PRACTICA 4: DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA
BRUTA
4.1. Definiciones
Proteínas
Proteína es un término en el cual se involucra a un gran grupo de sustancias con
estructuras semejantes, mas, con funciones fisiológicas muy diferentes. Basado en el hecho de
que las proteínas tienen porcentaje de Nitrógeno casi constante, alrededor de 16%, lo que se
hace es determinar el nitrógeno y a través de un factor de conversión, transformar el resultado
en un valor al cual denominamos “proteína bruta”.
En el método de Kjeldahl, se determina el N contenido en la materia orgánica,
incluyendo el N proteico propiamente dicho y otros compuestos nitrogenados no proteicos
tales como: amidas, aminas, lecitinas, nitrilas y aminoácidos. Por tal razón el resultado se da
como proteína bruta.
Todas las proteínas están formadas por unidades simples llamadas aminoácidos, que a
su vez están constituidas por los elementos:
Carbono 50 – 55%
Oxigeno 20 – 23%
Hidrógeno 6 – 8 %
Nitrógeno 15 – 18%
Azufre 0 – 4 % (Sólo los aminoácidos azufrados)
4.2. Determinación de proteína bruta
Método semimicro kjeldahl
Principio
Por acción del ácido sulfúrico concentrado y caliente, se destruye la materia
orgánica quedando el nitrógeno convertido en sulfato de amonio, el cual es liberado en la
destilación como amoniaco y capturado como borato de amonio, finalmente el nitrógeno es
cuantificado por titulación con ácido clorhídrico. El método asume que todo el nitrógeno de la
muestra está en forma de proteína.
El proceso comprende tres fases: Digestión, Destilación y Titulación.
a. Digestión de la muestra
Por ebullición con H2SO4 concentrado y en presencia de catalizadores, la materia
orgánica se oxida a CO2 y agua, mientras que una parte del ácido se reduce a SO 2. Los
compuestos hidroxilados y carboxilados resultantes son detenidos por el H 2SO4, así el NH3
resultante es transformado a sulfato de amonio. Se utiliza un equipo digestor de nitrógeno.
M.O. + H2SO4 = CO2 + 2H2O + NH3
2NH3 + H2SO4 = SO4(NH4)2
El CO2 formado y el azufre excedente se desprenden en forma de gases al
combinarse con el oxígeno, formando moléculas de SO4 y SO3.
b. Destilación
El nitrógeno que está en forma de sulfato de amonio, se ataca con
un álcali fuerte (NaOH) para liberar amoniaco, al destilarlo el vapor de agua
arrastra el amoniaco que se recibe en beaker que contiene ácido bórico con
indicador (rojo de metilo y verde de bromocresol). Se forma entonces, el
borato de amonio.
SO4(NH4)2 + 2NaOH = SO4Na2 + 2NH3 + 2H2O
H3BO3 + 3NH3 (NH4)3BO3
c. Titulación
Se hace con ácido clorhídrico de normalidad conocida. El ácido clorhídrico reacciona
con el borato de amonio y un pequeño exceso de ácido clorhídrico provocará un cambio de pH
y el consiguiente viraje de color del indicador.
(NH4)3BO3 + HCl H3BO3 + NH4Cl
Equipos reactivos y materiales.
Ácido Sulfúrico concentrado
Catalizador (sulfato de potasio 15 g + sulfato de cobre 1 g)
Ácido Bórico + Indicador de pH (rojo de metilo y verde de bromocresol)
Ácido Clorhídrico, 0.1 N
Hidróxido de sodio al 40 %
Balones o tubos de digestión
Beaker de 50 ó 100 mL
Equipo de digestión de Kjeldahl
Equipo de destilación de Kjeldahl
Bureta de 50 ó 100 mL
Procedimiento:
1. Pesar 0.2 a 0.3 g de muestra y colocarlo en el tubo de digestión.
2. Agregar 1.5 g de catalizador para acelerar la reacción.
3. Agregar 3.5 mL de H2SO4 concentrado.
4. Colocar el tubo con la muestra en el equipo de digestión, e iniciar la digestión.
5. Aumentar la temperatura de acuerdo a la programación establecida en el equipo. El
tiempo total de digestión será aproximadamente de dos horas.
6. La digestión termina cuando el contenido del balón es totalmente cristalino.
7. Dejar enfriar las muestras digeridas evitando contaminación.
8. Diluir la muestra digerida con agua destilada y colocarla en el equipo de destilación.
9. Colocar un beaker conteniendo 10 mL de mezcla de ácido bórico con indicador de pH
en la salida del destilador para recibir el destilado.
10. Agregar Hidróxido de sodio al 40% sobre la muestra digerida y diluida. La cantidad es
establecida por el equipo automático (aproximadamente 25 mL).
11. Verificar que el vapor realice la destilación y arrastre al amoniaco hacia el beaker que
contiene ácido bórico más indicador. Este proceso se evidencia cuando el ácido
bórico de color violáceo cambia a color verde. La destilación culmina cuando el
volumen de ácido bórico aumenta para aproximadamente 30 mL.
12. Titular con HCl 0.1N y anotar el gasto. Cuando se tiene referencia que la muestra
tiene poco nitrógeno, titular con HCl 0.01N.
Preparación de la solución de ácido bórico al 4 % con indicador de pH
1. Pesar 40 g de ácido bórico, colocarlo en una fiola de 1 L y diluir con 800 mL de
agua destilada. Calentar la mezcla para lograr disolución completa.
2. Agregar 20 mL de verde de bromocresol al 1 %.
3. Adicionar 8 mL de rojo de metilo al 0.1 %.
4. Enrasar la fiola con agua destilada a volumen de 1 L.
Cálculos:
1. Cálculo del nitrógeno:
En equilibrio : 1 meq de HCl = 1 meq de N meq: miliequivalente
V: volumen de HCl gastado
Concentración : 1 meq de HCl = V x N
(mL)
(Normalidad) = mL de HCl x N
N: normalidad
N (mg): concentración de N
Cantidad de N (mg) = meq de N x PM
(mg)
nitrógeno : N (mg) = mL de HCl x N x 14
PM : peso molecular del N
mL de HCl x N x 14 x 100 mL de HCl x N x 0.0 14 x 100
N (%) = = N (%) =
peso de muestra(mg) peso de muestra( g)
2. Cálculo de la proteína bruta (PB): PB ( % ) =% de N∗6.25
Factor: 100 de proteína……..……. 16 de N
X ……………………………….. 1 de N
Factor 6.25 : promedio del N en las proteínas
% de N Factor % de N Factor
Alimento en la Específico Alimento en la Específico
proteína proteína
Afrecho de trigo 15.8 6.31 Torta de algodón 18.9 5.30
Trigo, grano completo 17.2 5.83 Huevos y carne 16.0 6.25
Maíz, grano 16.0 6.25 Soya 17.5 5.71
Avena y cebada 17.2 5.83 Oleaginosas 18.9 5.30
Arroz pilado 16.8 5.95 Leche y subproductos 15.7 6.38
Gelatina 18.0 5.55
Registro de datos y Resultados:
Nombre / código de la Peso de Gasto de HCl
N (%) PB (%)
muestra muestra (g) (mL)
Datos bibliográficos de PB de la muestra y Discusión
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Conclusiones
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Bibliografía consultada
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