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3
1
2
3 Aislamiento y selección de microorganismos
4 productores de enzimas de interés industrial
5
6 Daniel Esteban Barriga Puentes, Carlos Andrés Vargas Alejo
7
8 Esta guía de laboratorio detalla la metodología para el aislamiento y
9 selección de microorganismos mesófilos productores de enzimas de
10 interés industrial, como proteasas, amilasas, celulasas y lipasas. El
11 objetivo principal es obtener y caracterizar cepas microbianas con
12 actividad enzimática hidrolítica a partir de muestras ambientales de
13 suelo y/o agua. Las enzimas microbianas son valoradas por sus amplias
14 aplicaciones industriales y ventajas sobre las de origen vegetal y animal,
15 debido a la facilidad de manipulación genética, rápido crecimiento y alta
16 producción.
17
18
19
20
21
22
La metodología incluye la preparación de diluciones seriadas de las muestras iniciales y su siembra en medios de cultivo
23
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27
28
29
30 Palabras clave: Microorganismos; Enzimas; Hidrolítica; Halos; Industria;
31
32 Contact information: Pontificia Universida javeriana, Bogota Colombia, Barrigad.a@[Link] y
33 carlos-vargasa@[Link]
34
35 INTRODUCTION
36
37 Las enzimas son catalizadores biológicos que participan en múltiples reacciones
38 biológicas fundamentales para el sostenimiento de la vida, aceleran la velocidad de
39 reacción al reducir la energía de activación sin sufrir ningún cambio permanente. Están
40 presentes en todas las formas de vida, desde microorganismos hasta plantas y animales.
41 En plantas y animales, las enzimas están presentes en cantidades muy pequeñas y no
42 pueden ser explotadas para aplicaciones industriales. Por el contrario, la producción de
43 enzimas a partir de microorganismos ofrece muchas ventajas, tales como fácil manejo,
44 rápida multiplicación en condiciones controladas, fácil manipulación genética, alto
45 rendimiento productivo, entre otras (Singh et al. 2019).
46 La mayoría de las enzimas utilizadas en la industria son de acción hidrolítica,
47 siendo utilizadas para la degradación de diversas sustancias naturales. Los grupos
48 dominantes en el mercado son las proteasas, debido a su amplio uso en las industrias de
49 detergentes y productos lácteos, y las carbohidrasas, principalmente amilasas y celulasas,
50 utilizadas en industrias como la industria del almidón, textil, detergente y panadería. Las
51 industrias técnicas, dominadas por las industrias de detergentes, alimentos y bebidas,
52 textiles, alimentación animal, biocombustibles, papel, nutracéuticos, cuidado personal y
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5 1
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8
53 cosméticos, representan el mayor consumo de enzimas industriales (Kirk et al. 2002;
54 Research 2022). El tamaño del mercado mundial de enzimas se valoró en USD 11 470
55 millones en 2021 y se prevé que se expanda a una tasa de crecimiento anual compuesto
56 (CAGR) del 6,5 % entre 2022 y 2030 (Research 2022).
57 Los microorganismos productores de enzimas industriales pueden ser buscados en
58 ecosistemas naturales, extremos o no, determinando así sus características. Generalmente
59 se aíslan de muestras de suelo, cortezas de plantas, ambientes acuosos, sedimentos
60 marinos, desechos sólidos municipales y de sustratos específicos, dependiendo de la
61 actividad que se esté buscando, como uvas o leche (Niyonzima 2019). En esta guía
62 encuentra la metodología para aislar microorganismos productores de proteasas,
63 celulasas, amilasas y lipasas, de diversas muestras, como suelo y/o agua.
64
65 Subheading in 12-point Arial Bold
66 Use subheadings sparingly to set off different subject matter, especially in parts of
67 your article that extend beyond one page in length. Notice that the subheading is in “Title
68 Case,” with major words capitalized.
69 Skip 2 spaces before a major (ALL CAPS) heading, and one space after, as
70 shown below.
71
72
73 EXPERIMENTAL
74
75 1. MATERIALES, REACTIVOS, MEDIOS DE CULTIVO Y EQUIPOS
76
77 1.1 Reactivos y medios de cultivo
78 ∙ Colorantes de Gram
79 ∙ Lugol
80 ∙ Rojo congo
81 ∙ NaCl 0.1M
82 ∙ Agar almidón al 1% (p/v) (numeral 6.1)
83 ∙ Agar celulosa al 1% (p/v) (numeral 6.2)
84 ∙ Agar leche al 1% (p/v) (numeral 6.3)
85 ∙ Agar tributirina (numeral 6.4)
86
87 1.2 Materiales por grupo de trabajo
88 ∙ Cajas de Petri con agar específico para cada enzima (agar
89 almidón, agar celulosa, agar leche y agar tributirina)
90 ∙ Frasco de vidrio con 90 mL de agua peptonada 0.1% (p/v) estéril
91 ∙ Pipeta de 10 mL
92 ∙ Puntas azules estériles
93 ∙ Rastrillos de vidrio estériles
94 ∙ Tubos de 16x150 mm con 9 ml de agua peptonada al 0.1% (p/v)
95 estéril
96
97 1.3 Equipos
98 ∙ Balanza
99 ∙ Incubadora a 37°C
100 ∙ Microscopio
101 ∙ Vortex
9
10 2
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102
103 2. METODOLOGÍA
104
105 2.1 Pesar o medir 10 g o 10 mL de la muestra
106
107 2.2 Adicionar esta cantidad al frasco de vidrio que contiene 90 mL de agua peptonada
108 0.1% (p/v) estéril correspondiente a la dilución 10-1
109
110 2.3 A partir de la dilución anterior realizar diluciones seriadas 10–2, 10– 3, 10– 4, 10–5,
111 adicionando 1 mL de cada dilución en los tubos que contienen 9 mL de agua peptonada
112 0.1%(p/v)
113
114 2.4 Sembrar en superficie 0.1 mL de las diluciones 10– 3, 10– 4, 10–5, en medio
