalización inmunitaria cutánea, lo que resulta en diferencias
significativas en la defensa antimicrobiana del huésped y la respuesta inflamatoria entre la piel humana y la de roedores1, 2.
Estas diferencias también podrían tener un impacto significativo en la traducción de los hallazgos mecanicistas de los
modelos tradicionales de roedores a los humanos.
En un intento por abordar las diferencias de especie entre los modelos tradicionales de roedores de enfermedades cutáneas humanas y
las enfermedades cutáneas en humanos, injertamos piel humana, tejidos linfoides autólogos y células madre hematopoyéticas autólogas en
roedores inmunodeficientes (ratas SRG y ratones NSG). La piel humana injertada en roedores inmunodeficientes desarrolló una estructura
microanatómica que se parecía a la piel humana adulta. Los queratinocitos humanos y los fibroblastos dérmicos, que facilitan el desarrollo de
la epidermis y la dermis multicapa, respectivamente, estaban presentes en la piel humana de las ratas y los ratones humanizados con hSIS.
Para establecer que el xenógrafo de piel humana en ratas inmunodeficientes es susceptible a patógenos humanos, infectamos la piel humana
injertada con CA­MRSA mediante inoculación intradérmica. El xenógrafo de piel humana en el modelo de rata hSIS respalda la infección por
CA­MRSA. La piel humana en el modelo murino humanizado con hSIS también favorece la infección por SARM­AC, aunque la infección
parece inducir una muerte rápida en tres días. Prince et al. informaron que los neutrófilos humanos y los macrófagos derivados de monocitos
son una diana para la leucocidina de Panton­Valentine (PVL) asociada a SARM­AC en ratones humanizados con células inmunitarias humanas
y xenograf 48 del timo; por lo tanto, el aumento de la inflamación podría mediar estas muertes rápidas. En el modelo murino NSG humanizado
con hSIS, observamos niveles fácilmente detectables de monocitos/macrófagos humanos en la sangre y la piel humana. Estudios futuros
investigarán las interacciones entre las perturbaciones de las células inmunitarias humanas y el SARM­AC en la piel infectada. Una limitación
del modelo murino humanizado con hSIS es la corta ventana experimental (<2,5 meses) para la infección, debido a la sequedad de la piel
humana.

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Figura 4. Desarrollo de piel humana y tejido linfoide en el modelo de rata SRG humanizado con piel y sistema inmunitario. El
trasplante de piel fetal humana de espesor completo en el dorso (A, B) y de tejido linfoide fetal autólogo (timo e hígado) en la
cápsula renal (C) de ratas SRG produce el injerto y desarrollo de piel humana de espesor completo y tejido linfoide primario (timo)
(n=4).
(A) Fotografías macroscópicas representativas a las 0 (día del trasplante), 3, 20 y 36 semanas postrasplante que muestran el injerto y
desarrollo de piel fetal humana (utilizando piel de donante obtenida del dorso). (B)
Trasplante de piel fetal humana de espesor completo, derivada de regiones con folículos pilosos significativos (cuero cabelludo), en ratas
SRG con (panel izquierdo) (n = 2) o sin (panel derecho) (n = 2) co­trasplante de timo y células madre hematopoyéticas resulta en el desarrollo
de cabello humano como se exhibe en fotos macroscópicas representativas a los seis meses después del trasplante. En el panel derecho,
piel humana autóloga del dorso y cuero cabelludo fue co­trasplantada para demostrar que el cabello humano solo crece en tejido de piel
humana con folículos pilosos preexistentes (cuero cabelludo; identificado con recuadro negro). (C) Fotos macroscópicas representativas
de tejidos linfoides (timo humano en la cápsula renal y bazo de rata) a los nueve meses después del trasplante demuestran el desarrollo
de tejidos linfoides en comparación con ratas SRG no trasplantadas (n = 4). Los círculos negros denotan tejidos de timo humano.

