Técnicas de ingeniería genética

Las técnicas de ingeniería genética permiten modificar los genomas de animales y plantas. Se han
ideado técnicas para insertar, eliminar y modificar el ADN a múltiples niveles, desde un par de bases
específico en un gen concreto hasta genes enteros. Hay una serie de pasos que se siguen antes de crear un
organismo modificado genéticamente (OMG). En primer lugar, los ingenieros genéticos deben elegir qué
gen desean insertar, modificar o eliminar. A continuación, deben aislar el gen e incorporarlo, junto con
otros elementos genéticos, a un vector adecuado. Este vector se utiliza entonces para insertar el gen en el
genoma del huésped, creando un organismo transgénico o editado.

La capacidad de diseñar organismos genéticamente se basa en años de investigación y descubrimientos

sobre la función y manipulación de los genes. Entre los avances más importantes figuran el
descubrimiento de enzimas de restricción, ligasas de ADN y el desarrollo de secuenciación y reacción en
cadena de la polimerasa.

Los genes añadidos suelen ir acompañados de regiones promotoras y terminadoras, así como de un gen
marcador seleccionable. El propio gen añadido puede modificarse para que se exprese con mayor
eficacia. A continuación, el vector se inserta en el genoma del organismo huésped. En el caso de los
animales, el gen suele insertarse en células madre embrionarias, mientras que en las plantas puede
insertarse en cualquier tejido que pueda cultivarse hasta convertirse en una planta completamente
desarrollada.

Se realizan pruebas en el organismo modificado para garantizar una integración, herencia y expresión
estables. Los descendientes de la primera generación son heterocigóticos, por lo que es necesario
cruzarlos para crear el patrón homocigótico necesario para una herencia estable. La homocigosis debe
confirmarse en los ejemplares de segunda generación.

Las primeras técnicas insertaban los genes al azar en el genoma. Los avances permiten dirigirlos a lugares
específicos, lo que reduce los efectos secundarios no deseados. Las primeras técnicas se basaban en
meganucleasas y nucleasas con dedos de zinc . Desde 2009 se han desarrollado sistemas más precisos y
fáciles de implementar. Las nucleasas efectoras similares a activadores de transcripción (TALEN) y el
sistema Cas9-guideRNA (adaptado de CRISPR ) son los dos más comunes.

Historia
Muchos descubrimientos y avances diferentes condujeron al desarrollo de la ingeniería genética. La
manipulación genética dirigida por el hombre comenzó con la domesticación de plantas y animales
mediante selección artificial en torno al año 12.000 a. C.1 :1
​ Se desarrollaron varias técnicas para ayudar
en la cría y la selección. La hibridación era una forma de introducir cambios rápidos en la composición
genética de un organismo. Lo más probable es que la hibridación de cultivos se produjera por primera vez
cuando los humanos empezaron a cultivar individuos genéticamente distintos de especies emparentadas
muy cerca unos de otros.2 :​ 32 Algunas plantas pudieron propagarse por clonación vegetativa.2 :​ 31 La
herencia genética fue descubierta por primera vez por Gregor Mendel en 1865, tras realizar experimentos
cruzando guisantes.3 ​ En 1928, Frederick Griffith demostró la existencia de un "principio transformador"
involucrado en la herencia, que fue identificado como ADN en 1944 por Oswald Avery, Colin MacLeod y
Maclyn McCarty . Frederick Sanger desarrolló un método para secuenciar el ADN en 1977, lo que
incrementó enormemente la información genética disponible para los investigadores.

Tras descubrir la existencia y propiedades del ADN, hubo que desarrollar herramientas que permitieran
manipularlo. En 1970, el laboratorio de Hamilton Smith descubrió las enzimas de restricción, que
permitían a los científicos aislar genes del genoma de un organismo.4 ​ Las ligasas de ADN, que unen el
ADN roto, se habían descubierto antes, en 1967.5 ​ La combinación de ambas enzimas permitió "cortar y
pegar" secuencias de ADN para crear ADN recombinante. Los plásmidos, descubiertos en 1952,6 ​ se
convirtieron en herramientas importantes para transferir información entre células y replicar secuencias
de ADN. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR), desarrollada por Kary Mullis en 1983, permitió
amplificar (replicar) pequeñas secciones de ADN y facilitó la identificación y el aislamiento de material
genético.

Además de manipular el ADN, había que desarrollar técnicas para su inserción en el genoma de un
organismo. El experimento de Griffith ya había demostrado que algunas bacterias tenían la capacidad de
captar y expresar ADN extraño de forma natural. En 1970 se indujo la competencia artificial en
Escherichia coli tratándolas con una solución de cloruro cálcico (CaCl2).7 ​ La transformación mediante
electroporación se desarrolló a fines de la década de 1980, aumentando la eficacia y el alcance
bacteriano.8 ​ En 1907 se había descubierto una bacteria que causaba tumores en las plantas,
Agrobacterium tumefaciens. A principios de los años 70 se descubrió que esta bacteria insertaba su ADN
en las plantas utilizando un plásmido Ti.9 ​ Al eliminar los genes del plásmido que causaban el tumor y
añadir genes nuevos, los investigadores pudieron infectar las plantas con A. tumefaciens y dejar que la
bacteria insertara el ADN que habían elegido en los genomas de las plantas.10 ​

Elección de genes diana

El primer paso consiste en identificar el gen o genes diana que se insertarán en el organismo huésped.
Esto depende del objetivo del organismo resultante. En algunos casos sólo se ven afectados uno o dos
genes. Para objetivos más complejos pueden estar implicadas vías biosintéticas enteras en las que
intervienen múltiples genes. Una vez encontrados, los genes y otra información genética de una amplia
gama de organismos pueden insertarse en bacterias para su almacenamiento y modificación, creando
bacterias modificadas genéticamente en el proceso. Las bacterias son baratas, fáciles de cultivar, clonales,
se multiplican rápidamente, relativamente fáciles de transformar y pueden almacenarse a -80 °C casi
indefinidamente. Una vez aislado un gen, puede almacenarse en el interior de la bacteria, lo que
proporciona un suministro ilimitado para la investigación.11 ​

Se pueden realizar cribas genéticas para determinar genes potenciales, seguidas de otras pruebas que
identifiquen a los mejores candidatos. Una criba sencilla consiste en mutar aleatoriamente el ADN con
sustancias químicas o radiaciones y luego seleccionar los que presentan el rasgo deseado. Para los
organismos en los que la mutación no resulta práctica, los científicos buscan en su lugar individuos de la
población que presenten la característica a través de mutaciones que se producen de forma natural. Los
procesos que analizan un fenotipo e intentan identificar el gen responsable se denominan genética directa.
A continuación hay que localizar el gen comparando la herencia del fenotipo con marcadores genéticos
conocidos. Es probable que los genes cercanos se hereden juntos.12 ​
Otra opción es la genética inversa. Este enfoque consiste en atacar a un gen específico con una mutación
y luego observar qué fenotipo se desarrolla.12 ​ La mutación puede diseñarse para inactivar el gen o solo
permitir que se active bajo ciertas condiciones. Las mutaciones condicionales son útiles para identificar
genes que normalmente son letales si no funcionan.13 ​ Como los genes con funciones similares
comparten secuencias similares ( homólogas ), es posible predecir la función probable de un gen
comparando su secuencia con la de genes bien estudiados de organismos modelo.12 ​ El desarrollo de
micromatrices, transcriptomas y la secuenciación del genoma ha facilitado mucho la búsqueda de genes
deseables.14 ​

