Laboratorio 06 – Secuenciación De Amplicones

Claudia Saavedra1 y Pamela Yévenes2

Universidad Andrés Bello, Viña del mar, Valparaíso, Chile

Palabras claves: Genómica,Metagenómica, Secuenciación, 16S, Amplicones.

1 Introducción

1.1 Genómica

La genómica es el estudio de todos los genes de una persona incluidas las interacciones
de esos genes entre sí y con el entorno de la persona (NIH,2019). La información
genética puede estar almacenada de forma como macromoléculas biológicas, como
ácidos nucleicos y como proteínas siendo esta información no solo el conductor del
funcionamiento de todo el organismos sino también quien impulsa el motor evolutivo.
La genómica tiene dos aspectos (estructural y funcional); La genómica estructural trata
de estudiar la estructura tridimensional de las proteínas codificadas por un genomas
necesitando el conocimiento de la secuencia del genoma; La genómica funcional estudia
las funciones y sus interacciones centrándose en procesos como la transcripción,
traducción, entre otros (Choudhuri, 2014)

1.2 Metagenómica

La metagenómica representa un nuevo enfoque dentro del análisis genómico, este

método nos permite acceder a la reserva de nuevos genes en el suelo. Para acceder a esta
reserva se extrae ADN de una muestra ambiental, se clona en un vector apropiado y se
transforma a células de Escherichia Coli, las transformantes resultantes se analizan
buscando nuevas características fisiológicas, metabólicas y genéticas. Los datos
metagenómicos permiten identificar microorganismos, virus o ADN libre que existe en
el medio natural mediante la identificación de genes o secuencias de ADN de los
organismos (sciencedirect, n.d.).
2
.

1.3 Secuenciación de ADN

La secuenciación del ADN es la técnica general de laboratorio para determinar la

secuencia exacta de nucleótidos en una molécula de ADN, establecer la secuencia de
ADN es importante para comprender la función de los genes y otras partes del genoma
(National Human Genome Research Institute, 2023). La secuenciación de nueva
generación (NGS) es uno de los diversos métodos de secuenciación de alto rendimiento
que permiten secuenciar miles de millones de fragmentos de ácidos nucleicos de manera
simultánea e independiente (Rose Lee, 2019). La NGS metagenómica es el análisis de
todos los ácidos nucleicos de una muestra la cual puede contener poblaciones mixtas de
microorganismos, y asignarlos a sus genomas de referencias ayudándonos a comprender
que microbios están presentes y en que proporciones (Rose Lee, 2019)

1.4 Secuenciación de ARNr 16S

La secuenciación del ARNr 16S es un método de secuenciación de amplicones que se

utiliza para identificar y comparar bacterias y hongos presentes en una muestra. La
secuenciación del ARNr 16S basada en la NGS es un método utilizado para comparar la
filogenia y taxonomía de muestras microbianas complejas. Dado que el gen procariota
16S ARNr tiene regiones variables estas se ocupan para la clasificación filogenética de
géneros o especies en diversas poblaciones microbianas (Illumina, n.d.).

1.5 Amplicones

Los amplicones son fragmentos de ADN o ARN que son la fuente de eventos o el
producto de amplificación o replicación formándose de manera natural por la
duplicación de genes (Amplicons and Amplicon Sequencing, 2019). La secuenciación de
amplicones es una NGS selectiva que lleva a cabo un análisis de la variación genética, la
identificación y caracterización de regiones genómicas específicas. Este método consiste
en amplificar por PCR la región de interés para luego realizar una secuenciación de
próxima generación (sciencedirect, n.d.).

2 Metodología

Para este estudio, se realizaron extracciones de muestras de suelo a diferentes

profundidades, abarcando tanto la capa superficial como la rizósfera, en condiciones
estériles para evitar contaminación. Las muestras fueron procesadas utilizando un kit de
extracción de ADN de Zymo Research, siguiendo las instrucciones del fabricante para
asegurar una recuperación eficiente del material genético. Posteriormente, se amplificó
el gen 16S rRNA mediante PCR, utilizando cebadores específicos y condiciones
optimizadas para obtener productos de PCR de alta calidad. Los productos amplificados
fueron secuenciados utilizando la tecnología Nanopore MinION, que permite obtener
lecturas largas y de alta resolución del ADN. Los archivos FastQ sin procesar fueron
cargados en la plataforma Galaxy para su análisis posterior. Se llevó a cabo un control de
calidad inicial utilizando FastQC, generando un informe general mediante MultiQC para
visualizar la calidad de las secuencias. Para eliminar secuencias de adaptadores que
pudieran interferir con el análisis, se utilizó Porechop, seguido de un filtrado de
secuencias con el programa fastp, asegurando que solo se conservaran lecturas de alta
calidad. Un segundo control de calidad se realizó con FastQC y MultiQC sobre las
secuencias filtradas. A continuación, las lecturas filtradas se ensamblaron de novo
utilizando MEGAHIT, lo que permitió reconstruir secuencias genómicas a partir de los
datos de secuenciación. La anotación funcional de los ensamblajes se llevó a cabo con
Prokka, proporcionando información sobre las funciones de los genes identificados. Para
la asignación taxonómica, se utilizó Kraken2, que clasifica las lecturas en función de
bases de datos de referencia. Finalmente, los resultados de la asignación taxonómica
fueron visualizados mediante Krona pie chart, facilitando la interpretación de la
diversidad microbiana presente en las muestras, y se realizó un análisis BLAST para
4
.

comparar las secuencias obtenidas con bases de datos de secuencias conocidas,

permitiendo determinar su identidad o similitud.

Imagen 1. Flujo de trabajo.

3 Resultados
La tabla presenta información sobre cuatro muestras, incluyendo el porcentaje de
duplicados (% Dups), que representa la proporción de reads duplicados en el conjunto de
datos secuenciados. También incluye el porcentaje de guanina y citosina (% GC), que
indica la cantidad de nucleótidos G y C en la secuencia de ADN. Finalmente, se muestra
el número de secuencias en millones (M Seqs), que es la cantidad total de reads en
millones.