115 específico para cada enzima (agar almidón, agar celulosa, agar leche y agar tributirina) e
116 incubar a 37ºC durante 48 horas
117
118 2.5 Realizar el recuento de todas las colonias (las que presentan y no presentan halos de
119 hidrólisis). Este recuento corresponde al número de colonias totales. Registrar el
120 resultado obtenido en la Tabla 1.
121
122 2.6 Posteriormente, adicionar lugol sobre las colonias crecidas en el agar almidón.
123 Realizar el recuento de aquellas colonias que presentan halos de hidrólisis alrededor de
124 las mismas. Este recuento corresponderá al número de colonias que presentan actividad
125 enzimática amilolítica. Registrar el resultado obtenido en la Tabla 2.
126
127 2.7 En las cajas de agar celulosa adicionar rojo congo sobre las colonias crecidas, después
128 de 5 minutos, retirar el exceso, posteriormente, adicionar NaCl 0.1M y dejarlo reposar
129 por 5 minutos, eliminar el sobrante y realizar el recuento de aquellas colonias que
130 presentan halos de hidrólisis alrededor de las mismas. Este recuento corresponderá al
131 número de colonias que presentan actividad enzimática celulolítica. Registrar el resultado
132 obtenido en la Tabla 2.
133
134 2.8 Las cajas de agar leche y agar tributirina no necesitan revelador, los halos productos
135 de la actividad enzimática se observan directamente
136
137 2.9 Medir con una regla el diámetro en milímetros (mm) de cada uno de los halos. Tenga
138 en cuenta la siguiente fórmula: C = A− B en donde:
139
140 A: Diámetro de la colonia más el halo de hidrólisis en mm
141 B: Diámetro de la colonia en mm
142 C: Diámetro del halo de hidrólisis
143
144 2.10 Realizar una descripción macro y microscópica de las colonias que presenten halos
145 iguales o superiores a 5 mm de diámetro. Registrar los resultados obtenidos en la Tabla 3.
146
147 3. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
148
149 3.1 Agar almidón 1% (p/v)
150
14
15 3
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18
151 Composición en g/L
152 Almidón 10.0
153 Extracto de levadura 2.5
154 Peptona universal 2.5
155 Sulfato de amonio 0.5
156 Cloruro de calcio 0.5
157 Fosfato monobásico de potasio 0.1
158 Fosfato dibásico de potasio 0.1
159 Agar-Agar 15.0
160 pH final 7 .0 ± 0.2
161
162 Preparación
163 Pesar las cantidades de cada uno de los componentes en balanza y disolver con
164 1000 mL de agua destilada. Calentar lentamente hasta disolver completamente el agar,
165 llevar a esterilización a 7lb. de presión durante 7 minutos. Posteriormente, servir en cajas
166 de Petri.
167
168 3.2 Agar celulosa 1% (p/v)
169
170 Composición g/L
171 Carboximetil celulosa 10.0
172 Extracto de levadura 2.5
173 Peptona 2.5
174 Sulfato de calcio 0.5
175 Cloruro de calcio 0.5
176 Fosfato monobásico de potasio 0.1
177 Fosfato dibásico de potasio 0.1
178 Agar 15.0
179 pH final 7 .0 ± 0.2
180
181 Preparación
182 Pesar las cantidades de cada uno de los componentes en balanza y disolver con
183 1000 mL de agua destilada. Calentar lentamente hasta disolver completamente el agar,
184 llevar a esterilización a 15lb. de presión durante 15 minutos. Posteriormente, servir en
185 cajas de Petri.
186
187 3.3 Agar leche al 1% (p/v)
188
189 Composición g/L
190 Leche en polvo descremada 10.0
191 Extracto de levadura 2.5
192 Peptona universal 2.5
193 Sulfato de calcio 0.5
194 Cloruro de calcio 0.5
195 Fosfato monobásico de potasio 0.1
196 Fosfato dibásico de potasio 0.1
197 Agar-Agar 15.0
198 pH final 7 .0 ± 0.2
199
19
20 4
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23
200
201 Preparación
202
203 Pesar las cantidades de cada uno de los componentes en balanza y disolver con
204 1000 mL de agua destilada. Calentar lentamente hasta disolver completamente el agar,
205 llevar a esterilización a 7 lb. de presión durante 7 minutos. Posteriormente, servir en cajas
206 de Petri.
207
208 3.4 Agar tributirina – Merck®
209
210 Composición g/L
211 Glicerol tributirina 10.0
212 Extracto de levadura 3.0
213 Peptona 5.0
214 Agar-Agar 15.0
215 pH final 7.0
216
217 Preparación
218
219 Pesar las cantidades de cada uno de los componentes en balanza y disolver con
220 1000 mL de agua destilada. Calentar lentamente hasta disolver completamente el agar,
221 llevar a esterilización a 15lb. de presión durante 15 minutos. Posteriormente, servir en
222 cajas de Petri.
223
224 Ecuaciones:
225
n de colonias contadas
226 UFC /mL o g = ∗Dilucin inversa [Ecuacion 1.0]
Volumen sembrado (mL)
227 Esta ecuación 1.0 se usa para calcular la cantidad de microorganismos viables en
228 la muestra original
229
230 C= A−B [Ecuacion 1.1]
231 Esta ecuación se usa para determinar el halo claro que se forma por la
232 actividad enzimática (hidrolítica) de la colonia.
233
234 MATERIALES Y METODOS
235
236 Se emplearon procedimientos microbiológicos clásicos, estandarizados
237 para el aislamiento de microorganismos mesófilos y la evaluación de su
238 actividad enzimática.
239
240 Para la obtención de los aislados, se prepararon diluciones seriadas
241 decimales (10⁻¹ a 10⁻⁵) a partir de una muestra de suelo previamente
242 homogenizada. Las diluciones se realizaron en agua peptonada estéril al 0.1%,
243 de acuerdo con los protocolos microbiológicos básicos utilizados en
244 microbiología ambiental (Madigan et al., 2012). Posteriormente, se sembraron
245 0.1 mL de las diluciones 10⁻³ a 10⁻⁵ en medios sólidos específicos para cada
246 tipo de enzima: agar almidón (amilasas), agar celulosa (celulasas), agar leche