La bacteria Bacillus thuringiensis se descubrió por primera vez en 1901 como agente causante de la
muerte de gusanos de seda. Debido a estas propiedades insecticidas, la bacteria se utilizó como
insecticida biológico, desarrollado comercialmente en 1938. En 1956 se descubrieron las proteínas cry
que proporcionan la actividad insecticida, y en la década de 1980 los científicos habían clonado con éxito
el gen que codifica esta proteína y lo habían expresado en plantas.15 ​ El gen que proporciona resistencia
al herbicida glifosato se encontró tras siete años de búsqueda en bacterias que vivían en el tubo de
desagüe de una planta de fabricación de RoundUp de Monsanto.16 ​ En los animales, la mayoría de los
genes utilizados son genes de la hormona del crecimiento.17 ​

Manipulación de genes
Todos los procesos de ingeniería genética implican la modificación del ADN. Tradicionalmente, el ADN
se aislaba de las células de los organismos. Más tarde, los genes pasaron a clonarse a partir de un
segmento de ADN tras la creación de una biblioteca de ADN o sintetizarse artificialmente. Una vez
aislados, se añaden elementos genéticos adicionales al gen para permitir su expresión en el organismo
huésped y ayudar a la selección.

Extracción a partir de células

En primer lugar, la célula debe abrirse suavemente para exponer el ADN sin dañarlo demasiado. Los
métodos utilizados varían en función del tipo de célula. Una vez abierta, hay que separar el ADN de los
demás componentes celulares. Una célula rota contiene proteínas y otros restos celulares. Mezclando con
fenol y/o cloroformo, seguido de centrifugación, los ácidos nucleicos pueden separarse de estos restos en
una fase acuosa superior. Esta fase acuosa puede eliminarse y purificarse aún más si es necesario
repitiendo los pasos de fenol-cloroformo. A continuación, los ácidos nucleicos pueden precipitarse de la
solución acuosa con etanol o isopropanol. Cualquier ARN puede eliminarse agregando una ribonucleasa
que lo degrade. Muchas empresas venden ahora kits que simplifican el proceso.18 ​

Aislamiento de genes
El gen que los investigadores pretenden modificar (conocido como gen de interés) debe separarse del
ADN extraído. Si no se conoce la secuencia, un método habitual es romper el ADN con un método de
digestión aleatoria. Para ello se suelen utilizar enzimas de restricción (enzimas que cortan el ADN). Una
digestión de restricción parcial corta sólo algunos de los sitios de restricción, lo que da lugar a segmentos
de fragmentos de ADN superpuestos. Los fragmentos de ADN se introducen en vectores plasmídicos
individuales y se cultivan dentro de bacterias. Una vez en la bacteria, el plásmido se copia a medida que
la bacteria se divide. Para determinar si un gen útil está presente en un fragmento concreto, se analiza la
biblioteca de ADN en busca del fenotipo deseado. Si se detecta el fenotipo, es posible que la bacteria
contenga el gen diana.

Si el gen no tiene un fenotipo detectable o una biblioteca de ADN no contiene el gen correcto, deben
utilizarse otros métodos para aislarlo. Si la posición del gen puede determinarse mediante marcadores
moleculares, una forma de aislar el fragmento de ADN correcto es realizar un recorrido cromosómico. Si
el gen expresa una homología cercana a un gen conocido de otra especie, entonces podría aislarse
buscando genes en la biblioteca que coincidan estrechamente con el gen conocido.19 ​

Para secuencias de ADN conocidas, pueden utilizarse enzimas de restricción que cortan el ADN a ambos
lados del gen. A continuación, la electroforesis en gel clasifica los fragmentos en función de su
longitud.20 ​ Algunos geles pueden separar secuencias que difieren en un solo par de bases. El ADN se
puede visualizar tiñéndolo con bromuro de etidio y fotografiándolo bajo luz ultravioleta. Se puede
colocar un marcador con fragmentos de longitudes conocidas junto al ADN para estimar el tamaño de
cada banda. La banda de ADN del tamaño correcto debe contener el gen, donde se puede eliminar del
gel.18 ​ : 40–41 Otra técnica para aislar genes de secuencias conocidas es la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR).21 ​ La PCR es una potente herramienta que puede amplificar una secuencia
determinada, que luego puede aislarse mediante electroforesis en gel. Su eficacia disminuye con genes
más grandes y tiene el potencial de introducir errores en la secuencia.

Es posible sintetizar genes artificialmente.22 ​ Algunas secuencias sintéticas están disponibles en el

mercado, lo que permite prescindir de muchos de estos primeros pasos.23 ​

Modificación
El gen que se va a insertar debe combinarse con otros elementos genéticos para que funcione
correctamente. El gen puede modificarse en esta fase para mejorar su expresión o eficacia. Además del
gen que se va a insertar, la mayoría de las construcciones contienen una región promotora y terminadora,
así como un gen marcador seleccionable. La región promotora inicia la transcripción del gen y puede
utilizarse para controlar la localización y el nivel de expresión del gen, mientras que la región
terminadora finaliza la transcripción. Un marcador seleccionable, que en la mayoría de los casos confiere
resistencia a los antibióticos al organismo en el que se expresa, se utiliza para determinar qué células se
transforman con el nuevo gen. Las construcciones se realizan mediante técnicas de ADN recombinante,
como digestiones de restricción, ligaciones y clonación molecular.24 ​

Insertar ADN en el genoma del huésped

Una vez construido el gen, debe integrarse de forma estable en el genoma del organismo objetivo o existir
como ADN extracromosómico. Existen varias técnicas para insertar el gen en el genoma del huésped y
varían en función del tipo de organismo objetivo. En los eucariotas pluricelulares, si el transgén se
incorpora a las células de la línea germinal del huésped, la célula huésped resultante puede transmitir el
transgén a su progenie. Si el transgén se incorpora a las células somáticas, el transgén no puede
heredarse.25 ​
Transformación
La transformación es la alteración directa de los componentes
genéticos de una célula mediante el paso del material genético a
través de la membrana celular. Aproximadamente el 1% de las
bacterias son capaces por naturaleza de captar ADN extraño, pero
esta capacidad puede inducirse en otras bacterias.26 ​ El estrés de
las bacterias con un choque térmico o la electroporación puede
hacer que la membrana celular sea permeable al ADN que luego
puede incorporarse al genoma o existir como ADN
extracromosómico. Por lo general, las células se incuban en una
La transformación bacteriana
solución que contiene cationes divalentes (a menudo, cloruro de consiste en trasladar un gen de una
calcio ) en condiciones de frío, antes de exponerlas a un pulso de bacteria a otra. Se integra en el
calor (choque térmico). El cloruro de calcio rompe parcialmente la plásmido receptor y puede ser
membrana celular, lo que permite que el ADN recombinante entre expresado por el nuevo huésped.
en la célula huésped. Se sugiere que la exposición de las células a
cationes divalentes en condiciones de frío puede cambiar o
debilitar la estructura de la superficie celular, haciéndola más permeable al ADN. Se cree que el pulso de
calor crea un desequilibrio térmico a través de la membrana celular, lo que obliga al ADN a entrar en las
células a través de los poros celulares o de la pared celular dañada. La electroporación es otro método
para promover la competencia. En este método, las células reciben una breve descarga con un campo
eléctrico de 10-20 kV/cm, que se cree que crea agujeros en la membrana celular a través de los cuales
puede entrar el ADN plasmídico. Tras la descarga eléctrica, los agujeros se cierran rápidamente gracias a
los mecanismos de reparación de la membrana celular. El ADN captado puede integrarse en el genoma
bacteriano o, lo que es más habitual, existir como ADN extracromosómico.