Sample Name % Dups % GC M Seqs

bulk_bottom_fastq_g 9.3% 54% 0.0M

bulk_top_fastq_gz 11.2% 54% 0.0M

rhizosphere_bottom_f 8.3% 54% 0.0M

astq_gz

rhizosphere_top_fastq 7.6% 54% 0.0M

_gz

Tabla 1. Información general de las muestras.

6
.

En general, los porcentajes de duplicados están en un rango razonable, ya que menos del
12% de los reads son duplicados. Además, el contenido de GC es constante en todas las
muestras, con un 54%, lo que sugiere que provienen de la misma especie o de regiones
genómicas con un contenido de GC similar. Sin embargo, el valor en la columna de M
Seqs es 0.0M para todas las muestras, indicando que no se detectaron lecturas en ellas.
Esto puede deberse a que los datos de secuenciación no contienen un número
significativo de secuencias, lo que podría ser un error en la preparación de la tabla o en
los datos.

Se presenta un gráfico de conteo de secuencias de FastQC que muestra los resultados de

cuatro muestras: "Bulk Bottom", "Bulk Top", "Rhizosphere Bottom" y "Rhizosphere
Top". Los datos obtenidos indican que la muestra "Bulk Bottom" tiene aproximadamente
26,885 unique reads y 2,772 duplicate reads, mientras que la muestra "Bulk Top" cuenta
con 26,447 unique reads y 3,319 duplicate reads. Por otro lado, la muestra "Rhizosphere
Bottom" presenta 25,388 unique reads y 2,304 duplicate reads, y la "Rhizosphere Top"
tiene 25,592 unique reads y 2,100 duplicate reads.

Gráfico 1. Conteo de secuencias de FastQC .

Las muestras "Bulk Bottom" y "Bulk Top" presentan el mayor número total de reads,
con 29,657 y 29,766, respectivamente. Esto indica que estas condiciones o ubicaciones
han generado una mayor cantidad de datos de secuenciación en comparación con las
muestras de rhizosphere. Además, las muestras "Bulk Top" y "Bulk Bottom" muestran
un porcentaje relativamente alto de duplicate reads en comparación con las muestras de
rhizosphere, lo que puede ser un indicador de sobre-amplificación o problemas en la
preparación de la librería.

La cantidad de unique reads es bastante similar entre las muestras de rhizosphere,

sugiriendo que las condiciones ambientales o biológicas son relativamente consistentes.
Sin embargo, se observa una ligera disminución en el número de unique reads en
comparación con las muestras de bulk, lo que podría indicar una menor diversidad o
cantidad de material genético en las muestras de rhizosphere.

Se presenta un gráfico de histogramas de calidad de secuencias (Sequence Quality

Histograms) que muestra los resultados de las cuatro muestras en función de la posición
de la base (bp) en el eje x y el puntaje Phred en el eje y.

Gráfico 2. Histogramas de calidad de secuencias (Sequence Quality Histograms)

Entre las muestras analizadas, la muestra "Rhizosphere Top" presenta el valor más bajo,
con una base alcanzando un puntaje Phred de 4.29. Por otro lado, la muestra "Bulk
Bottom" muestra el valor más alto, con 6,600 bases y un puntaje Phred de 14.65.

Estos resultados sugieren que la calidad de las secuencias varía entre las muestras,
indicando que la muestra "Rhizosphere Top" podría estar presentando problemas de
calidad en sus lecturas, lo que podría afectar la fiabilidad de los análisis subsecuentes. En
contraste, la muestra "Bulk Bottom" tiene un puntaje de calidad superior, lo que sugiere
una mayor confiabilidad en las secuencias generadas y un mejor desempeño en el
proceso de secuenciación.
8
.

Se presenta un gráfico de puntajes de calidad por secuencia (Per Sequence Quality

Scores) que ilustra la cantidad de lecturas con puntajes de calidad promedio, donde el eje
x representa el puntaje Phred promedio de las secuencias y el eje y muestra el conteo de
lecturas.

En este gráfico, el pico más alto corresponde a la muestra "Bulk Bottom", que alcanza
un puntaje Phred de 12 con 11,465k lecturas. Todas las muestras comienzan con puntajes
en torno a 8, pero la muestra "Bulk Top" presenta el valor más bajo en este rango, con
solo 82 lecturas. En contraste, "Bulk Bottom" muestra un mejor desempeño en este
punto con 104 lecturas.

Al avanzar hacia puntajes más altos, se observa que en el puntaje Phred de 15, la muestra
"Rhizosphere Top" tiene el conteo más bajo con solo 13 lecturas, mientras que "Bulk
Top" se destaca con 21 lecturas.

Gráfico 3. Puntajes de calidad por secuencia (Per Sequence Quality Scores)

Estos resultados sugieren que, aunque "Bulk Bottom" tiene un rendimiento notablemente
superior en términos de calidad, las muestras de rhizosphere y bulk presentan una
distribución de calidad variable. La presencia de un número considerable de lecturas con
puntajes bajos en "Bulk Top" indica que un subconjunto de lecturas podría estar
comprometiendo la calidad general de los datos, lo que debe considerarse en el análisis
posterior.

Se presenta un gráfico de contenido de GC por secuencia (Per Sequence GC Content)

que muestra el contenido promedio de GC en las lecturas, donde el eje x representa el
porcentaje de GC y el eje e indica la cantidad de lecturas. Este gráfico revela dos picos
significativos en la distribución del contenido de GC.
Gráfico 4. Contenido de GC por secuencia (Per Sequence GC Content)

El primer pico más alto corresponde a la muestra "Bulk Bottom", que alcanza un
contenido de GC del 47% con un 7.96% de lecturas. En contraste, el segundo pico más
alto se observa en la muestra "Rhizosphere Bottom", con un contenido de GC del 55% y
un 12.57% de lecturas.

La presencia de estos dos picos sugiere que las muestras analizadas tienen distribuciones
de contenido de GC que se desvían de la típica distribución normal esperada en una
librería aleatoria. Esto puede indicar diferencias en la composición genética entre las
muestras, lo que podría reflejar variaciones en las fuentes de ADN o en las condiciones
ambientales de cada muestra. Estos hallazgos son relevantes para la interpretación de la
diversidad genética y la calidad de las secuencias obtenidas en el estudio.

