CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS
DE ALTA RESOLUCIÓN
Integrantes:
Julián Condado Rodriguez
Equipo 4 David Eduardo Osnaya Ledesma
Mariana Joselyne Linares Mendoza
Daniela Ortega González
20/02/2025
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA
RESOLUCIÓN (HPLC)
Método cromatografíco para la separación y
HPLC análisis de los componentes químicos de una
mezcla
Participan las fases Es uno de métodos más usados
móvil y estacionaría actualmente debido a que emplea
(inmiscibles entre sí) y técnicas que antes no estaban
la muestra de interés disponibles, como las cromatografías de
adsorción, partición, exclusión
molecular y afinidad.
Las principales fuerzas que
actúan en las moléculas son:
Las fuerzas de dispersión de London
Las interacciones dipolo
Las interacciones por puente de hidrógeno
Interacciones dieléctricas
Interacciones electroestáticas
Ventajas:
Alta precisión en sus resultados
No es destructiva, es decir, los compuestos separados
en la columna pueden ser recolectados.
Alta reproducibilidad en los análisis cuantitativos
ADSORCIÓN
CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN
En este tipo, la fase estacionaria es
un sólido y la móvil es líquido y
puede estar formada por un
solvente o una mezcla de ellos.
Algunos componentes de la
mezcla se retendrán con mayor
fuerza que otros para proceder a
separar los componentes de la
muestra.
La afinidad viene determinada por
fuerzas de tipo Van der Waals,
puentes de hidrógeno o
transferencia de carga
CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN EN COLUMNA (CC)
La fase estacionaria consiste en un sólido adsorbente empaquetado en
una columna de vidrio la fase estacionaria y de su afinidad por la fase
móvil.
La fase móvil (eluyente) en la parte superior de la columna y se
permite su paso a través de la fase estacionaria
CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN EN PLACA FINA
(TLC)
En la cromatografía en capa fina la fase estacionaria se deposita,
formando una capa delgada, sobre un material de soporte tal como
placas de vidrio o aluminio.
La fase móvil asciende a lo largo de la fase estacionaria por
capilaridad, produciéndose la separación de los componentes de la
muestra en base a su diferente distribución entre la fase móvil y la fase
estacionaria.
PARTICIÓN
¿En que consiste la cromatografía por
partición?
También llamado cromatografía de
reparto, se basa en la distribución
diferencial de un analito entre una fase
liquida móvil y una fase estacionaria
liquida inmovilizada sobre un soporte
sólido.
Características de la cromatografía de reparto
1. La fase estacionaria liquida esta retenida
sobre las partículas de relleno.
2. Una fase será polar y la otra apolar.
3. La separación se basa en la diferente
polaridad de los solutos.
4. Sirve para separar compuestos no polares
y polares sin carga
MECANISMO DE SEPARACION
La fase móvil empuja la
muestra a través de la
columna.
Finalmente, los analitos se
eluyen en orden según su
afinidad relativa por ambas
Cada compuesto se disuelve
fases.
en la fase móvil y entra en
contacto con la fase
estacionaria. Los analitos con mayor
solubilidad en la fase
estacionaria se retienen
más tiempo.
TIPOS DE HPLC DE PARTICION
Cromatografia en fase normal
Fase estacionaria: polar (generalmente gel de
sílice)
Fase móvil: no polar (hexano, cloroformo,
tolueno)
Mecanismo de separación:
Los compuestos polares interaccionan más con la
fase estacionaria y se retienen más.
Los compuestos no polares pasan rápidamente a
través de la columna y eluyen primero.
Cromatografia en fase inversa
Fase estacionaria: No polar (usualmente hidrocarburos o sílice modificada)
Fase móvil: polar (agua, metanol, acetonitrilo)
Mecanismo de separación:
Los compuestos hidrofóbicos se asocian con la fase estacionaria y se retienen más
tiempo.
Los compuestos más polares tienen menos interacción con la fase estacionaria y
eluyen más rápido.