24
25 5
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28
247 (proteasas) y agar tributirina (lipasas). Las placas se incubaron a 37 °C durante
248 48 horas.
249
250 Para la detección de actividad hidrolítica, se aplicaron métodos de
251 revelado específicos. En el caso del agar almidón, se utilizó lugol, que forma un
252 complejo azul con el almidón no degradado; las zonas claras alrededor de las
253 colonias indicaron actividad amilolítica. En el agar celulosa, se aplicó una
254 solución de rojo congo al 0.2% durante 5 minutos, seguida de enjuague con
255 NaCl al 0.1 M, revelando zonas claras de hidrólisis donde hubo degradación de
256 celulosa. Estos métodos están basados en procedimientos descritos por Fu et al.
257 (2010).
258
259 Para la evaluación de la actividad, se midió el diámetro de los halos de
260 hidrólisis con una regla milimetrada, y se calculó el tamaño del halo usando la
261 fórmula:
262
263 C= A−B
264
265 donde A es el diámetro de la colonia más el halo, B es el diámetro de la
266 colonia, y C el diámetro del halo de hidrólisis.
267
268
269
270
Las colonias con halos 5 mm se seleccionaron para su descripción morfológica. Las observaciones m
271
272
273
274
275
276 RESULTADOS
277
278 Tabla 1.