Se presenta un gráfico de contenido de N por base (Per Base N Content) que muestra el
porcentaje de llamadas de bases en cada posición donde se ha registrado un "N". En este
análisis, las cuatro muestras analizadas presentan un porcentaje de 0% en el conteo de
"N" en todas las posiciones.

Este resultado indica que no se han realizado llamadas de bases inciertas (N) en las
secuencias de ninguna de las muestras, lo que sugiere una alta calidad en la llamada de
bases durante el proceso de secuenciación. La ausencia de "N" en las lecturas es un
indicador positivo, ya que implica que todas las posiciones de las secuencias han sido
asignadas con bases específicas, lo que contribuye a la confiabilidad de los datos
obtenidos y a la precisión de los análisis posteriores.

Gráfico 5. Contenido de N por base (Per Base N Content)

10
.

Se presenta un gráfico de distribución de longitudes de secuencia (Sequence Length

Distribution) que ilustra la distribución de tamaños de fragmentos (longitudes de
lecturas) encontradas. En este gráfico, el eje x representa la longitud de la secuencia en
pares de bases (bp), mientras que el eje e indica el conteo de lecturas.

Gráfico 6. Distribución de longitudes de secuencia (Sequence Length Distribution)

Se observan dos picos en la distribución. El primer pico más alto corresponde a la

muestra "Bulk Bottom", que presenta un valor máximo de 200 bp con 3,576 lecturas. Por
otro lado, el segundo pico más alto se encuentra en la muestra "Bulk Top", donde el
valor máximo es de 1,600 bp con un conteo de 19,169 lecturas.

Estos resultados indican que hay una variabilidad en las longitudes de las lecturas entre
las muestras analizadas. La presencia de un pico a 1,600 bp en "Bulk Top" sugiere que
esta muestra tiene una mayor proporción de lecturas más largas en comparación con
"Bulk Bottom", que tiene un pico más bajo. Esta información es crucial para entender la
calidad y la composición del ADN secuenciado, así como para considerar las
implicaciones que pueden tener en el análisis posterior de las secuencias.

Se presenta un gráfico de niveles de duplicación de secuencias (Sequence Duplication

Levels) que muestra el nivel relativo de duplicación encontrado para cada secuencia. En
este gráfico, el eje x representa el nivel de duplicación de secuencias, mientras que el eje
y indica el porcentaje de la biblioteca.
Gráfico 7. Niveles de duplicación de secuencias (Sequence Duplication Levels).
Los resultados muestran que, al iniciar en un nivel de duplicación de 1, la muestra
"Rhizosphere Top" tiene el porcentaje más alto, alcanzando un 89.76%, seguida de
"Rhizosphere Bottom" con un 88.93%, "Bulk Bottom" con un 87.95% y "Bulk Top" con
un 85.81%. A medida que se incrementa el nivel de duplicación a 2, los porcentajes
comienzan a descender, con "Bulk Top" en 3.45%, "Rhizosphere Top" en 3.16%,
"Rhizosphere Bottom" en 3.06% y "Bulk Bottom" en 3.05%.

Además, se observa un pico significativo en niveles de duplicación superiores a 10,

donde "Bulk Top" presenta un 3.26%, seguido de "Bulk Bottom" con un 3.00%,
"Rhizosphere Bottom" con un 2.80% y "Rhizosphere Top" con un 2.37%.

Estos datos indican que las muestras presentan variaciones en los niveles de duplicación,
lo que puede ser indicativo de la calidad de la librería y de la preparación del ADN. Un
porcentaje alto en el nivel de duplicación de 1 sugiere que la mayoría de las lecturas son
únicas, mientras que los incrementos en los niveles superiores podrían reflejar problemas
en la preparación de la librería o sobre-amplificación en las muestras. Este análisis es
fundamental para evaluar la calidad de los datos de secuenciación y su idoneidad para
estudios posteriores.

Se presenta un gráfico que muestra las secuencias sobrerrepresentadas por muestra

(Overrepresented sequences by sample), el cual ilustra la cantidad total de secuencias
sobrerrepresentadas encontradas en cada biblioteca.

Gráfico 8. Secuencias sobrerrepresentadas por muestra (Overrepresented sequences by

sample).
12
.

En el análisis, la muestra "Bulk Bottom" presenta un 0.78% de las secuencias

sobrerrepresentadas en su secuencia superior, con un 1.67% correspondiente a la suma
de las secuencias sobrerrepresentadas restantes. Para la muestra "Bulk Top", estos
valores son del 1.01% para las secuencias top y del 2.38% para la suma de las restantes.
Por otro lado, la muestra "Rhizosphere Bottom" muestra un 0.37% de secuencias
sobrerrepresentadas en su secuencia superior y un 1.37% en la suma de las restantes.
Finalmente, "Rhizosphere Top" presenta un 0.34% en la secuencia superior y un 0.89%
en la suma de las restantes.

Estos resultados indican que hay variaciones en la cantidad de secuencias

sobrerrepresentadas entre las diferentes muestras. Los valores más altos en las muestras
de "Bulk" sugieren una mayor presencia de secuencias que podrían ser repetitivas o
provenientes de contaminantes en la biblioteca, lo que podría afectar la interpretación de
los resultados. Este análisis es crucial para evaluar la calidad de las bibliotecas de
secuenciación y para identificar posibles sesgos que podrían influir en los hallazgos del
estudio.
Se presenta un análisis del contenido de adaptadores (Adapter Content), que muestra el
porcentaje acumulado de la proporción de la biblioteca que contiene cada una de las
secuencias de adaptadores en cada posición. En este gráfico, el eje x representa la
posición en pares de bases (bp), mientras que el eje y indica el porcentaje de secuencias.

Gráfico 9. Contenido de adaptadores (Adapter Content)

Las ocho muestras analizadas comienzan con un pequeño aumento en el contenido de

adaptadores, seguido de una fase de estabilidad en los porcentajes. Los valores más altos
se observan en las muestras "Rhizosphere Top" y "Rhizosphere Bottom", ambas con un
1.11% de contenido de adaptadores correspondientes al adaptador Illumina Small RNA
3. En contraste, las muestras "Bulk Top" y "Bulk Bottom" presentan los valores más
bajos, alcanzando solo un 0.25% en relación al mismo adaptador.