En las plantas, el ADN suele

insertase mediante
recombinación mediada por
Agrobacterium,27 ​
aprovechando la secuencia de
ADN-T de Agrobacterium que
permite la inserción natural de
material genético en las células
vegetales.28 ​ El tejido vegetal se
corta en trozos pequeños y se
sumerge en un líquido que
contiene Agrobacterium en
A. tumefaciens adhiriéndose a
suspensión. La bacteria se
una célula de zanahoria
adhiere a muchas de las células
Una pistola de genes utiliza la vegetales expuestas por los
biolística para insertar ADN en el cortes. La bacteria usa la conjugación para transferir un segmento
tejido vegetal de ADN llamado ADN-T desde su plásmido a la planta. El ADN
transferido se dirige al núcleo de la célula vegetal y se integra en
el ADN genómico de la planta huésped. El ADN-T del plásmido
se integra de forma semialeatoria en el genoma de la célula huésped.29 ​
Modificando el plásmido para que exprese el gen de interés, los investigadores pueden insertar el gen
elegido de forma estable en el genoma de la planta. Las únicas partes esenciales del ADN-T son sus dos
pequeñas repeticiones de borde (25 pares de bases), al menos una de las cuales es necesaria para la
transformación de la planta.30 31
​ ​Los genes que se van a introducir en la planta se clonan en un vector de
transformación de plantas que contiene la región de ADN-T del plásmido. Un método alternativo es la
agroinfiltración.32 33
​ ​

Otro método utilizado para transformar células vegetales es la biolística, en la que se recubren partículas
de oro o tungsteno con ADN y se inyectan en células vegetales jóvenes o embriones de plantas.34 ​ Parte
del material genético entra en las células y las transforma. Este método puede utilizarse en plantas que no
son susceptibles a la infección por Agrobacterium y también permite la transformación de los plástidos de
las plantas. Las células vegetales también pueden transformarse mediante electroporación, que utiliza una
descarga eléctrica para hacer que la membrana celular sea permeable al ADN plasmídico. Debido al daño
causado a las células y al ADN, la eficacia de transformación de la biolística y la electroporación es
menor que la de la transformación agrobacteriana.

Transfección
La transformación tiene un significado diferente en relación con los animales, ya que indica la progresión
a un estado canceroso, por lo que el proceso utilizado para insertar ADN extraño en células animales
suele denominarse transfección.35 ​ Hay muchas formas de introducir directamente ADN en células
animales in vitro. A menudo, estas células son células madre que se utilizan para la terapia génica. Los
métodos basados en sustancias químicas utilizan compuestos naturales o sintéticos para formar partículas
que facilitan la transferencia de genes a las células.36 ​ Estos vectores sintéticos tienen la capacidad de
unir ADN y dar cabida a grandes transferencias genéticas.37 ​ Uno de los métodos más sencillos consiste
en utilizar fosfato de calcio para unir el ADN y luego exponerlo a células cultivadas. La solución, junto
con el ADN, es encapsulada por las células.38 ​ Los liposomas y los polímeros pueden utilizarse como
vectores para introducir el ADN en células animales cultivadas. Los liposomas cargados positivamente se
unen al ADN,36 ​ mientras que pueden diseñarse polímeros que interactúen con el ADN. Forman
lipoplejos y poliplejos, respectivamente, que son absorbidos por las células. Otras técnicas son la
electroporación y la biolística.39 ​ En algunos casos, las células transfectadas pueden integrar de forma
estable el ADN externo en su propio genoma; este proceso se conoce como transfección estable.40 ​

Para crear animales transgénicos, el ADN debe insertarse en embriones u óvulos viables. Para ello se
suele utilizar la microinyección, en la que el ADN se inyecta a través de la envoltura nuclear de la célula
directamente en el núcleo.26 ​ Los óvulos fecundados superovulados se recogen en la fase unicelular y se
cultivan in vitro. Cuando los pronúcleos de la cabeza del espermatozoide y del óvulo son visibles a través
del protoplasma, el material genético se inyecta en uno de ellos. A continuación, el ovocito se implanta en
el oviducto de un animal pseudoembarazado.41 ​ Otro método es la transferencia genética mediada por
células madre embrionarias. El gen se transfecta en células madre embrionarias y luego se insertan en
blastocitos de ratón que se implantan en madres adoptivas. La descendencia resultante es quimérica, y el
apareamiento posterior puede producir ratones totalmente transgénicos con el gen de interés.42 ​
Transducción
La transducción es el proceso por el que un virus o vector viral introduce ADN extraño en una célula.43 ​
Los virus modificados genéticamente pueden utilizarse como vectores virales para transferir genes diana
a otro organismo en terapia génica.44 ​ Primero se eliminan del virus los genes virulentos y se insertan en
su lugar los genes diana. Las secuencias que permiten al virus insertar los genes en el organismo huésped
deben permanecer intactas. Los vectores virales más populares se desarrollan a partir de retrovirus o
adenovirus. Otros virus utilizados como vectores son los lentivirus, los virus de la viruela y los virus del
herpes. El tipo de virus utilizado dependerá de las células objetivo y de si el ADN debe alterarse de forma
permanente o temporal.

Regeneración
Como a menudo sólo se transforma una única célula con material genético, el organismo debe
regenerarse a partir de esa única célula. En las plantas, esto se consigue mediante el cultivo de tejidos.45 ​
46 ​ Cada especie vegetal tiene requisitos diferentes para que la regeneración tenga éxito. Si tiene éxito, la

técnica produce una planta adulta que contiene el transgén en cada célula.47 ​En los animales es necesario
asegurarse de que el ADN insertado está presente en las células madre embrionarias.27 ​ La descendencia
puede ser examinada para detectar el gen. Todos los descendientes de la primera generación son
heterocigotos para el gen insertado y deben cruzarse para producir un espécimen homocigoto. Las
bacterias constan de una sola célula y se reproducen clonalmente, por lo que no es necesaria la
regeneración. Se utilizan marcadores seleccionables para diferenciar fácilmente las células transformadas
de las no transformadas.

