Club de Revista
Paula Michel García López
Electiva: Métodos Moleculares en Microbiología
2025-1
Tabla de Contenido
Presentación e Introducción Secuenciación metagenómica
al Artículo directa de muestras
Evolución de las tecnologías de Factores a tener en cuenta al
secuenciación implantar estas tecnologías
Secuenciación del genoma Futuro de la NGS en
completo de microorganismos microbiología clínica
Conclusiones
Departamento de Medicina de Laboratorio y
Patología, en Minneapolis (USA)
Evann Hilt Patricia Ferrieri
MS, PhD, Universidad Medicina, Universidad
Loyola, Chicago de Pittsburgh
M(ASCP)CM, Residencia en
Universidad de Pediatría, Universidad
California en L.A de Minnesota
El Instituto Multidisciplinario de Publicaciones Digitales (MDPI,
por sus siglas en inglés) es una plataforma y una editorial de
revistas científicas de acceso abierto creada en 1996 en Suiza
Clasificación de la revista: JCR - Q2 (Genética y Herencia)
Genes es una revista de genética y genómica con revisión por pares y
acceso abierto, publicada mensualmente en línea por MDPI
En las últimas décadas, las NGS han revolucionado
el diagnóstico de trastornos genéticos y cáncer.
Se han convertido en el estándar de oro gracias a
su capacidad de secuenciar millones de
fragmentos de ADN en paralelo con alta precisión y
velocidad.
Introducción:
Han comenzado a usarse en laboratorios clínicos
en el área de microbiología, gracias a que
permiten detectar y caracterizar patógenos con
una mayor sensibilidad
El objetivo de esta revisión es explorar estas 3
aplicaciones y su implementación en laboratorios
clínicos, de salud pública y de investigación.
Analizar los desafíos de su integración y el futuro
de NGS en el diagnóstico de enfermedades
infecciosas.
Evolución de las tecnologías de secuenciación
- 1 Generación -
ALLAN MAXAM Y FREDERICK
WALTER GILBERT SANGER Bajo rendimiento, complejidad moderada
Identificación de
16S y 28S
Secuenciación del
genoma completo
Fractura química del Terminación de
ADN radiomarcado en cadena en bases
bases específicas específicas mediante
didesoxinucleótidos
Evolución de las tecnologías
de secuenciación
-2 Generación -
2
Pirosecuenciación
3
En lugar de nucleótidos marcados
con radio o con fluorescencia, los
investigadores midieron la síntesis
1 4 de pirofosfato con luminiscencia
para determinar la secuencia de
nucleótidos
5 Alto rendimiento
6
Alta complejidad
Rápida y en tiempo real
No requiere electroforesis
Alta precisión en secuencias cortas
SOLiD (Secuenciación por Ligación y
Detección de Oligonucleótidos)
Desarrollada por Applied
Biosystems, basada en la
ligadura de oligonucleótidos
marcados en lugar de la
incorporación de nucleótidos
Lectura por ligadura (no por
síntesis).
Alta precisión: cada base es
interrogada 2 veces
Proceso complejo
Alto rendimiento
Lecturas cortas
Secuenciación de torrentes iónicos
Utiliza tecnología de chips semiconductores para realizar la secuenciación
directa del genoma no óptica utilizando circuitos integrados.
Mide la diferencia de pH causada por la liberación de protones durante la polimerización.
Ilumina Secuenciación profunda de amplicones
Metagenómica Shotgun
Evolución de las tecnologías de secuenciación
-3 Generación -
La secuenciación de PacBio, también conocida como secuenciación de ADN de molécula única
en tiempo real (SMRT) desarrollado por Pacific Biosciences que permite la observación en tiempo
real de la síntesis de ADN sin la necesidad de amplificación del ADN.
Oxford Nanopore Technologies
Resolución de moléculas
individuales mediante nanoporos
biológicos y de estado sólido
Alta complejidad,
rendimiento moderado
Secuenciación del genoma
completo
Secuenciación profunda
de amplicones
Metagenómica Shotgun
Secuenciación del genoma completo
de microorganismos (WGS)
Proceso de secuenciación y ensamblaje del genoma
microbiano de un organismo de interés.