Estos resultados sugieren que hay variaciones en la cantidad de secuencias que contienen
adaptadores entre las diferentes muestras. La presencia de un contenido más alto de
adaptadores en las muestras de rhizosphere podría indicar una mayor cantidad de
lecturas que no se han alineado correctamente, lo que puede afectar la calidad de los
datos de secuenciación. Esta información es crucial para optimizar los procedimientos de
preparación de bibliotecas y asegurar la calidad en los análisis posteriores.
14
.

Se presenta un gráfico de verificación de estado (Status Checks) que evalúa cada sección
del análisis de FastQC. Las estadísticas básicas son verdes para todas las muestras,
indicando resultados normales. Sin embargo, la calidad de secuencia por base, las
puntuaciones de calidad por secuencia, el contenido de secuencia por base y el contenido
de GC por secuencia se presentan en rojo para todas las muestras, lo que sugiere
problemas significativos. El contenido de N por base muestra resultados normales en
verde para todas las muestras, mientras que la distribución de longitudes de secuencia
está en amarillo, indicando una ligera anormalidad. Los niveles de duplicación de
secuencias son verdes para todas las muestras, lo que sugiere que no hay problemas en
este aspecto. Las secuencias sobrerrepresentadas son amarillas para todas las muestras
excepto "Bulk Top", que se presenta en verde. Por último, el contenido de adaptadores se
encuentra en verde para todas las muestras, indicando que están dentro de los niveles
esperados. Este análisis resalta áreas que requieren atención y mejora en el proceso de
secuenciación y análisis.

Gráfico 10. Verificación de estado (Status Checks)

Después trimming:
La tabla presenta información sobre cuatro muestras, destacando el porcentaje de
duplicados (% Dups), que refleja la proporción de reads duplicados en el conjunto de
datos secuenciados. También se incluye el porcentaje de guanina y citosina (% GC), que
indica la cantidad de nucleótidos G y C en las secuencias de ADN. Además, se muestra
el número total de secuencias en millones (M Seqs), que representa la cantidad total de
reads en millones.

Para las muestras analizadas, "Rhizosphere Top" tiene un % Dups del 1.1%, con un %
GC del 55% y 0.0M en M Seqs. La muestra "Bulk Bottom" presenta un % Dups de
1.2%, un % GC también del 55%, y 0.0M en M Seqs. Por último, la muestra "Bulk Top"
muestra un % Dups de 1.8%, con un % GC del 55% y también 0.0M en M Seqs. Estos
resultados sugieren que todas las muestras tienen un contenido de GC constante, lo que
podría indicar que provienen de la misma especie o de regiones genómicas con similar
composición. Sin embargo, la baja cantidad de secuencias (0.0M) en todas las muestras
puede requerir una revisión adicional de los datos de secuenciación para determinar la
causa de esta ausencia.
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Tabla 2. Información general de las muestras.

En el análisis de un gráfico de conteo de secuencias de FastQC, las cuatro muestras

revelan detalles fascinantes sobre la calidad y cantidad de los reads. La muestra "Bulk
Bottom" destaca por tener alrededor de 22,341 unique reads, con solo 266 reads
duplicados, lo que sugiere una sólida representación de secuencias únicas y un bajo nivel
de redundancia en los datos. Por otro lado, "Bulk Top" muestra una cifra similar, con
22,171 unique reads, aunque un número ligeramente mayor de duplicate reads,
alcanzando los 397. Esto podría insinuar una pequeña sobre-amplificación durante la
preparación de la librería, pero aún dentro de un rango aceptable.
Las muestras de "Rhizosphere" cuentan una historia un poco distinta. La muestra
"Rhizosphere Bottom" tiene un número comparable de unique reads, 22,469, junto con
303 reads duplicados, lo que muestra una estabilidad en la diversidad de secuencias.
Finalmente, "Rhizosphere Top" mantiene una consistencia admirable, con 22,414 unique
reads y solo 251 duplicate reads, reafirmando la calidad de los datos secuenciados bajo
esta condición.

En conjunto, estas cifras muestran un panorama bastante equilibrado entre las muestras,
con niveles bajos de duplicación que permiten confiar en la validez de los datos
obtenidos. Aunque cada una presenta ligeras variaciones, estas parecen ser más el
resultado de las diferencias naturales en los procesos de preparación de las muestras, y
no de problemas significativos en la secuenciación en sí.

Grafico 11. Conteo de secuencias de FastQC.

Se presenta un gráfico de histogramas de calidad de secuencias (Sequence Quality

Histograms) que compara los resultados de las cuatro muestras en función de la posición
de la base (bp) en el eje x y el puntaje Phred en el eje y. Al inicio, en la base 1 bp, los
puntajes son cercanos, con 10.31 para "Rhizosphere Bottom", 10.27 para "Bulk Top",
10.20 para "Rhizosphere Top" y 10.17 para "Bulk Bottom". A medida que se avanza en
la longitud de la secuencia, todos los puntajes muestran una tendencia similar, oscilando
alrededor de un Phred de 12 hasta aproximadamente la base 1500, donde comienza una
caída notable en la calidad.
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.

Al llegar a la base 2000, los puntajes son los siguientes: 4.00 para "Rhizosphere Top",
9.10 para "Bulk Bottom", 9.00 para "Bulk Top" y 13.04 para "Rhizosphere Bottom".
Estos resultados indican que, aunque al principio las muestras presentan puntajes de
calidad relativamente similares, la calidad de las secuencias tiende a disminuir a medida
que se avanza en la longitud de las lecturas, especialmente en las muestras de "Bulk". La
muestra "Rhizosphere Bottom" parece ser la que mantiene la calidad más alta en las
posiciones finales, sugiriendo una mejor integridad en esos reads en comparación con las
otras muestras. Este análisis resalta la importancia de monitorizar la calidad de las
secuencias a lo largo de su longitud para asegurar la validez de los resultados de la
secuenciación.