Las células que han sido transformadas con éxito con el ADN contienen el gen marcador, mientras que
las no transformadas no lo contienen. Cultivando las células en presencia de un antibiótico o producto
químico que seleccione o marque las células que expresan ese gen, es posible separar las células
modificadas de las no modificadas. Otro método de cribado consiste en utilizar una sonda de ADN que se
adhiere únicamente al gen insertado. Estos marcadores suelen estar presentes en el organismo
transgénico, aunque se han desarrollado varias estrategias que pueden eliminar el marcador seleccionable
de la planta transgénica madura.48 ​

Confirmación
Descubrir que un organismo recombinante contiene los genes insertados no suele ser suficiente para
garantizar que se expresarán adecuadamente en los tejidos previstos. Para confirmar que un organismo
contiene el nuevo gen se realizan pruebas adicionales mediante PCR, hibridación Southern y
secuenciación del ADN. Estas pruebas también pueden confirmar la localización cromosómica y el
número de copias del gen insertado.49 ​ Una vez confirmados, también se utilizan métodos que buscan y
miden los productos génicos (ARN y proteínas) para evaluar la expresión génica, la transcripción, los
patrones de procesamiento del ARN y la expresión y localización de los productos proteicos. Entre ellos
se incluyen la hibridación norte, la RT-PCR cuantitativa, el Western blot, la inmunofluorescencia, el
ELISA y el análisis fenotípico.50 ​ Cuando procede, se estudia la descendencia del organismo para
confirmar que el transgén y el fenotipo asociado se heredan de forma estable.
Inserción de genes dirigida
Los métodos tradicionales de ingeniería genética suelen insertar el nuevo material genético de forma
aleatoria en el genoma del huésped. Esto puede perjudicar o alterar otros genes del organismo. Se
desarrollaron métodos que insertaban el nuevo material genético en sitios específicos dentro del genoma
de un organismo. Los primeros métodos de inserción de genes en determinados lugares del genoma se
basaban en la recombinación homóloga (RH).51 ​ Al crear construcciones de ADN que contienen una
plantilla que coincide con la secuencia del genoma objetivo, es posible que los procesos de RH dentro de
la célula inserten la construcción en el lugar deseado. El uso de este método en células madre
embrionarias ha permitido desarrollar ratones transgénicos con knock out selectivo. También ha sido
posible introducir genes o alterar los patrones de expresión génica.52 ​

Si se elimina un gen vital, puede resultar letal para el organismo. Para estudiar la función de estos genes,
se utilizan recombinasas específicas de sitio (RES). Los dos tipos más comunes son los sistemas Cre-
LoxP y Flp-FRT. La recombinasa Cre es una enzima que elimina ADN mediante recombinación
homóloga entre secuencias de unión conocidas como sitios Lox-P. El sistema Flip-FRT funciona de forma
similar, con la recombinasa Flip reconociendo secuencias FRT. Cruzando un organismo que contenga los
sitios de recombinasa flanqueando el gen de interés con un organismo que exprese el RES bajo el control
de promotores específicos de tejido, es posible eliminar o activar genes sólo en determinadas células.
Esto también se ha utilizado para eliminar genes marcadores de animales transgénicos. Otras
modificaciones de estos sistemas permitieron a los investigadores inducir la recombinación sólo en
determinadas condiciones, lo que permitió eliminar o expresar genes en los momentos o estadios de
desarrollo deseados.52 ​

La edición del genoma utiliza nucleasas artificiales que crean roturas específicas de doble cadena en los
lugares deseados del genoma. Estas roturas están sujetas a procesos celulares de reparación del ADN que
pueden aprovecharse para eliminar, corregir o insertar genes. Si existe un ADN donante que contenga la
secuencia adecuada (homologías), el nuevo material genético que contenga el transgén se integrará en el
lugar deseado con gran eficacia medianterecombinación homóloga.53 ​ Hay cuatro familias de nucleasas
diseñadas: meganucleasas,54 55​ ​ ZFN,56 57
​ ​ nucleasas efectoras similares a activadores de transcripción
58 59
(TALEN), ​ ​ las CRISPR/Cas (agrupadas regularmente interespaciadas cortas Repetición
palindrómica/proteína asociada a CRISPR (p. ej.) CRISPR/Cas9) .60 61 ​ ​ Entre los cuatro tipos, TALEN y
62
CRISPR/Cas son los dos más utilizados. ​ Los últimos avances se han centrado en la combinación de
varios sistemas para explotar las mejores características de ambos (por ejemplo, megaTAL, que es una
fusión de un dominio de unión al ADN TALE y una meganucleasa).63 ​La investigación reciente también
se ha centrado en el desarrollo de estrategias para eliminar o corregir genes sin crear roturas de doble
cadena (editores de bases).62 ​

Meganucleasas y nucleasas con dedos de zinc

Las meganucleasas se utilizaron por primera vez en 1988 en células de mamíferos.64 ​Las meganucleasas
son endodesoxirribonucleasas que funcionan como enzimas de restricción con sitios de reconocimiento
largos, lo que las hace más específicas para su sitio diana que otras enzimas de restricción. Esto aumenta
su especificidad y reduce su toxicidad, ya que no se dirigen a tantos sitios dentro de un genoma. Las
meganucleasas más estudiadas son las de la familia LAGLIDADG. Aunque las meganucleasas siguen
siendo bastante susceptibles a la unión fuera del objetivo, lo que las hace menos atractivas que otras
herramientas de edición de genes, su menor tamaño las hace atractivas sobre todo para las perspectivas de
vectorización viral.65 53
​ ​

Las nucleasas de dedos de zinc (ZFN), utilizadas por primera vez en 1996, suelen crearse mediante la
fusión de dominios de dedos de zinc y el dominio de nucleasa FokI. De este modo, las ZFN tienen la
capacidad de escindir el ADN en los sitios diana.53 ​ Mediante la ingeniería del dominio de dedo de zinc
para apuntar a un sitio específico dentro del genoma, es posible editar la secuencia genómica en el lugar
deseado.65 66
​ 53
​ ​ Los ZFN son más específicos, pero también pueden unirse a secuencias inespecíficas.
Aunque para crear organismos modelo transgénicos es aceptable un cierto grado de escisión fuera del
objetivo, podrían no ser óptimos para todos los tratamientos de terapia génica en humanos.65 ​

TALEN y CRISPR
El acceso al código que rige el reconocimiento del ADN por parte de los efectores similares a activadores
de la transcripción (TALE) en 2009 abrió el camino al desarrollo de una nueva clase de eficaces
herramientas de edición génica basadas en TAL. Las TALE, proteínas secretadas por el patógeno vegetal
Xanthomonas, se unen con gran especificidad a genes dentro de la planta huésped e inician la
transcripción de los genes ayudando a la infección. La ingeniería de las TALE mediante la fusión del
núcleo de unión al ADN con el dominio catalítico de la nucleasa FokI permitió crear una nueva
herramienta de nucleasas de diseño, la nucleasa TALE (TALEN).67 ​ Tienen una de las mayores
especificidades de todas las nucleasas de ingeniería actuales. Debido a la presencia de secuencias
repetidas, son difíciles de construir mediante procedimientos estándar de biología molecular y dependen
de métodos más complicados, como la clonación Golden Gate.62 ​