Requiere el cultivo y aislamiento del organismo antes de la extracción del
ácido nucleico y la posterior secuenciación. En el caso de los genomas
víricos, se utiliza secuenciando la muestra directamente.
1. Ensamblaje de referencia: los fragmentos de ADN se alinean
con un genoma de referencia conocido y se obtiene un
genoma de consenso, como un rompecabezas (Puzzle)
2. Ensamblaje de novo: todos los fragmentos de ADN se
ensamblan en contigs.
3. Híbrido de ensamblajes de novo y de referencia: los
fragmentos de ADN se ensamblan en contigs de novo y de
referencia.
Métodos tradicionales en
microbiología clínica para
la identificación
Morfología básica (tinción, forma,
disposición)
Pruebas bioquímicas
MALDI-TOF MS (Espectrometría de masas
asistida por matriz):
Muy rápida y precisa
Dificultad con organismos fastidiosos
y bacterias anaerobias
No siempre se logra identificación a
nivel de especie
No permiten identificar serotipos
Antes de WGS, los laboratorios
de salud pública en infecciones
por Salmonella, utilizaban esta Electroforesis en gel de
técnica para distinguir serotipos campo pulsado (PFGE)
causantes de fiebre entérica
Estudios comparativos de la WGS
demostraron que era comparable a
la PFGE y que permitía la
identificación de serotipos de
Salmonella.
Se ha convertido en el método de
referencia
Tipificación de
secuencias multilocus
(MLST)
Un enfoque bioinformático que permite
comparar el parentesco genético entre
bacterias mediante análisis del genoma
completo (WGS).
Analiza 5 a 7 genes de mantenimiento
(housekeeping genes) específicos
Busca mutaciones o variaciones en
esos genes
Asigna a cada variante un número
Considerado patrón oro en la
tipificación bacteriana con WGS
Los resultados de WGS generados por los laboratorios de salud pública son
conservados y mantenidos para ayudar a identificar e investigar posibles brotes
en los sistemas de producción y distribución de alimentos
Microorganismos que
identifica y subtipifica:
Salmonella enterica serovar
Typhimurium
Escherichia coli (O157)
Otras E. coli productoras de
toxina Shiga
Campylobacter
Listeria monocytogenes
Shigella
Vibrio cholerae y
parahaemolyticus
Cronobacter
Vigilancia genómica en Aplicación del WGS
enfermedades prevenibles en la salud publica
por vacunación
1. Determina si un brote está
Se utiliza para identificar serogrupos de ocurriendo
Neisseria meningitidis y serotipos de 2. Identifica el serogrupo
Streptococcus pneumoniae
responsable
La meningitis meningocócica requieren 3. Ayuda a tomar decisiones:
vigilancia constante, causa brotes Vacunación masiva
frecuentes en distintas regiones. Otras intervenciones
Se identificaron varios tipos de secuencia (ST) y complejos clonales (CC).
Destaca el ST-452, perteneciente al CC23, detectado en varios países
El ST-452 se originó por recombinación genética, entre el CC23 y el linaje hipervirulento CC17.
Se produjo una transferencia genética única, probablemente por conjugación y recombinación
homóloga.
La evolución bacteriana puede estar impulsada por el intercambio de grandes fragmentos de
ADN (cientos de kilobases).
Se analizaron por WGS numerosos aislados colonizadores de Streptococcus del grupo B (GBS)
provenientes de mujeres embarazadas:
Mayoría de aislados del serotipo IV pertenecían al ST-459.
Resistente a tetraciclina, eritromicina y clindamicina
Fue identificado por 1 vez en Minnesota, EE. UU.
Se detectaron múltiples eventos de cambio capsular entre aislados (Alta diversidad genética)
Necesidad de un seguimiento genómico continuo.
Desarrollo de vacunas frente a los 10 serotipos conocidos de GBS.