La xenografía (que produce endurecimiento) y los primeros signos de pérdida de cabello murino (sugestivos de enfermedad de injerto contra
huésped) son evidentes aproximadamente cinco meses después del trasplante. Las ratas SRG humanizadas con hSIS no muestran signos de
enfermedad de injerto contra huésped, incluso a los nueve meses después del trasplante; por lo tanto, las ratas SRG humanizadas con hSIS
podrían proporcionar un modelo in vivo para estudios que requieren una ventana experimental más amplia (>3 meses).
Diversas poblaciones de leucocitos median la respuesta inmunitaria humana; el modelo de ratón humanizado hSIS apoya el desarrollo de
células inmunitarias tanto innatas como adaptativas. La sangre periférica de ratones humanizados hSIS se reconstituye con linfocitos,
granulocitos, monocitos, células dendríticas y células asesinas naturales. Además, el modelo de ratón humanizado hSIS apoya el desarrollo
de tejidos de timo y bazo humanos. La presencia de estos tejidos linfoides primarios y secundarios humanos, junto con el desarrollo de células
inmunitarias innatas y adaptativas, puede permitir que este modelo recapitule las respuestas inmunitarias humanas de novo específicas de
antígeno a una infección cutánea. Curiosamente, el modelo de rata humanizado hSIS exhibió una reconstitución marginal de células
inmunitarias humanas en la sangre periférica, a pesar de la evidencia de reconstitución de células inmunitarias humanas en la piel y el timo
humanos, así como en el bazo de la rata. Una variante transgénica del modelo de rata SRG, que porta la proteína reguladora de señales
humana alfa, un regulador negativo de la fagocitosis de los macrófagos, podría facilitar la reconstitución de células inmunes humanas en la
sangre49, 50.

En resumen, informamos sobre el desarrollo de modelos humanizados de ratón NSG y rata SRG que incorporan tejido
linfoide humano y piel humana autóloga de espesor completo con células inmunes cutáneas. Los ratones NSG y ratas SRG
humanizados con hSIS podrían proporcionar un medio para estudiar las infecciones de la piel25, 48, 51–60.

Métodos
Construcción de roedores humanizados con piel y sistema inmunitario humano. Se obtuvieron roedores machos y hembras adultos (8­10
semanas) con inmunodeficiencia severa, concretamente ratones de la cepa Diabética No Obesa (NOD) (Jackson Laboratory, Stock No:
005557) y ratas de la cepa Sprague Dawley (SD) (Hera Biolabs), portadores de mutaciones en la subunidad gamma del receptor de
interleucina­2 (IL2Rγ), así como en la subunidad catalítica activada por ADN de la proteína quinasa (PRKDC) (solo ratones) o el gen activador
de la recombinación 2 (RAG2) (solo ratas) de un proveedor y se criaron en las instalaciones de la División de Recursos para Animales de
Laboratorio (DLAR) de la Universidad de Pittsburgh. Los tejidos fetales humanos se obtuvieron del Banco de Tejidos de Ciencias de la Salud
de la Universidad de Pittsburgh. Los tejidos fetales humanos para la construcción de roedores humanizados se manipularon y procesaron en
condiciones de bioseguridad de nivel 2. Se mioablaron roedores machos y hembras mediante radiación gamma con un irradiador de cesio­137.
Los ratones recibieron una dosis de 150 rads y las ratas, una dosis de 500 rads. A los ratones machos y hembras mioablados se les
trasplantaron timo, hígado y bazo fetal humano en la cápsula renal, células madre hematopoyéticas CD34+ autólogas (mediante inyección
retroorbitaria de 0,2 × 106 células)17 y piel fetal humana de espesor completo en el panículo carnoso del dorso del ratón, extirpado mediante
piel61­63. A las ratas macho y hembras mioabladas se les trasplantaron timo e hígado fetal humano en la cápsula renal, células madre
hematopoyéticas CD34+ autólogas (mediante inyección retroorbitaria de 0,5 × 106

células) y piel fetal humana autóloga de espesor completo (de menos de cuatro días) en el panículo carnoso del dorso extirpado de piel de
rata61–63 . En algunos casos, a los roedores solo se les trasplantaron células humanas de espesor completo.