En 2011, se desarrolló otra tecnología revolucionaria basada en los sistemas CRISPR/Cas (repetición
palindrómica corta agrupada y regularmente interespaciada / proteína asociada CRISPR) que funcionan
como un sistema inmunitario adaptativo en bacterias y arqueas. El sistema CRISPR/Cas permite a las
bacterias y arqueas luchar contra los virus invasores cortando el ADN viral e insertando fragmentos de
ese ADN en su propio genoma. A continuación, el organismo transcribe este ADN en ARN y combina
este ARN con las proteínas Cas9 para realizar roturas de doble cadena en el ADN viral invasor. El ARN
sirve de guía para dirigir la enzima Cas9 al punto correcto del ADN del virus. Al emparejar las proteínas
Cas con un ARN guía diseñado, CRISPR/Cas9 puede utilizarse para inducir roturas de doble cadena en
puntos específicos de las secuencias de ADN. La rotura es reparada por las enzimas de reparación del
ADN celular, creando una pequeña mutación de tipo inserción/deleción en la mayoría de los casos. La
reparación selectiva del ADN es posible proporcionando una plantilla de ADN donante que represente el
cambio deseado y que (a veces) se utilice para la reparación de la rotura de doble cadena mediante
recombinación homóloga. Más tarde se demostró que CRISPR/Cas9 puede editar células humanas en una
placa. Aunque la primera generación carece de la especificidad de TALEN, la principal ventaja de esta
tecnología es la simplicidad del diseño. También permite atacar varios sitios simultáneamente, lo que
permite editar varios genes a la vez. CRISPR/Cpf1 es un sistema descubierto más recientemente que
requiere un ARN guía diferente para crear roturas particulares de doble cadena (deja salientes al escindir
el ADN) en comparación con CRISPR/Cas9.62 ​

CRISPR/Cas9 es eficaz en la alteración de genes. La creación de bebés resistentes al VIH por parte del
investigador chino He Jiankui es quizá el ejemplo más famoso de alteración genética mediante este
método.68 ​ Es mucho menos eficaz en la corrección de genes. Se están desarrollando métodos de edición
de bases en los que se utiliza una endonucleasa Cas 9 "muerta por nucleasa" o una enzima relacionada
para la selección de genes, mientras que una enzima deaminasa vinculada realiza un cambio de base
específico en el ADN.69 ​ El perfeccionamiento más reciente de CRISPR-Cas9 se denomina Prime
Editing. Este método combina una transcriptasa inversa con una nucleasa dirigida por ARN que sólo corta
una cadena, pero no rompe la doble. Sustituye la porción de ADN próxima al corte por la acción sucesiva
de la nucleasa y la transcriptasa inversa, introduciendo el cambio deseado a partir de una plantilla de
ARN.70 ​