WGS en la vigilancia de
brotes nosocomiales
Patógenos comúnmente Microorganismos
multirresistentes (MDR):
estudiados: Klebsiella pneumoniae
Staphylococcus aureus resistente a
resistente a meticilina carbapenémicos
(MRSA) Enterococcus faecium
Clostridioides difficile Acinetobacter
baumannii
multirresistente
En 2015, se notificó un grupo de
infecciones por micobacterias no
tuberculosas (MNT) en pacientes de
cirugía cardiotorácica en Pensilvania,
EE. UU.
Fuente: Dispositivos de calentamiento
y enfriamiento (HCD) usados durante
las cirugías.
73% de los pacientes
tenían M. chimaera.
WGS y resistencia a los antimicrobianos
Métodos actuales de detección:
1. Fenotípicos dependientes de
cultivo: requieren crecimiento Algunos estudios indican buena correlacion
bacteriano. genotipica para predecir resistencia en
2. Moleculares rápidos patógenos como:
(independientes de cultivo): E. coli, S. aureus, P. aeruginosa,
Enterococcus faecium, N. gonorrhoeae
detectan pocos marcadores
genéticos. ⬇️
Mayor tiempo de respuesta que
métodos convencionales.
Aún no reemplaza completamente Organismos de crecimiento
los métodos actuales lento o fastidiosos:
Mycoplasma spp.
Ureaplasma spp.
WGS en micobacterias
Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB)
Mycobacteroides abscessus
✅ Ventajas: Limitación actual:
Acelera el tiempo de detección de Solo detecta genes y mutaciones
resistencia antimicrobiana: conocidos.
De 1 mes a pocos días en M. tuberculosis Se están desarrollando herramientas
de inteligencia artificial y aprendizaje
De 14 días a 3–5 días para resistencia automático para mejorar la
inducible a claritromicina y amikacina en predicción de resistencia.
M. abscessus.
Identificación de Hongos en Diagnóstico Clínico por WGS
Menos desarrollada que la identificación bacteriana
Solo hay aprox. el 50% de correlación entre identificación
fenotípica y molecular
Ventajas del uso de NGS:
Mayor precisión en la identificación de mohos clínicamente relevantes.
Uso de regiones genéticas:
Región D2 del gen ARNr
Regiones ITS completas
Útil para mohos raros o difíciles de identificar por métodos tradicionales.
Brote de infecciones del torrente
sanguíneo (BSI) en pacientes oncológicos
en Colombia y Chile (2013–2014) asociado
con la administración de medicamentos
antináuseas contaminados.
Tipificación de secuencias del genoma
completo (WGST)
Aislados del brote: ≤5 SNPs → altamente
relacionados
Aislados de control: >21.000 SNPs
Confirma una fuente puntual única
Permite investigar brotes de patógenos
eucariotas raros sin genomas de referencia o
métodos previos
WGS en la Identificación y Vigilancia de Candida auris
Problemas con los métodos tradicionales:
Difícil de identificar con técnicas bioquímicas estándar.
Frecuentemente confundida con otras levaduras:
Candida haemulonii
Candida parapsilosis
Rhodotorula spp.
Con WGS:
Permite identificación precisa y diferenciación entre especies similares.
Facilita el seguimiento epidemiológico en brotes hospitalarios.
Fundamental para el control y la prevención de infecciones por C. auris
Estudio de la Resistencia a Azoles y su
Transmisión Ambiental
Se estudiaron 218 aislados clínicos y
Se secuenciaron 24 aislados
(resistentes y sensibles) procedentes ambientales.
de fuentes clínicas y ambientales de
distintos países. El análisis filogenético reveló que
aislamientos resistentes a azoles
circulaban en el medio ambiente y eran
Mediante análisis bioinformático de
adquiridos por pacientes
SNPs de alta densidad, se confirmó la
inmunocomprometidos.
mutación TR34/L98H en el gen
Cyp51A como el principal mecanismo
Se evidenció la transmisión ambiental
de resistencia.
directa de cepas resistentes a humanos.
Se aplicaron estudios de asociación del genoma completo (GWAS) y análisis
pangenómicos.