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Figura 5. Desarrollo de la piel humana y de las células inmunitarias en el modelo de rata SRG humanizado con piel y sistema inmunitario.
El análisis inmunohistoquímico representativo de la piel humana en la rata humanizada con piel y sistema inmunitario (n=4)
demuestra el desarrollo de la piel humana, incluyendo la dermis, la epidermis multicapa (>5 capas) y la envoltura cornificada,
características distintivas de la piel humana adulta (Adult­hSkin) (n=2) (A). Diversas células cutáneas humanas están presentes en la
piel humana, incluyendo queratinocitos (células AE1/AE3+, células hCytokeratins+), fibroblastos dérmicos (células TE7+, células
hFibroblast+), células inmunitarias cutáneas (células hCD45+) y células de Langerhans (hCD207+; las flechas negras indican células
IHC+) (n=4). (B) El análisis histológico e inmunohistoquímico representativo del timo humano (bajo la cápsula renal) en la rata SRG
humanizada con piel y sistema inmunitario humano demuestra el desarrollo del tejido tímico humano a los nueve meses del trasplante,
con células inmunitarias humanas (CD45+ humanas), incluyendo (C) altos niveles de células T (hCD3+) y macrófagos (hCD68+) (n =
4). (D) El bazo de la rata en el modelo de rata SRG humanizada con piel y sistema inmunitario humano (n = 4) también se reconstituyó
con células inmunitarias humanas (CD45+ humanas); se utilizó una rata SRG no trasplantada (NTP) (n = 2) como control de tinción.
Barras de escala: 200 μm.

Figura 6. Xenografía de piel humana en ratas SRG confirma la infección por SARM­CA. Se inoculó Staphylococcus aureus
resistente a la meticilina asociado a la comunidad (SARM­CA) en xenografía de piel humana (inyección intradérmica) en ratas SRG
humanizadas (n=9) para demostrar que la xenografía de piel humana confirma la infección por SARM­CA. (A) Se examinó el análisis
macroscópico de los tejidos cutáneos en ratas SRG humanizadas (n=9) inoculadas con SARM­CA y se comparó con piel humana
infectada con SARM­CA (crédito de la foto de la piel con SARM­CA del paciente: S. Camazine); también se utilizó piel humana sana de
control en ratas SRG humanizadas (n=5) como control para determinar las lesiones cutáneas. (C) Lesiones cutáneas en la piel humana
humanizada inoculada con SARM­CA.
Las ratas SRG (n = 9) presentan una alta carga de bacterias CA­MRSA medida seis semanas después de la infección.

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Piel fetal. Los roedores se alojaron en condiciones libres de patógenos específicos, se alimentaron con pienso irradiado y se esterilizaron en autoclave.
agua.