Referencias
([Link]
1. Root, Clive (2007). Domestication ([Link] 649). PMID 5340583 ([Link]
[Link]/books?id=WGDYHvOHw pubmed/5340583). doi:10.1073/pnas.57.4.1021 (htt
mwC). Greenwood Publishing Groups. ps://[Link]/10.1073%2Fpnas.57.4.1021).
ISBN 9780313339875.
6. «Cell genetics and hereditary symbiosis» (h
2. Kingsbury, Noel (15 de octubre de 2009). ttps://[Link]/details/sim_physiological-r
Hybrid: The History and Science of Plant eviews_1952-10_32_4/page/403).
Breeding ([Link] Physiological Reviews 32 (4): 403-30.
id=dGSj-CFxk-QC). University of Chicago octubre de 1952. PMID 13003535 ([Link]
Press. ISBN 978-0-226-43705-7. [Link]/pubmed/13003535).
3. «What did Gregor Mendel think he doi:10.1152/physrev.1952.32.4.403 ([Link]
discovered?» ([Link] g/10.1152%2Fphysrev.1952.32.4.403).
ent/131/2/245). Genetics 131 (2): 245-53. 7. «Calcium-dependent bacteriophage DNA
Junio de 1992. PMC 1205000 ([Link] infection». Journal of Molecular Biology 53
[Link]/pmc/articles/PMC1205000). (1): 159-62. octubre de 1970. PMID 4922220
PMID 1644269 ([Link] ([Link]
ed/1644269). doi:10.1093/genetics/131.2.245 (http doi:10.1016/0022-2836(70)90051-3 ([Link]
s://[Link]/10.1093%2Fgenetics%2F131.2.245). g/10.1016%2F0022-2836%2870%2990051-3).
4. «How restriction enzymes became the 8. «Transformation of various species of
workhorses of molecular biology» ([Link] gram-negative bacteria belonging to 11
[Link]/pmc/articles/PMC1087 different genera by electroporation».
929). Proceedings of the National Academy Molecular & General Genetics 216 (1):
of Sciences of the United States of America 175-7. marzo de 1989. PMID 2659971 (https://
102 (17): 5905-8. Abril de 2005. [Link]/pubmed/2659971).
Bibcode:2005PNAS..102.5905R ([Link] doi:10.1007/BF00332248 ([Link]
[Link]/abs/2005PNAS..102.5905R). 7%2FBF00332248).
PMC 1087929 ([Link]
ticles/PMC1087929). PMID 15840723 ([Link]
9. Nester, Eugene. «Agrobacterium: The
[Link]/pubmed/15840723).
Natural Genetic Engineer (100 Years
doi:10.1073/pnas.0500923102 ([Link]
Later)» ([Link]
1073%2Fpnas.0500923102).
019164906/[Link]
ons/apsnetfeatures/Pages/Agrobacterium.a
5. «Enzymatic breakage and joining of spx). Archivado desde el original ([Link]
deoxyribonucleic acid, I. Repair of single- [Link]/publications/apsnetfeatures/P
strand breaks in DNA by an enzyme ages/[Link]) el 19 de octubre
system from Escherichia coli infected with de 2012. Consultado el 14 de enero de
T4 bacteriophage» ([Link] 2011.
[Link]/pmc/articles/PMC224649).
Proceedings of the National Academy of 10. «Ti plasmid vector for the introduction of
Sciences of the United States of America DNA into plant cells without alteration of
57 (4): 1021-8. April 1967. their normal regeneration capacity» (https://
Bibcode:1967PNAS...57.1021W ([Link]
[Link]/pmc/articles/PMC55
[Link]/abs/1967PNAS...57.1021W). PMC 224649
5426). The EMBO Journal 2 (12): 2143-50.
 1983. PMC 555426 ([Link] HVkTgC). Cambridge University Press. 29
pmc/articles/PMC555426). PMID 16453482 (https:// de mayo de 2008. ISBN 978-1-139-47178-7.
[Link]/pubmed/16453482). 19. Michels, Corinne A. (10 de junio de 2002).
doi:10.1002/j.1460-2075.1983.tb01715.x ([Link] Genetic Techniques for Biological
[Link]/10.1002%2Fj.1460-2075.1983.tb01715.x). Research: A Case Study Approach (https://
11. «Rediscovering Biology - Online Textbook: [Link]/books?id=PfJviR3cCtYC
Unit 13 Genetically Modified Organisms» (h &pg=PA85). John Wiley & Sons. pp. 85-88.
ttps://[Link]/web/2019120312355 ISBN 978-0-471-89919-8.
9/[Link] 20. «8» ([Link]
xtbook/gmo/gmo_2.html). [Link]. BK26837/). Isolating, Cloning, and
Archivado desde el original ([Link] Sequencing DNA (4th edición). New York:
[Link]/courses/biology/textbook/gmo/gm Garland Science. 2002.
o_2.html) el 3 de diciembre de 2019. 21. Kaufman RI, Nixon BT (Julio de 1996).
Consultado el 18 de agosto de 2017. «Use of PCR to isolate genes encoding
12. Alberts, Bruce; Johnson, Alexander; Lewis, sigma54-dependent activators from diverse
Julian; Raff, Martin; Roberts, Keith; Walter, bacteria» ([Link]
Peter (2002). «Studying Gene Expression c/articles/PMC232662). Journal of
and Function» ([Link] Bacteriology 178 (13): 3967-70. PMC 232662
v/books/NBK26818/). Molecular Biology of ([Link]
the Cell. New York: Garland Science. 662). PMID 8682806 ([Link]
13. Griffiths, Anthony JF; Miller, Jeffrey H.; pubmed/8682806). doi:10.1128/jb.178.13.3967-
Suzuki, David T.; Lewontin, Richard C.; 3970.1996 ([Link]
Gelbart, William M (2000). «Mutant types» 3967-3970.1996).
([Link] 22. Liang J, Luo Y, Zhao H (2011). «Synthetic
011/). An Introduction to Genetic Analysis biology: putting synthesis into biology» (htt
(7th edición). ps://[Link]/pmc/articles/PM
14. Koh, Hee-Jong; Kwon, Suk-Yoon; C3057768). Wiley Interdisciplinary
Thomson, Michael (26 de agosto de 2015). Reviews: Systems Biology and Medicine 3
Current Technologies in Plant Molecular (1): 7-20. PMC 3057768 ([Link]
Breeding: A Guide Book of Plant Molecular gov/pmc/articles/PMC3057768). PMID 21064036 (h
Breeding for Researchers ([Link] ttps://[Link]/pubmed/21064036).
[Link]/books?id=jWJ1CgAAQBAJ&pg= doi:10.1002/wsbm.104 ([Link]
PA242). Springer. p. 242. 2Fwsbm.104).
ISBN 9789401799966. 23. «GeneArt Gene Synthesis» ([Link]
15. «Bacillus thuringiensis as a specific, safe, [Link]/tw/en/home/life-science/clo
and effective tool for insect pest control». ning/gene-synthesis/geneart-gene-synthesi
Journal of Microbiology and Biotechnology [Link]). [Link]. Consultado
17 (4): 547-59. abril de 2007. PMID 18051264 el 9 de noviembre de 2017.
([Link] 24. «Personal reflections on the origins and
16. Adler J (May 2011). «The growing menace emergence of recombinant DNA
from superweeds». Scientific American 304 technology» ([Link]
(5): 74-9. Bibcode:2011SciAm.304e..74A ([Link] pmc/articles/PMC2815933). Genetics 184
[Link]/abs/2011SciAm.304e..74A). (1): 9-17. January 2010. PMC 2815933 (https://
PMID 21595408 ([Link] [Link]/pmc/articles/PMC2815933).
med/21595408). PMID 20061565 ([Link]
doi:10.1038/scientificamerican0511-74 ([Link] med/20061565). doi:10.1534/genetics.109.112144
[Link]/10.1038%2Fscientificamerican0511-74). ([Link]
17. Food and Agricultural Organisation of the 4).
United Nations. «The process of genetic 25. «Viral and nonviral delivery systems for
modification» ([Link] gene delivery» ([Link]
6/y4955e/[Link]). v/pmc/articles/PMC3507026). Advanced
18. An Introduction to Genetic Engineering (htt Biomedical Research 1: 27. 6 de julio de
ps://[Link]/books?id=g1v6WM 2012. PMC 3507026 ([Link]
v/pmc/articles/PMC3507026). PMID 23210086 (http
 s://[Link]/pubmed/23210086). [Link]/pmc/articles/PMC555427).
doi:10.4103/2277-9175.98152 ([Link] PMID 16453483 ([Link]
4103%2F2277-9175.98152). med/16453483). doi:10.1002/j.1460-
26. «DNA uptake during bacterial 2075.1983.tb01716.x ([Link]
transformation». Nature Reviews. Fj.1460-2075.1983.tb01716.x).
Microbiology 2 (3): 241-9. Marzo de 2004. 32. Thomson JA. «Genetic Engineering of