Se identificaron nuevas variantes genéticas asociadas con la resistencia al itraconazol, lo
que sugiere mecanismos poligénicos
Secuenciación Metagenómica
Directa de Muestras
Secuenciación dirigida
Método de secuenciación que enriquece ADN de interés
(organismos específicos) antes o después de preparar la
biblioteca.
✅ Ventajas:
Alta sensibilidad
Menor interferencia de ADN humano
Ideal para muestras con muchas células humanas (tejido, esputo)
Desventaja:
Solo permite detectar un número limitado de patógenos
Secuenciación profunda de amplicones (PCR dirigida)
Una extensión de la PCR que permite secuenciar genes específicos con
gran profundidad, útil para identificar microorganismos difíciles de cultivar.
Gen 16S ARNr → Identificación bacteriana
Gen 28S / ITS → Identificación fúngica
Bacterias transmitidas por garrapatas:
Borrelia, Anaplasma, Ehrlichia, Rickettsia
Hongos de diagnóstico complicado
Muestras:
Líquido cefalorraquídeo (LCR)
Sangre
Líquido articular
En infecciones articulares periprotésicas (IAP)
Identificación Fúngica mediante
Secuenciación Profunda de Amplicones
Los tejidos fijados en formalina e incluidos en parafina (FFPE) son comunes en
el diagnóstico histopatológico.
La detección convencional de infecciones fúngicas invasivas se basa en:
Visualización microscópica de estructuras fúngicas
Cultivo
Desventajas:
Pueden detectarse elementos fúngicos sin confirmación por cultivo. (Hallazgo accidental)
Hasta el 21% de los hongos en FFPE pueden identificarse erróneamente.
Ventajas de la secuenciación profunda de amplicones (ITS) en FFPE:
Alta sensibilidad: detecta hongos incluso con <50 estructuras en el portaobjetos.
Permite una identificación precisa de especies fúngicas.
Facilita una terapia antifúngica dirigida y adecuada.
Diagnóstico Virológico y
Resistencia a Antivirales
1. Detecta mutaciones específicas
en el genoma viral
2. Estas mutaciones están
asociadas a resistencia a fármacos
3. Permite identificar variantes
minoritarias que otros métodos no
detectan
Secuenciación Dirigida por
Enriquecimiento de Sondas
Uso de sondas de hibridación (fragmentos cortos de ADN o ARN)
Las sondas se ensamblan en paneles específicos (hasta 50 millones)
Se unen selectivamente a genes o mutaciones de interés en ADN fragmentado
Aplicaciones clínicas en:
Bacterias: Sistema BacCapSeq
Plataforma con 4,2 millones de sondas basadas en Centro de Integración de
Recursos de Pathosystems (PATRIC), la Base de Datos Integral de
Resistencia a los Antibióticos (CARD) y la Base de Datos de Factores de
Virulencia (VFDB)
Virus de vertebrados: Plataforma VirCapSeq-VERT
Plataforma de captura de sondas para virus ARN y ADN para detección,
tipificación y diferenciación de cepa
Cobertura total de secuencias virales en GenBank, RefSeq, EMBL y GISAID
Análisis genómicos completos en < 36 h
🦟 Virus del Zika
Facilitó la detección de linajes y el rastreo
epidemiológico durante el brote de mediados del 2010
Permitió secuenciar el virus directamente desde
muestras clínicas, incluso con baja carga viral.
SARS-CoV-2
El éxito con Zika impulsó la aplicación del método
en la pandemia de COVID-19.
Muchos laboratorios de salud pública usan
enriquecimiento por sondas para:
Secuenciar directamente desde muestras clínicas.
Identificar variantes del virus que circulan en la
comunidad.
Apoyar estrategias de vigilancia genómica en
tiempo real.
Secuenciación Metagenómica ShotGun
Permite secuenciar todo el ácido nucleico
presente en una muestra.
En una sola prueba identifica: Bacterias, Hongos, Virus, Parásitos
Detección de infecciones en muestras estériles:
LCR, sangre, líquido articular.