Gráfico 12. Histogramas de calidad de secuencias (Sequence Quality Histograms)

En el análisis del gráfico de "Per Sequence Quality Scores," el pico más alto corresponde
a la muestra "Bulk Bottom," que alcanza un puntaje Phred de 12 con 8,733 lecturas, lo
que indica una buena calidad de las secuencias en ese rango. Todas las muestras inician
con puntajes alrededor de 8, aunque la muestra "Bulk Top" presenta el valor más bajo en
este rango, con apenas 82 lecturas, sugiriendo una menor calidad en comparación con las
demás. En contraste, la muestra "Rhizosphere Top" se destaca con 92 lecturas en el
mismo rango, lo que refleja un mejor desempeño inicial.

Gráfico 13. Per Sequence Quality Scores.

A medida que se avanza hacia puntajes más altos, se observa que en el puntaje Phred de
16, la muestra "Rhizosphere Top" muestra el conteo más bajo, con solo 1 lectura, lo que
indica que la calidad de las secuencias disminuye notablemente en este rango. Estos
resultados sugieren que, aunque "Bulk Bottom" tiene un rendimiento superior en
términos de lecturas de calidad, las muestras de "Bulk" y "Rhizosphere" muestran
variabilidad en su desempeño a lo largo del espectro de puntajes de calidad, destacando
la importancia de evaluar la calidad de las lecturas para asegurar la integridad de los
datos de secuenciación.

El gráfico de contenido de GC por secuencia (Per Sequence GC Content) presenta el

contenido promedio de guanina y citosina (GC) en las lecturas, con el porcentaje de GC
en el eje x y la cantidad de lecturas en el eje y. Este análisis revela un pico significativo
en la distribución del contenido de GC, destacando que el valor más alto del pico
corresponde a la muestra "Rhizosphere Top" con un 56% de GC y 16,62% de las
lecturas. En contraste, la muestra "Bulk Top" presenta el menor valor en el pico, con un
56% de GC y 15,74% de las lecturas. Estos resultados sugieren una consistencia en el
contenido de GC entre las muestras, aunque con ligeras variaciones en el número de
lecturas que alcanzan este porcentaje.

Gráfico 14. Contenido de GC por secuencia (Per Sequence GC Content)

Este resultado indica que no se han realizado llamadas de bases inciertas (N) en las
secuencias de ninguna de las muestras, lo que sugiere una alta calidad en la llamada de
bases durante el proceso de secuenciación. La ausencia de "N" en las lecturas es un
indicador positivo, ya que implica que todas las posiciones de las secuencias han sido
asignadas con bases específicas, lo que contribuye a la confiabilidad de los datos
obtenidos y a la precisión de los análisis posteriores.

Gráfico 15. Contenido de N por base (Per Base N Content)

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.

El gráfico de distribución de longitudes de secuencia (Sequence Length Distribution)

muestra la variación en los tamaños de los fragmentos (lecturas) secuenciados. En este
caso, el eje x representa la longitud de las secuencias en pares de bases (bp), mientras
que el eje y refleja el conteo de lecturas. El análisis revela un único pico en 1480 bp para
todas las muestras, siendo el valor más alto para "Bulk Top" con 4,149 lecturas, seguido
por "Rhizosphere Bottom" con 3,883 lecturas, "Bulk Bottom" con 3,870 lecturas, y
"Rhizosphere Top" con 3,801 lecturas. Este patrón uniforme sugiere una consistencia en
la longitud de los fragmentos secuenciados entre las muestras, aunque con ligeras
variaciones en la cantidad de lecturas observadas.

Gráfico 16. Distribución de longitudes de secuencia (Sequence Length Distribution)

El gráfico de niveles de duplicación de secuencias (Sequence Duplication Levels) revela

que la mayoría de las lecturas en las muestras tienen un bajo nivel de duplicación, con un
porcentaje elevado de secuencias únicas. En el nivel de duplicación 1, que representa las
secuencias únicas, las muestras "Rhizosphere Top" y "Bulk Bottom" muestran
porcentajes particularmente altos (98,26% y 98,05%, respectivamente), lo que indica una
baja proporción de secuencias duplicadas. Las muestras "Rhizosphere Bottom" y "Bulk
Top" presentan valores ligeramente más bajos, pero aún mantienen una baja duplicación
en este nivel (97,91% y 97,24%).

Gráfico 17. Niveles de duplicación de secuencias (Sequence Duplication Levels)

A medida que el nivel de duplicación aumenta, los porcentajes de secuencias duplicadas
disminuyen significativamente, lo que es esperable en un análisis de secuenciación de
alta calidad. En el nivel de duplicación 2, los porcentajes caen a menos del 2% en todas
las muestras, con "Bulk Top" mostrando el valor más alto en este nivel con 1,36%. Esto
indica que las muestras tienen una alta diversidad de secuencias, lo cual es positivo para
el análisis, ya que minimiza el sesgo de sobre-representación de algunas secuencias.

En conjunto, el análisis sugiere que las bibliotecas de secuenciación están bien

preparadas, con un bajo nivel de duplicación y una alta proporción de secuencias únicas,
lo cual es ideal para obtener resultados representativos del material genético original.

El análisis del contenido de adaptadores (Adapter Content) muestra que, si bien todas las
muestras presentan un pequeño aumento inicial en el contenido de adaptadores, seguido
de una fase de estabilidad, los niveles generales de adaptadores son bajos, lo que indica
una correcta eliminación de adaptadores durante el procesamiento de los datos de
secuenciación. Las muestras "Rhizosphere Top" y "Rhizosphere Bottom" presentan los
valores más altos, alcanzando un 1.31% de contenido de adaptadores correspondiente al
adaptador Illumina Small RNA 3. Este valor, aunque mayor que en las otras muestras,
sigue siendo relativamente bajo, lo que sugiere que la presencia de adaptadores no es un
problema significativo en estas bibliotecas.

Gráfico 18. Contenido de adaptadores (Adapter Content)

22
.

Por otro lado, las muestras "Bulk Top" y "Bulk Bottom" presentan los niveles más bajos
de contenido de adaptadores, con un 0.33%, lo cual indica que las secuencias de
adaptadores han sido casi completamente eliminadas. Esto es un indicador positivo, ya
que la presencia de adaptadores puede afectar la calidad de la secuenciación y la
interpretación de los datos. En general, los bajos niveles de contenido de adaptadores
sugieren que el proceso de limpieza de adaptadores fue eficaz, garantizando la integridad
y calidad de las secuencias analizadas.