PMID 15083159 ([Link] Plants» ([Link]
med/15083159). doi:10.1038/nrmicro844 ([Link] ers/c17/[Link]). Biotechnology 3.
[Link]/10.1038%2Fnrmicro844). Consultado el 17 de julio de 2016.
27. National Research Council (US) Committee 33. «Efficient agroinfiltration of plants for high-
on Identifying and Assessing Unintended level transient expression of recombinant
Effects of Genetically Engineered Foods on proteins» ([Link]
Human Health (1 de enero de 2004). c/articles/PMC3846102). Journal of
Methods and Mechanisms for Genetic Visualized Experiments 77 (77). July 2013.
Manipulation of Plants, Animals, and PMC 3846102 ([Link]
Microorganisms ([Link] ticles/PMC3846102). PMID 23913006 ([Link]
ov/books/NBK215771/). National [Link]/pubmed/23913006).
Academies Press (US). doi:10.3791/50521 ([Link]
28. «Agrobacterium-mediated plant 0521).
transformation: the biology behind the 34. Head, Graham; Hull, Roger H; Tzotzos,
"gene-jockeying" tool» ([Link] George T. (2009). Genetically Modified
etails/sim_microbiology-and-molecular-biol Plants: Assessing Safety and Managing
ogy-reviews_2003-03_67_1/page/16). Risk ([Link]
Microbiology and Molecular Biology modif00hull). London: Academic Pr. p. 244
Reviews 67 (1): 16-37, tabla de contenidos. ([Link]
Marzo de 2003. PMC 150518 ([Link] 00hull/page/n254). ISBN 978-0-12-374106-6.
[Link]/pmc/articles/PMC150518). 35. Alberts, Bruce; Johnson, Alexander; Lewis,
PMID 12626681 ([Link] Julian; Raff, Martin; Roberts, Keith; Walter,
med/12626681). doi:10.1128/MMBR.67.1.16- Peter (2002). Molecular Biology of the Cell
37.2003 ([Link] ([Link]
16-37.2003). 052/). New York: Garland Science. p. G:35.
29. «Identification of Arabidopsis thaliana ISBN 978-0-8153-4072-0.
transformants without selection reveals a 36. Kamimura K, Suda T, Zhang G, Liu D
high occurrence of silenced T-DNA (Octubre de 2011). «Advances in Gene
integrations». The Plant Journal 41 (3): Delivery Systems» ([Link]
464-77. Febrero de 2005. PMID 15659104 (htt [Link]/pmc/articles/PMC3245684).
ps://[Link]/pubmed/15659104). Pharmaceutical Medicine 25 (5): 293-306.
doi:10.1111/j.1365-313x.2004.02312.x ([Link] PMC 3245684 ([Link]
[Link]/10.1111%2Fj.1365-313x.2004.02312.x). ticles/PMC3245684). PMID 22200988 ([Link]
30. Schell J, Van Montagu M (1977). «The Ti- [Link]/pubmed/22200988).
Plasmid of Agrobacterium Tumefaciens, A doi:10.1007/bf03256872 ([Link]
Natural Vector for the Introduction of NIF 7%2Fbf03256872).
Genes in Plants?». Genetic Engineering for 37. Pack DW, Hoffman AS, Pun S, Stayton PS
Nitrogen Fixation. Basic Life Sciences 9. (Julio de 2005). «Design and development
pp. 159-79. ISBN 978-1-4684-0882-9. of polymers for gene delivery». Nature
PMID 336023 ([Link] Reviews. Drug Discovery 4 (7): 581-93.
d/336023). doi:10.1007/978-1-4684-0880-5_12 (http PMID 16052241 ([Link]
s://[Link]/10.1007%2F978-1-4684-0880-5_12). med/16052241). S2CID 20972049 ([Link]
31. Joos H, Timmerman B, Montagu MV, Schell [Link]/CorpusID:20972049).
J (1983). «Genetic analysis of transfer and doi:10.1038/nrd1775 ([Link]
stabilization of Agrobacterium DNA in plant nrd1775).
cells» ([Link] 38. «Lecture 8 genetic engineering of animal
ticles/PMC555427). The EMBO Journal 2 cells» ([Link]
(12): 2151-60. PMC 555427 ([Link] santos/lecture-8-genetic-engineering-of-ani
 mal-cells). [Link]. 25 de enero analytical methods». Gene Therapy. 12
de 2012. Consultado el 18 de julio de 2018. Suppl 1 (S1): S131-8. PMID 16231045 (https://
39. [Link]. «Gene transfer [Link]/pubmed/16231045).
(transfection) methods in animals | Genetic doi:10.1038/[Link].3302627 ([Link]
Engineering and Biotechnology Gene 8%[Link].3302627).
Transfer Methods and Transgenic 46. Narayanaswamy S (1994). Plant Cell and
Organisms | Genetics, Biotechnology, Tissue Culture ([Link]
Molecular Biology, Botany | ooks?id=-M4lR-pxqJMC). Tata McGraw-Hill
[Link]» ([Link] Education. pp. vi. ISBN 9780074602775.
com/index/genetics/genetic_engineering_a 47. Walter, Peter; Roberts, Keith; Raff, Martin;
nd_biotechnology_gene_transfer_methods Lewis, Julian; Johnson, Alexander; Alberts,
_and_transgenic_organisms/gene_transfer Bruce (2002). «Studying Gene Expression
_transfection_methods_in_animals.php). and Function» ([Link]
[Link]. Consultado el 18 de v/books/NBK26818/). Molecular Biology of
julio de 2018. the Cell. 4th Edition.
40. Kim, Tae Kyung; Eberwine, James H. 48. «Elimination of selection markers from
(Agosto de 2010). «Mammalian cell transgenic plants». Current Opinion in
transfection: the present and the future» (ht Biotechnology 12 (2): 139-43. Abril de
tps://[Link]/pmc/articles/PM 2001. PMID 11287227 ([Link]
C2911531). Analytical and Bioanalytical ov/pubmed/11287227). doi:10.1016/S0958-
Chemistry 397 (8): 3173-3178. ISSN 1618- 1669(00)00188-9 ([Link]
2642 ([Link] 958-1669%2800%2900188-9).
2). PMC 2911531 ([Link]
49. Setlow, Jane K. (31 de octubre de 2002).
c/articles/PMC2911531). PMID 20549496 ([Link]
Genetic Engineering: Principles and
[Link]/pubmed/20549496).
Methods ([Link]
doi:10.1007/s00216-010-3821-6 ([Link]
d=aGkXFmqOcyIC&q=Genetic+Engineerin
0.1007%2Fs00216-010-3821-6).
g+analysis+of+DNA+PCR+Southern+sequ
41. Mullin, Ann. «Pronuclear Injection» (https:// encing). Springer Science & Business
[Link]/web/20160809113156/htt Media. p. 109. ISBN 9780306472800.
p://[Link]/sse/tgmouse/pronucle 50. Deepak S, Kottapalli K, Rakwal R, Oros G,
[Link]). Tulane University. Archivado desde Rangappa K, Iwahashi H, Masuo Y,
el original ([Link] Agrawal G (June 2007). «Real-Time PCR:
[Link]) el 9 de agosto de 2016. Revolutionizing Detection and Expression
Consultado el 13 de diciembre de 2022.
Analysis of Genes» ([Link]
42. «Embryonic Stem Cell-Mediated Gene [Link]/pmc/articles/PMC2430684). Current
Transfer - transgenicanimals» ([Link] Genomics 8 (4): 234-51. PMC 2430684 (http
[Link]/site/transgenicanimalscom/con s://[Link]/pmc/articles/PMC243068
tact-me/embryonic-stem-cell-mediated-gen 4). PMID 18645596 ([Link]
e-transfer). [Link]. Consultado el ubmed/18645596).
19 de julio de 2018. doi:10.2174/138920207781386960 ([Link]
43. MeSH: Genetic Transduction, Genetic (http g/10.2174%2F138920207781386960).
s://[Link]/cgi/mesh/2012/MB_cg 51. Lodish H, Berk A, Zipursky SL, Matsudaira
i?mode=&term=Transduction,) (en inglés) P, Baltimore D, Darnell J (2000). «Chapter
44. «Stemcells Redirection» ([Link] 8.5: Gene Replacement and Transgenic
[Link]/web/20170120081316/[Link] Animals: DNA Is Transferred into
[Link]/info/Regenerative_Medicine/Pag Eukaryotic Cells in Various Ways» ([Link]
es/[Link]). [Link]. [Link]/details/molecularcellbio00lodi).
Archivado desde el original ([Link] Molecular Cell Biology (4th edición). W. H.
[Link]/info/Regenerative_Medicine/page Freeman and Company. ISBN 978-0-7167-
s/[Link]) el 20 de enero de 3136-8. (requiere registro).
2017. Consultado el 13 de diciembre de 52. Rocha-Martins, Maurício; Cavalheiro,
2022. Gabriel R.; Matos-Rodrigues, Gabriel E.;