APLICACIONES DEL HPLC DE
PARTICIÓN
Análisis de ingredientes activos en fármacos
(paracetamol, ibuprofeno).
Detección de impurezas y validación de pureza.
Estudios de estabilidad en productos
farmacéuticos.
INTERCAMBIO
IÓNICO
¿Qué es la cromatografía de intercambio iónico?
Método que permite la separación de moléculas
basada en sus propiedades de carga eléctrica
Fase estacionaria
Resinas intercambiadoras
Fase móvil
Buffers de diferente pH o
fuerza iónica
0,5-1 mm de diámetro
Fundamento
Las moléculas cargadas se adhieren a los
intercambiadores de forma reversible de
modo que dichas moléculas pueden ser
asociadas o disociadas cambiando el
ambiente iónico.
Intercambiadores aniónicos
Portadores de grupos con cargas positivas que unen
aniones de forma reversible.
Intercambiadores más
comunes
Débilmente básicos
Grupos aminos
alifáticos o
aromáticos.
Resina de amonio
cuaternario
Intercambiadores Catiónicos
Portadores de grupos con carga negativa que unen
cationes de modo reversible.
Intercambiadores más
comunes
Ácidos fuertes
Grupo sulfónico (SO3H)
Ácidos débiles
Grupos carbonilo y
fenólicos
Resina de
metilsulfato
1 Equilibrio de la fase estacionaria
Procedimiento 2 Aplicación y lavado
Esta técnica está
3 Elución
basada en 4 etapas
4 Regeneración
Se buscan las condiciones iniciales deseadas.
El pH y la fuerza iónica del tampón se seleccionan para
garantizar que cuando se carga la muestra, las moléculas
de interés se adhieren al medio y no se unan tantas
impurezas.
Cuando el equilibrio se ha logrado, toda la fase estacionaria
se encuentra asociada a iones complementarios, como
cloruro o sodio.
Determinación del punto
Para una Ejemplo:
isoeléctrico
separación óptima, Proteína con pI= 7.0 utilizando
1. Identificar los grupos
una resina de intercambio
funcionales ionizables el pH del buffer catiónico
2. Determinar los valores de
debe estar al menos pH del buffer < 6.0. Asegurar
pKa de cada grupo funcional
3. Calcular el pI: Es el promedio a una unidad de pH que la proteína tenga una
carga neta positiva y se una a
de los valores de pKa de los dos por encima o por la resina cargada
grupos funcionales que
debajo del pI de la negativamente.
contribuyen más a la carga neta
de la molécula. muestra.
Con un buffer (mismo
Se introduce la
usado en la fase móvil
muestra, que
inicial), se lava la
contiene los
columna después de la
analitos que se
aplicación de la
van a separar,
muestra, esto elimina
en la columna
las moléculas que no
para que
se unieron a la resina y
interactuen
cualquier
con la fase
contaminante
estacionaria
presente en la muestra
Se utiliza una solución
de alta concentración de NaCl
sal o un cambio de pH KCl
para eliminar los NH4Cl
analitos unidos a la HCl
resina y regenerar la H2SO4
fase estacionaria para
un nuevo ciclo de
separación
EXCLUSIÓN
Cromatografía de
exclusión molecular/ por
tamaño
Este tipo de cromatografía conocida
también como cromatografía de
Permeación o de Filtración, efectúa
la separación de acuerdo con el
tamaño de las moléculas.
Las columnas se rellenan de un gel, cuyos poros son de
tamaño similar al tamaño de las moléculas de la muestra.
Las moléculas pequeñas pueden penetrar dichos poros y
quedan retenidas, en tanto que las grandes no lo hacen.
Las moléculas más
pequeñas pasan más
tiempo en los poros y Las moléculas más
tardan más en eluirse. grandes pasan menos
tiempo en los poros y
eluyen antes
Utilizado para la separación
de: Proteínas, ácidos
nucleicos, polisacáridos,
virus, etc.