Reconstitución de células inmunitarias y ensayos funcionales. Para evaluar la reconstitución de células inmunitarias humanas
en los puntos temporales indicados, se extrajo sangre periférica de animales y se analizaron los leucocitos mediante citometría
de flujo17. En resumen, se extrajo sangre periférica de roedores y se mezcló con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 20
mM en una proporción 1:1. Se prepararon leucocitos unicelulares mediante lisis de eritrocitos con tampón de cloruro de amonio
y potasio (ACK). Para evaluar la reconstitución inmunitaria humana en la xenoinjerto de piel humana en el modelo murino
humanizado con hSIS, se extirpó tejido cutáneo humano de un ratón humanizado con hSIS. Las muestras de piel se cortaron
en trozos pequeños y se digirieron con colagenasa. La dermis se separó de la epidermis y se creó una suspensión unicelular
de tejido dérmico utilizando un disociador GentleMACS (Miltenyi Biotech). Los tejidos epidérmicos se sometieron a tripsinización
para obtener una suspensión unicelular. Las suspensiones de células individuales se tiñeron con el kit LIVE/DEAD Fixable
Aqua Dead Cell Stain (TermoFisher Scientific) y anticuerpos conjugados con fluorocromo (anti­CD45 de ratón­BioLegend, n.°
de cat. 103126; anti­CD45 humano­BioLegend, n.° de cat. 304014), se fijaron con formalina y se analizaron en un analizador
de células BD LSRFortessa™ con citómetro de flujo (BD Biosciences). Los datos se analizaron con el software FlowJo (Dako).
Los leucocitos se seleccionaron mediante mediciones de dispersión frontal y lateral. Se seleccionaron leucocitos unicelulares
y vivos para analizar el porcentaje de leucocitos humanos (anti­CD45+ humano, hCD3+ , hCD4+ , CD8+ , hγδTCR+, hCD19+,
hCD14+, hCD16+, hCD66b+) y leucocitos murinos (anti­CD45+ murino). El análisis de las diversas poblaciones y subconjuntos
de células inmunitarias humanas se centró en leucocitos humanos. También se aislaron células T humanas del tejido tímico
en ratas SRG humanizadas mediante selección inmunomagnética con un anticuerpo anti­CD3 humano (EasySep™ Human
CD3 Positive Selection, n.° de catálogo 17951, Stemcell Technologies) y se trataron sin (vehículo) o con Gibco™ Dynabeads™
Human T­Activator CD3/CD28 (n.° de cat. 111.61D, TermoFisher Scientifc) en presencia de IL­2 recombinante y BD GolgiPlug
(BD Biosciences) durante 12 h. La expresión de citocinas humanas (hTNFα y hIFNγ) en células T humanas se analizó con el
analizador de células BD LSRFortessa™, citómetro de flujo (BD Biosciences), y los datos se analizaron con el software FlowJo
(Dako).

Análisis macroscópico/in situ de células inmunitarias. El análisis macroscópico de los tejidos se realizó con una cámara (8
megapíxeles), y los animales fueron sacrificados o anestesiados antes de fotografiarlos. Las muestras de tejido indicadas,
provenientes de roedores humanizados o humanos (piel humana adulta de un hombre de 77 años, BioChain, número de
catálogo: T2234218, o piel de mama de una mujer adulta, Repositorio de Bioespecímenes de la Universidad de Pittsburgh),
se fijaron con formol y, posteriormente, se incluyeron en parafina. Las secciones fijadas e incluidas en parafina se tiñeron con
hematoxilina y eosina o con los anticuerpos humanos indicados17 (anti­CD45 humano­Biocare Medical Cat. No. CME
PM016AA; anti­CD3 humano­Biocare Medical Cat. No. CME 324 A, B, C; anti­CD68 humano­Biocare Medical número de
catálogo CM 033 A, B, C; anti­CD20 humano­Biocare Medical número de catálogo ACR 3004 A, B; anti­actina de músculo liso
alfa humana; anti­citoqueratina pan, Clon AE1/AE3, Biocare Medical número de catálogo SKU: 011; anti­fbroblasto humano,
Clon TE7, Millipore Sigma número de catálogo CBL271; anti­CD207 humano, Dendritics número de catálogo: DDX0362). La
inmunorreactividad de los anticuerpos se determinó mediante incubación con sustrato DAB (MACH 2 Detection Kit, Biocare
Medical) y contratinción con hematoxilina.