45. Tuomela M, Stanescu I, Krohn K (Octubre Martins, Rodrigo a. P.; Rocha-Martins,
de 2005). «Validation overview of bio- Maurício; Cavalheiro, Gabriel R.; Matos-
 Rodrigues, Gabriel E.; Martins, Rodrigo a. med/19404259). doi:10.1038/nature07992 ([Link]
P. (Agosto de 2015). «From Gene Targeting [Link]/10.1038%2Fnature07992).
to Genome Editing: Transgenic animals 58. «Targeting DNA double-strand breaks with
applications and beyond». Anais da TAL effector nucleases» ([Link]
Academia Brasileira de Ciências 87 (2): [Link]/pmc/articles/PMC2942870).
1323-1348. ISSN 0001-3765 ([Link] Genetics 186 (2): 757-61. Octubre de
g/resource/issn/0001-3765). PMID 26397828 (http 2010. PMC 2942870 ([Link]
s://[Link]/pubmed/26397828). v/pmc/articles/PMC2942870). PMID 20660643 (http
doi:10.1590/0001-3765201520140710 ([Link] s://[Link]/pubmed/20660643).
[Link]/10.1590%2F0001-3765201520140710). doi:10.1534/genetics.110.120717 ([Link]
53. «Genome engineering with zinc-finger 10.1534%2Fgenetics.110.120717).
nucleases» ([Link] 59. «TAL nucleases (TALNs): hybrid proteins
mc/articles/PMC3176093). Genetics 188 composed of TAL effectors and FokI DNA-
(4): 773-82. Agosto de 2011. PMC 3176093 (h cleavage domain» ([Link]
ttps://[Link]/pmc/articles/PMC31760 [Link]/pmc/articles/PMC3017587). Nucleic
93). PMID 21828278 ([Link] Acids Research 39 (1): 359-72. Enero de
pubmed/21828278). 2011. PMC 3017587 ([Link]
doi:10.1534/genetics.111.131433 ([Link] v/pmc/articles/PMC3017587). PMID 20699274 (http
10.1534%2Fgenetics.111.131433). s://[Link]/pubmed/20699274).
54. «Efficient targeting of a SCID gene by an doi:10.1093/nar/gkq704 ([Link]
engineered single-chain homing 3%2Fnar%2Fgkq704).
endonuclease» ([Link] 60. «Genome-scale engineering for systems
ov/pmc/articles/PMC2760784). Nucleic and synthetic biology» ([Link]
Acids Research 37 (16): 5405-19. [Link]/pmc/articles/PMC3564264).
Septiembre de 2009. PMC 2760784 ([Link] Molecular Systems Biology 9: 641. 2013.
[Link]/pmc/articles/PMC2760784). PMC 3564264 ([Link]
PMID 19584299 ([Link] ticles/PMC3564264). PMID 23340847 ([Link]
med/19584299). doi:10.1093/nar/gkp548 ([Link] [Link]/pubmed/23340847).
[Link]/10.1093%2Fnar%2Fgkp548). doi:10.1038/msb.2012.66 ([Link]
55. «Heritable targeted mutagenesis in maize 8%2Fmsb.2012.66).
using a designed endonuclease». The 61. «Precision editing of large animal
Plant Journal 61 (1): 176-87. Enero de genomes». Advances in Genetics Volume
2010. PMID 19811621 ([Link] 80. Advances in Genetics 80. 2012. pp. 37-
ov/pubmed/19811621). doi:10.1111/j.1365- 97. ISBN 9780124047426. PMID 23084873 (http
313X.2009.04041.x ([Link] s://[Link]/pubmed/23084873).
1365-313X.2009.04041.x). doi:10.1016/B978-0-12-404742-6.00002-8 ([Link]
56. «High-frequency modification of plant [Link]/10.1016%2FB978-0-12-404742-6.00002-
genes using engineered zinc-finger 8).
nucleases» ([Link] 62. Malzahn, Aimee; Lowder, Levi; Qi, Yiping
mc/articles/PMC2743854). Nature 459 (2017). «Plant genome editing with TALEN
(7245): 442-5. May 2009. and CRISPR» ([Link]
Bibcode:2009Natur.459..442T ([Link] v/pmc/articles/PMC5404292). Cell &
[Link]/abs/2009Natur.459..442T). PMC 2743854 (htt Bioscience 7: 21. PMC 5404292 ([Link]
ps://[Link]/pmc/articles/PMC274385 [Link]/pmc/articles/PMC5404292).
4). PMID 19404258 ([Link] PMID 28451378 ([Link]
ubmed/19404258). doi:10.1038/nature07845 (http med/28451378). doi:10.1186/s13578-017-0148-4 (h
s://[Link]/10.1038%2Fnature07845). ttps://[Link]/10.1186%2Fs13578-017-0148-4).
57. «Precise genome modification in the crop 63. Boissel S, Jarjour J, Astrakhan A, Adey A,
species Zea mays using zinc-finger Gouble A, Duchateau P, Shendure J,
nucleases». Nature 459 (7245): 437-41. Stoddard BL, Certo MT, Baker D,
May 2009. Bibcode:2009Natur.459..437S ([Link] Scharenberg AM (February 2014).
[Link]/abs/2009Natur.459..437S). «megaTALs: a rare-cleaving nuclease
PMID 19404259 ([Link] architecture for therapeutic genome
engineering» ([Link]
 pmc/articles/PMC3936731). Nucleic Acids «Targeting DNA Double-Strand Breaks with
Research 42 (4): 2591-601. PMC 3936731 (htt TAL Effector Nucleases» ([Link]
ps://[Link]/pmc/articles/PMC393673 [Link]/pmc/articles/PMC2942870).
1). PMID 24285304 ([Link] Genetics 186 (2): 757-761. PMC 2942870 (htt
ubmed/24285304). doi:10.1093/nar/gkt1224 (https:// ps://[Link]/pmc/articles/PMC294287
[Link]/10.1093%2Fnar%2Fgkt1224). 0). PMID 20660643 ([Link]
64. Choulika, A.; Perrin, A.; Dujon, B.; Nicolas, ubmed/20660643).
J. F. (1994). «The yeast I-Sce I doi:10.1534/genetics.110.120717 ([Link]
meganuclease induces site-directed 10.1534%2Fgenetics.110.120717).
chromosomal recombination in mammalian 68. Cyranoski, D. (2019). «What's next for
cells». Comptes Rendus de l'Académie des CRISPR babies?». Nature 566 (7745):
Sciences, Série III 317 (11): 1013-9. 440-442. PMID 30809070 ([Link]
PMID 7882137 ([Link] [Link]/pubmed/30809070). doi:10.1038/d41586-
ed/7882137). 019-00673-1 ([Link]
65. «Meganucleases and other tools for -019-00673-1).
targeted genome engineering: perspectives 69. Rees, H.; Liu, D. R. (2018). «Base editing:
and challenges for gene therapy» ([Link] precision chemistry on the genome and
[Link]/pmc/articles/PMC3267 transcriptome of living cells.» ([Link]
165). Current Gene Therapy 11 (1): 11-27. [Link]/pmc/articles/PMC653518
February 2011. PMC 3267165 ([Link] 1). Nature Reviews Genetics 19 (12): 770-
[Link]/pmc/articles/PMC3267165). 788. PMC 6535181 ([Link]
PMID 21182466 ([Link] mc/articles/PMC6535181). PMID 30323312 (https://
med/21182466). doi:10.2174/156652311794520111 [Link]/pubmed/30323312).
([Link] doi:10.1038/s41576-018-0059-1 ([Link]
1). 0.1038%2Fs41576-018-0059-1).
66. Silva GH, Belfort M, Wende W, Pingoud A 70. Anzalone, A. V.; Randolph, P.B.; Davis, J.
(Agosto de 2006). «From monomeric to R. (2019). «Search-and-replace genome
homodimeric endonucleases and back: editing without double strand breaks or
engineering novel specificity of donor DNA.» ([Link]
LAGLIDADG enzymes». Journal of pmc/articles/PMC6907074). Nature 576
Molecular Biology 361 (4): 744-54. (7785): 149-157. Bibcode:2019Natur.576..149A
PMID 16872628 ([Link] ([Link]
med/16872628). doi:10.1016/[Link].2006.06.063 (htt A). PMC 6907074 ([Link]
ps://[Link]/10.1016%[Link].2006.06.063). c/articles/PMC6907074). PMID 31634902 ([Link]
67. Christian, M.; Cermak, T.; Doyle, E. L.; [Link]/pubmed/31634902).
Schmidt, C.; Zhang, F.; Hummel, A.; doi:10.1038/s41586-019-1711-4 ([Link]
Bogdanove, A. J.; Voytas, D. F. (2010). 0.1038%2Fs41586-019-1711-4).

Enlaces externos
Esta obra contiene una traducción derivada de «Genetic engineering techniques» de
Wikipedia en inglés, concretamente de esta versión ([Link]
ngineering_techniques?oldid=1087394963), publicada por sus editores ([Link]
org/wiki/Genetic_engineering_techniques?action=history) bajo la Licencia de
documentación libre de GNU y la Licencia Creative Commons Atribución-CompartirIgual 4.0
Internacional ([Link]

Obtenido de «[Link]