El gráfico de verificación de estado (Status Checks) muestra una evaluación detallada

del análisis de FastQC para las cuatro muestras. Las estadísticas básicas son verdes para
todas las muestras, lo que indica que los resultados en cuanto a la cantidad y el formato
de los datos son normales. Sin embargo, la calidad de secuencia por base, las
puntuaciones de calidad por secuencia y el contenido de secuencia por base se destacan
en rojo, lo que señala problemas importantes en la calidad de las secuencias. Estos
resultados sugieren que es necesario revisar y posiblemente mejorar el proceso de
preparación o secuenciación de las muestras para evitar errores.

El contenido de N por base muestra resultados verdes, lo que indica que no hay
secuencias mal llamadas o con bases ambiguas, un buen indicador de la precisión del
proceso de secuenciación en este aspecto. La distribución de longitudes de secuencia
aparece en amarillo, lo que señala ligeras anomalías, pero no alarmantes.

Gráfico 19. Verificación de estado (Status Checks)

Por otro lado, los niveles de duplicación de secuencias son verdes en todas las muestras,
lo que indica que no hay un nivel preocupante de duplicados en las secuencias, lo cual es
positivo. El contenido de adaptadores también es verde para todas las muestras, lo que
sugiere que no hay problemas significativos con la presencia de secuencias de
adaptadores.

Finalmente, el contenido de GC por secuencia y las secuencias sobre-representadas

también son verdes, lo que indica que estos parámetros están dentro de los niveles
esperados para una secuenciación de calidad. En resumen, aunque existen problemas
significativos en la calidad de las secuencias, otros aspectos del análisis muestran
resultados normales o ligeramente anómalos.

Bulk bottom:

En los gráficos de distribución taxonómica obtenidos para la muestra "Bulk Bottom", se

observa una diferenciación clara en cada nivel jerárquico. En el nivel de dominio, el
d_Bacteria representa el 0,6% de la población microbiana total, lo que sugiere una baja
diversidad a este nivel en comparación con otros taxones. Al avanzar al nivel de filo, el
p_Proteobacteria constituye el 8%, indicando una mayor presencia de este grupo,
conocido por su versatilidad metabólica y relevancia en ambientes acuáticos y suelos. A
nivel de clase, los c_Gammaproteobacteria abarcan el 16%, lo que sugiere la
predominancia de esta clase específica dentro del filo Proteobacteria. Finalmente, el
análisis a nivel de orden revela que el grupo o_Pseudomonadales domina con un 55%
del total, destacando su importancia funcional, ya que este orden incluye bacterias clave
en la degradación de compuestos orgánicos y la promoción del crecimiento vegetal.

Esta jerarquización progresiva de los taxones permite inferir que la muestra "Bulk
Bottom" está altamente dominada por Pseudomonadales, lo cual podría tener
implicaciones ecológicas significativas en el contexto del ciclo de nutrientes en el suelo.
24
.

Gráfico 20. Distribución taxonómica obtenidos para la muestra "Bulk Bottom"

Bulk top:

En los resultados de la muestra "Bulk Top", se observa un patrón taxonómico similar al

de "Bulk Bottom", aunque con ligeras variaciones en los porcentajes. A nivel de
dominio, d_Bacteria representa el 0,5%, lo que indica una baja diversidad a este nivel.
En el nivel de filo, p_Proteobacteria abarca el 7%, mostrando una presencia
significativa de este filo en el suelo. En cuanto a la clase, c_Gammaproteobacteria
constituye el 13%, lo que refuerza la dominancia de esta clase dentro de los
Proteobacteria. Finalmente, el orden o_Pseudomonadales domina el análisis con un
50%, lo que evidencia su rol crucial en los procesos biológicos y ecológicos de la
muestra.

En conjunto, estos resultados subrayan que la comunidad microbiana de la muestra

"Bulk Top" está dominada por Pseudomonadales, con una composición taxonómica
similar a la muestra "Bulk Bottom", aunque con porcentajes levemente menores, lo cual
podría estar relacionado con variaciones en las condiciones ambientales de las distintas
capas del suelo.
Gráfico 21. Distribución taxonómica obtenidos para la muestra "Bulk top"

Rhizhosphere top:

En la muestra "Rhizosphere Top", se observa una disminución notable en la

representación del dominio d_Bacteria, que constituye solo el 0,07% del total, lo que
sugiere una comunidad microbiana menos diversa en comparación con las muestras de
"Bulk". A nivel de filo, p_Proteobacteria representa el 4%, lo que indica una menor
proporción en relación con las otras muestras. La clase c_Gammaproteobacteria abarca
el 9%, lo que confirma la importancia de este grupo dentro de la microbiota de la
rizosfera. El orden o_Pseudomonadales domina con un 48%, mostrando una tendencia
similar a las otras muestras, con una clara predominancia de este grupo en el entorno
rizosférico.

En conjunto, estos datos sugieren que la rizosfera superior tiene una comunidad
microbiana donde Pseudomonadales sigue siendo dominante, aunque con una menor
proporción de Proteobacteria y Gammaproteobacteria en comparación con las
muestras de suelo no rizosférico, lo que podría estar asociado a las interacciones con las
raíces y la disponibilidad de nutrientes.
26
.

Gráfico 22. Distribución taxonómica obtenidos para la muestra "Rhizosphere Top"

Rhizhosphere bottom:

En la muestra "Rhizosphere Bottom", el dominio d_Bacteria representa el 0,1% del

total, lo que refleja una diversidad bacteriana relativamente baja. En cuanto al filo
p_Proteobacteria, se observa un 5%, indicando una proporción ligeramente mayor en
comparación con la muestra de la rizosfera superior. La clase c_Gammaproteobacteria
constituye el 12%, lo que señala su relevancia dentro de la comunidad microbiana en
esta profundidad. Por último, el orden o_Pseudomonadales domina con un 54%, siendo
el grupo más representado, similar a las otras muestras, pero con un incremento respecto
a la rizosfera superior.