Infección por SARM­CA en piel humana en roedores inmunodeficientes. Los xenógrafos de piel humana de roedores
inmunodeficientes (ratas SRG y ratones NSG) se inocularon con SARM­CA USA30064 mediante inyección intradérmica con
1×10 ¹ UFC para ratas y 1×10 ¹ UFC para ratones; los roedores no trasplantados se inocularon mediante inyección
subcutánea con la misma dosis. Después de tres días, se extirparon porciones de piel humana o de roedor de igual peso y se
determinó la carga bacteriana según el número de unidades formadoras de colonias (UFC). La cepa bacteriana de SARM­CA
se confirmó mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Aprobación ética. Se obtuvieron tejidos fetales humanos anónimos de 18 a 20 semanas de gestación tras una
interrupción del embarazo, ya sea médica o electiva, a través del Hospital Magee­Womens del Centro Médico de la
Universidad de Pittsburgh (UPMC), en colaboración con el Banco de Tejidos de Ciencias de la Salud de la Universidad de Pittsburgh.
Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de las donantes maternas en todos los casos, bajo un protocolo revisado y
aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB) de la Universidad de Pittsburgh; se adhirieron a las directrices aprobadas
y a las regulaciones federales/estatales para todos los procedimientos. El uso de tejidos fetales humanos anónimos para
construir roedores humanizados fue revisado y aprobado por la Oficina de la IRB de la Universidad de Pittsburgh. El uso de
tejidos fetales humanos anónimos no constituyó una investigación con sujetos humanos según se define en las regulaciones
federales [45 CFR 46.102(d o f) y 21 CFR 56.102(c), (e) y (l)]. El uso de células madre hematopoyéticas derivadas de hígado
fetal humano fue revisado y aprobado por la Supervisión de Investigación de Células Madre Humanas (hSCRO) en la
Universidad de Pittsburgh. El uso de un agente biológico (CA­MRSA), ADN recombinante y animales transgénicos fue revisado
y aprobado por el Comité Institucional de Bioseguridad (IBC) en la Universidad de Pittsburgh. Todos los estudios con animales
y protocolos experimentales fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la
Universidad de Pittsburgh y se llevaron a cabo siguiendo pautas aprobadas, que se adhieren a las pautas del NIH para el
alojamiento y cuidado de animales de laboratorio.

Disponibilidad de datos
Los conjuntos de datos generados y/o analizados por los autores durante este estudio están disponibles a pedido razonable
del autor correspondiente.

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Recibido: 9 de octubre de 2019; Aceptado: 13 de agosto de 2020

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3141–3151. [Link] (2001).

Expresiones de gratitud
Utilizamos el Centro de Cáncer UPMC­Hillman y el Departamento de Patología de Tejidos e Investigación dentro del Centro de
Bioespecímenes de la Universidad de Pittsburgh, que está financiado en parte por la beca P30CA047904 de los NIH. La Srta.
Vanshika Narala y la Srta. Nivitha Periyapatna, del Departamento de Enfermedades Infecciosas y Microbiología de la Universidad
de Pittsburgh, colaboraron en la recopilación y el análisis de datos histológicos. Berthony Deslouches, del Departamento de
Microbiología y Genética Molecular de la Universidad de Pittsburgh, brindó valiosos consejos para el desarrollo de este proyecto.
Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH)­Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades
Infecciosas (NIAID) (R21AI135412). El Instituto Nacional de Salud, que financia este trabajo, exige a los científicos que envíen
los manuscritos finales de revistas revisadas por pares que surgen de los fondos de los NIH al archivo digital PubMed Central
tras la aceptación para su publicación.

Contribuciones del autor

MB, LT, TY y AR concibieron y diseñaron los experimentos del estudio. YA, CB, SH, AD, LT, RS, SK, SB, IC y MB realizaron los
experimentos. MB, AR, LT, YA y CB analizaron e interpretaron los datos.
MB, YA, CB, SB, IC y SH prepararon el manuscrito.

Intereses en competencia
Yash Agarwal, Cole Beatty, Sara Ho, Lance Turlow, Antu Das, Samantha Kelly, Rajeev Salunke, Isabella Castronova,
Shivkumar Biradar, Anthony Richardson y Moses Bility han declarado que no existe ningún conflicto de intereses. Tseten Yeshi
tiene un conflicto de intereses financiero, ya que trabaja para HaraBiolabs, proveedor de Sprague–
Rata Dawley­Rag2tm2hera Il2rγtm1hera (SRG) comercializada.

Informes científicos | (2020) 10:14598 | [Link] 10

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La correspondencia y las solicitudes de materiales deberán dirigirse a MB

La información sobre reimpresiones y permisos está disponible en [Link]/reprints.

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afiliaciones institucionales.

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permite su uso, intercambio, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se
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© Te Autor(es) 2020, publicación corregida 2021

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