CLASIFICACIÓN
CROMATOGRAFÍA DE CROMATOGRAFÍA DE
PERMEACIÓN EN GEL FILTRACIÓN EN GEL
Emplea fases móviles orgánicas Emplea fases móviles acuosas y
no polares. rellenos hidrofóbicos, materiales
Rellenos hidrofílicos y materiales de relleno blandos; incapaces de
de relleno semirígidos o rígidos resistir presiones mayores de 4
que pueden resistir presiones atm.
muy elevadas. Aplicación en el estudio de
Poliestirenos o silica porosa, biopolímeros.
vidrio poroso, que pueden
resistir presiones muy elevadas.
Los métodos son complementarios en el sentido que en un caso se
aplican a muestras solubles en agua, y en el otro a sustancias solubles
en disolventes orgánicos poco polares.
TAMAÑO DE PORO
A < tamaño de partícula del gel,
LÍMITE DE EXCLUSIÓN mayor es la resolución y más
Es el punto en el que las lento el flujo a través de la
moléculas son demasiado columna.
grandes para quedar atrapadas
en la fase estacionaria.
LÍMITE DE PERMEABILIDAD
Es el peso molecular por debajo del
cual las moléculas del soluto pueden
penetrar completamente en los poros.
VENTAJAS DESVENTAJAS
1. Tiempos de separación cortos y bien 1. Debido a que la escala de tiempos
definidos [todos los solutos salen de en el cromatograma es corta, sólo
la columna entre dos límites] se pueden acomodar un número
2. Bandas estrechas, que conducen a limitado de bandas.
una buena sensibilidad 2. No es aplicable a muestras de
3. No hay pérdida de muestra, porque componentes semejantes, como las
los solutos no interaccionan con la mezclas de isómeros.
fase estacionaria 3. Para una resolución aceptable se
4. No se desactiva la columna por necesita que la diferencia de pesos
interacción del soluto con el relleno. moleculares sea la menos de un
10%.
Además de ser un método de separación de mezclas...
Otra gran aplicación de la cromatografía de exclusión por
tamaños es a la determinación rápida de los pesos moleculares,
o de la distribución de pesos moleculares en los grandes
polímeros o en los productos naturales.
CROMATOGRAMA
El cromatograma se inicia en el momento en que la solución muestra es inyectada. Las señales encontradas
en el cromatograma pueden ser:
VOLUMEN MUERTO (V0)
El volumen muerto es el volumen de fase móvil
requerido para eluir un componente no retenido.
TIEMPO muerto (v0)
Es el tiempo del primer pico que aparece, no
perteneciente a ningún componente de la muestra.
TIEMPO DE RETENCIÓN (Tn)
Se define como el tiempo transcurrido entre la
inyección de la muestra y la aparición de la
respuesta máxima.
VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE
LA CROMATOGRAFÍA DE
LÍQUIDOS DE ALTA
RESOLUCIÓN
VENTAJAS DESVENTAJAS
Con esta técnica es usual obtener Instrumental costoso.
separaciones en el término de El personal que utilice esta técnica
minutos y hasta segundos. tendrá que tener experiencia como
Permite separar mezclas muy para poder obtener el mayor
complejas, por ejemplo muestras de provecho de la técnica instrumental.
fluidos biológicos, como la orina, La comparación de los tiempos de
plasma, etc. retención, como método de
Proporciona muy buena información identificación, no es confiable, por lo
de tipo cuantitativo. que será necesario emplear otras
técnicas, tales como Espectroscopia
de Masa, IR, o Resonancia Magnética
Nuclear para obtener identificaciones
más precisas.
Bibliografía
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PRINCIPIOS BÁSICOS DE LA CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTO RENDIMIENTO PARA LA SEPARACIÓN Y ANÁLISIS
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DarioQuintanilla. (2024, 18 marzo). Separaciones 12 HPLC SESION 8 2024( C EXCLUSION) (1).ppt [Diapositivas].
SlideShare. [Link]
1ppt/266853589#10
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