También útil en muestras con microbiota:
Tracto respiratorio, gastrointestinal, orina.
Desventajas:
Ruido de fondo por ácido nucleico humano o la microbiota residente.
Preocupante en muestras como tejidos o secreciones respiratorias.
Prueba de
Introducida en 2016 como método de detección no invasiva de sangre/plasma Karius
infecciones profundas y del torrente sanguíneo.
Detecta >1250 dianas de: Bacterias, Hongos, Virus de ADN,
Parásitos eucariotas
Entrega del informe: 24–48 h
Abundancia en moléculas por microlitro (MPM).
Resultados ordenados de mayor a menor MPM.
Útil cuando cultivos y otras pruebas moleculares resultan
negativos.
Ideal para pacientes complejos con infecciones invasivas.
La interpretación requiere juicio clínico.
NO aprobado por FDA, pero certificado por CLIA y acreditado por el CAP.
FACTORES PARA CONSIDERAR PARA EL
USO DE ESTAS TECNOLOGIAS
Actualmente, NO existe un sistema estandarizado
aprobado por la FDA para NGS en microbiología clínica.
Las pruebas deben presentarse como LDT
(Laboratory Developed Test).
La validación de una LDT requiere tiempo y recursos
significativos.
Difícil establecer parámetros de control de calidad, no
existe un estándar de referencia consensuado.
Los laboratorios deben construir comunidades
microbianas simuladas o una muestra enriquecida para
validación.
El CDC y la APHL ofrecen recursos y herramientas para
implementar sistemas de gestión de calidad
La utilidad clínica de NGS depende de cómo se presentan e
interpretan los datos, especialmente en enfoques metagenómicos.
NO existen canales bioinformáticos comerciales estándar para
microbiología clínica.
Los flujos de trabajo bioinformáticos: Requieren tiempo, experiencia
en codificación y análisis clínico-microbiológico.
Establecer un grupo asesor o consejo clínico-microbiológico:
Apoyar en la interpretación de hallazgos inciertos.
Asegura que los resultados reportados tengan relevancia clínica.
Costo inicial significativo, a pesar de la reducción
en el precio por muestra secuenciada.
Se requiere espacio físico adaptado:
1. Separación de áreas de preamplificación y
posamplificación para evitar contaminación.
2. Equipamiento especializado para NGS.
Validación de pruebas (LDT):
Proceso costoso y prolongado.
Necesario antes de implementar clínicamente.
Desafío económico al sustituir métodos de bajo
costo como el cultivo microbiológico.
El futuro de la NGS en la
microbiología clínica
Futuro Prometedor = Reducción significativa de costos en la secuenciación.
Acceso más amplio: En laboratorios más pequeños y no solo en grandes centros académicos.
Tiempos de respuesta más rápidos, comparables a métodos convencionales.
Integrar análisis proteómicos permitirá:
Ver qué proteínas realmente se expresan e
inferir con mayor precisión la resistencia fenotípica a antibióticos
Detectar un gen de resistencia no garantiza su expresión como proteína funcional.
La resistencia real solo se confirma con pruebas fenotípicas de susceptibilidad.
Los análisis actuales permiten detectar múltiples patógenos en una
muestra clínica.
Pero NO pueden ensamblar genomas completos (excepto Virus).
Que sigue ahora?
La bioinformática más avanzada permitirá:
• Reconstruir genomas completos de bacterias, hongos y parásitos.
• Predecir marcadores de virulencia.
• Identificar genes de resistencia antimicrobiana.
-Conclusiones -
Aunque la NGS existe desde hace décadas, recién está revolucionando el
diagnóstico clínico.
La WGS (secuenciación del genoma completo) permite:
• Identificar patógenos difíciles.
• Vigilar brotes.
• Detectar genes de resistencia conocidos y nuevos.
La secuenciación dirigida y metagenómica directamente desde muestras
mejora la detección de organismos que escapan a métodos convencionales.
Aunque no reemplaza las pruebas tradicionales, la NGS aumenta la precisión
diagnóstica y mejora la atención al paciente.
¡Muchas
gracias!