Estos resultados sugieren que en la rizosfera profunda, Pseudomonadales continúa

siendo el grupo predominante, mientras que se observa una ligera variación en la
proporción de Proteobacteria y Gammaproteobacteria, lo que podría estar relacionado
con las condiciones edáficas y la proximidad a las raíces en esta zona más profunda del
suelo.
Gráfico 23. Distribución taxonómica obtenidos para la muestra "Rhizosphere bottom"

Blastn:

Se caracterizaron los perfiles microbianos de cuatro ensamblajes de suelo (bulk bottom,

bulk top, rhizosphere bottom y rhizosphere top) utilizando análisis de BLASTn para la
identificación de secuencias 16S rRNA. A continuación, se describen los principales
hallazgos para cada ensamblaje, destacando los organismos más probables y su posible
relevancia ecológica en el contexto experimental.

Bulk Bottom:
28
.

Para el ensamblaje bulk bottom, el análisis BLASTn indicó la presencia predominante de

Dehalogenimonas alkenigignens, con un Max Score de 802, Total Score de 802, Query
Cover del 84%, E Value de 0.0, Per. Ident del 79.04% y Acc. Len de 1433. Este
organismo es conocido por su capacidad para degradar compuestos organohalogenados
en ambientes anaeróbicos, lo cual es consistente con las condiciones subterráneas del
suelo, donde la disponibilidad de oxígeno puede ser limitada y los contaminantes
halogenados podrían acumularse. Además, se detectó Tepidiforma bonchosmolovskayae
con un Max Score de 763, Total Score de 763, Query Cover del 93%, E Value de 0.0,
Per. Ident del 77.63% y Acc. Len de 1462, lo que sugiere la presencia de nichos
termofílicos en la zona basal del suelo.

Bulk Top:
 En el ensamblaje bulk top, se identificaron secuencias correspondientes a
Chthonomonas calidirosea, con un Max Score de 773, Total Score de 773, Query Cover
del 92%, E Value de 0.0, Per. Ident del 92% y Acc. Len de 1532. También se identificó a
Chthonomonas calidirosea en un segundo alineamiento, con un Max Score de 763, Total
Score de 763, Query Cover del 87%, E Value de 0.0, Per. Ident del 78.30% y Acc. Len
de 1411. Este organismo es característico de ambientes oligotróficos y se encuentra
comúnmente en suelos expuestos a fluctuaciones de nutrientes. La detección repetida de
esta bacteria en múltiples alineamientos sugiere que las condiciones superficiales del
suelo favorecen su establecimiento, probablemente debido a la escasez de nutrientes en
la capa superior del suelo.

Rhizosphere Bottom:

En la muestra de rhizosphere bottom, se detectó a Vicinamibacter silvestris, con un Max

Score de 532, Total Score de 532, Query Cover del 87%, E Value de 2e-150, Per. Ident
del 75.27% y Acc. Len de 1515. Este microorganismo se asocia típicamente a suelos
forestales y desempeña un papel importante en la degradación de materia orgánica. La
identificación de Vicinamibacter sugiere que la rizósfera profunda alberga comunidades
microbianas especializadas en la descomposición de compuestos complejos, lo cual es
coherente con la alta actividad microbiana esperada en las raíces de las plantas. Por otro
lado, se identificó a Thermosporothrix narukonensis con un Max Score de 436, Total
Score de 436, Query Cover del 43%, E Value de 2e-121, Per. Ident del 79.62% y Acc.
Len de 1317, lo cual indica la posible existencia de microambientes térmicos en el suelo
profundo.
30
.

Rhizosphere Top:

El análisis del ensamblaje de rhizosphere top mostró la presencia de Lachnospira

multipara, con un Max Score de 84.2, Total Score de 84.2, Query Cover del 16%, E
Value de 2e-15, Per. Ident del 75% y Acc. Len de 1518, lo que sugiere que el
alineamiento no es tan fuerte. Esta bacteria se asocia comúnmente a la fermentación de
carbohidratos en condiciones anaeróbicas, lo cual podría reflejar la alta actividad
microbiana en la zona cercana a las raíces, donde los azúcares exudados por las plantas
sirven como sustrato para diversos grupos bacterianos. Además, se detectó a
Povalibacter uvarum con un Max Score de 909, Total Score de 909, Query Cover del
99%, E Value de 0.0, Per. Ident del 82.40% y Acc. Len de 1508. Este microorganismo
está involucrado en el ciclo del carbono, lo cual es coherente con la alta disponibilidad
de compuestos de carbono en la rizósfera superior.

4 Discusión.

Las secuencias quimera son artefactos generados durante la amplificación de ADN o

durante el proceso de secuenciación de alto rendimiento. Estas secuencias resultan de la
combinación no natural de fragmentos de ADN de diferentes organismos, que se
ensamblan incorrectamente durante la amplificación o el análisis. Si no se eliminan las
secuencias quimera, los análisis posteriores como la identificación de especies o la
clasificación de comunidades microbianas, pueden verse sesgados, ya que estas
secuencias pueden ser mal interpretadas como organismos reales. Esta eliminación
mejora la calidad de los datos obtenidos al reducir el ruido y artefactos en los resultados,
permitiendo análisis más confiables y representativos. Removerlas permite realizar
análisis más rápidos y eficientes ya que estas pueden aumentar innecesariamente la
complejidad computacional y el tiempo de análisis(8).
Después del proceso de trimming, que elimina secuencias de baja calidad o adaptadores, se observó una pérdida s
analizadas. En la muestra bulk bottom, se perdieron 7,050 reads, mientras que en bulk top la pérdida fue de 7,198 r
rhizosphere top perdió 5,027 reads y rhizosphere bottom tuvo una pérdida de 4,920 reads. Estas pérdidas representan
cumplieron con los criterios de calidad establecidos durante el análisis. En total, se perdieron 24,195 reads entre toda
de control de calidad para asegurar que solo se conserven secuencias de alta calidad para los análisis posteriores.
Luego del proceso de trimming, se observa una mejora en la calidad de las secuencias eliminando los reads de baja ca
una reducción significativa en el porcentaje de reads duplicados, lo que indica una mayor representación de secuen
Bottom" redujo sus reads duplicados a 1.2% y "Rhizosphere Top" a 1.1%, lo que sugiere una mejor calidad y represen
Con el análisis realizado se determinó que el filo más abundante en la muestra es Proteobacteria, representando hasta
en la muestra "Bulk Top". El género más abundante dentro de este filo es Pseudomonadales, que domina con un 55%
"Bulk Top". La abundancia de Pseudomonadales se puede atribuir a su capacidad para degradar compuestos orgánic
del suelo, lo que le confiere ventajas en ambientes ricos en materia orgánica como el suelo​
Además entre las diferentes condiciones experimentales (suelo bulk y rizosfera), se
observa que las muestras de suelo bulk tienen un mayor número de reads únicos y
duplicados en comparación con las de la rizosfera. Esto sugiere una mayor diversidad o
abundancia de microorganismos en el suelo bulk. En las mismas condiciones
experimentales, las variaciones son pequeñas, lo que indica una relativa consistencia
dentro de cada ambiente analizado​

Se caracterizaron los perfiles microbianos de cuatro ensamblajes de suelo (bulk bottom, bulk top, rhizosphere botto
BLASTn para la identificación de secuencias 16S rRNA. A continuación, se describen los principales hallazgos para
más probables y su posible relevancia ecológica en el contexto experimental. Para el ensamblaje bulk bottom
predominante de Dehalogenimonas alkenigignens, con un Max Score de 802, Total Score de 802, Query Cover del 8
Acc. Len de 1433. Este organismo es conocido por su capacidad para degradar compuestos organohalogenados en a
con las condiciones subterráneas del suelo, donde la disponibilidad de oxígeno puede ser limitada y los contaminante
se detectó Tepidiforma bonchosmolovskayae con un Max Score de 763, Total Score de 763, Query Cover del 93%,
Len de 1462, lo que sugiere la presencia de nichos termofílicos en la zona basal del suelo. En el ensamblaje bulk top,
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a Chthonomonas calidirosea, con un Max Score de 773, Total Score de 773, Query Cover del 92%, E Value de 0.0,
organismo es característico de ambientes oligotróficos y se encuentra comúnmente en suelos expuestos a fluctuacio
esta bacteria en múltiples alineamientos sugiere que las condiciones superficiales del suelo favorecen su establecim
nutrientes en la capa superior del suelo. También se identificó a Chthonomonas calidirosea en un segundo alineamient
763, Query Cover del 87%, E Value de 0.0, Per. Ident del 78.30% y Acc. Len de 1411. En la muestra de rhizos
silvestris, con un Max Score de 532, Total Score de 532, Query Cover del 87%, E Value de 2e-150, Per. Ide
microorganismo se asocia típicamente a suelos forestales y desempeña un papel importante en la degradación
Vicinamibacter sugiere que la rizósfera profunda alberga comunidades microbianas especializadas en la descompo
coherente con la alta actividad microbiana esperada en las raíces de las plantas. Por otro lado, se identificó a Therm
de 436, Total Score de 436, Query Cover del 43%, E Value de 2e-121, Per. Ident del 79.62% y Acc. Len de 13
microambientes térmicos en el suelo profundo. El análisis del ensamblaje de rhizosphere top mostró la presencia de L
84.2, Total Score de 84.2, Query Cover del 16%, E Value de 2e-15, Per. Ident del 75% y Acc. Len de 1518, lo que
Esta bacteria se asocia comúnmente a la fermentación de carbohidratos en condiciones anaeróbicas, lo cual podría re
cercana a las raíces, donde los azúcares exudados por las plantas sirven como sustrato para diversos grupos bact
uvarum con un Max Score de 909, Total Score de 909, Query Cover del 99%, E Value de 0.0, Per. Ident del 82.40%
está involucrado en el ciclo del carbono, lo cual es coherente con la alta disponibilidad de compuestos de carbon
resultados de BLASTn muestran que las secuencias microbianas presentes en los diferentes ensamblajes de suelo es
que resalta la importancia de la diversidad microbiana en la función y estabilidad del ecosistema del suelo.

El flujo de trabajo utilizado podría utilizarse en investigación de biotecnología

agrícola ya que este flujo podría aplicarse en estudios sobre el microbioma de la
rizosfera de cultivos para identificar microorganismos que promuevan el crecimiento de
las plantas o controlen enfermedades, proporcionando una base para desarrollar
biofertilizantes o biopesticidas.

Una técnica adicional que podría beneficiar este análisis metagenómico es el uso de
Secuenciación Shotgun. Mientras que la secuenciación de amplicones (como el ARNr
16S) se enfoca en regiones específicas del genoma, la secuenciación shotgun permite
obtener una visión más completa del contenido genético de una muestra, proporcionando
información no solo sobre la presencia de microorganismos, sino también sobre sus
funciones metabólicas y ecológicas. Esto complementaría los pasos anteriores al
proporcionar un análisis más profundo y detallado de las capacidades funcionales de las
comunidades microbianas en las diferentes muestras ambientales​

5 Conclusión

Este estudio metagenómico destacó la importancia de eliminar secuencias quimera,

generadas durante la amplificación y secuenciación de ADN, para mejorar la calidad de
los análisis taxonómicos y funcionales. Tras el proceso de trimming, se observó una
pérdida significativa de reads, lo que permitió depurar los datos y eliminar secuencias de
baja calidad y duplicadas.

El filo más abundante en las muestras fue Proteobacteria, con el género dominante
Pseudomonadales, clave en la degradación de compuestos orgánicos. Las muestras de
suelo bulk mostraron mayor diversidad microbiana en comparación con las de rizosfera,
sugiriendo diferencias en las condiciones ambientales. Además, se recomienda la
incorporación de secuenciación shotgun para obtener una visión más amplia del
contenido genético y funcional de las comunidades microbianas.
34
.

6 Referencias

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[Link]://[Link]/about-genomics/fact-sheets/A-Brief-Guid
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5. Rose Lee. (2019). Metagenomic Next Generation Sequencing: How Does It
Work and Is It Coming to Your Clinical Microbiology Lab?
[Link]://[Link]/Articles/2019/November/Metagenomic-Next-Generation-S
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16S en Sanger y amplicones PCR de 454 pirosecuenciados".Investigación del
genoma vol. 21,3 (2011): 494-504. doi:10.1101/gr.112730.110