Agar Dilución Nº de colonias UFC/mL o g totales

−4 86 5
Almidón 10 8.6∗10
−4 95 5
Celulosa 10 9.5∗10
−4 52 5
Leche 10 5.2∗10
−4 40 5
Tributirina 10 4.0∗10
279
280
281 Tabla 2.
UFC/mL o g con actividad hidrolítica
Agar Dilución Nº de colonias
−4 22 5
Almidón 10 2.2∗10
−4 27 5
Celulosa 10 2.7∗10

29
30 6
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33
−4 12 5
Leche 10 1.2∗10
−4 10 5
Tributirina 10 1.0∗10
282
283
284
285
286
287
288
289
290
291 Tabla 3.
Diámetro (mm) de halo
Colonias de interés Descripción Descripción
Medio de hidrólisis de las
macroscópica microscópica
colonias más
representativas **
Colonia 1 8 Circular, borde regular, blanca Cocos Gram positivos en
cadenas
Almidón
Colonia 2 6 Elevada, color crema Bacilos Gram positivos,
no esporulados

Colonia 3 5 Borde liso, centro elevado, Cocos agrupados en

translúcida tétradas

Colonia 1 10 Algodonosa, irregular, blanco- Micelio hialino con

grisáceo esporas terminales
Celulosa
Colonia 2 7 Filamentosa, aspecto seco Hifas septadas y conidios

Colonia 3 6 Plana, pigmentada, borde Hongos filamentosos con

difuso estructuras conidióforas

Colonia 1 5 Lisa, brillante, blanca Bacilos Gram negativos,

sin esporas
Leche
Colonia 2 7 Opaca, centro denso Cocos Gram negativos,
dispuestos en diplococos

Colonia 3 6 Borde ondulado, superficie Bacilos curvos,

mucosa tipo "coma"

Colonia 1 6 Mucosa, brillante, translúcida Cocos Gram negativos

aislados
Tributirina
Colonia 2 5 Amarillenta, centro Bacilos cortos, Gram
pigmentado positivos

Colonia 3 7 Irregular, rugosa, crema Levaduras con

gemación

292
293 DISCUCIÓN
34
35 7
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37 PEER-REVIEWED A
38
294
295 Se aislaron y cultivaron microorganismos mesófilos a partir de una muestra de suelo,
296 utilizando medios de cultivo específicos para detectar actividad enzimática de tipo
297 amilolítico, celulolítico, lipolítico y proteolítico. Después de la incubación a 37 °C
298 durante 48 horas, se realizó el conteo de colonias totales y aquellas con halos de
299 hidrólisis, como se muestra en las Tablas 1 y 2.
300
301 En el medio de agar celulosa, se recuperaron 95 colonias a partir de la dilución 10⁻⁴,
302 lo que correspondió a 9.5 × 10⁵ UFC/g. De estas, 27 colonias presentaron halos de
303 hidrólisis tras la tinción con rojo congo y tratamiento con NaCl, con diámetros iguales o
304 superiores a 5 mm. Esto indica una actividad celulolítica notoriamente alta, lo que
305 concuerda con lo reportado por Baldrian y Vendula (2008), quienes destacan que los
306 suelos ricos en residuos orgánicos albergan una diversidad importante de hongos
307 celulolíticos.
308
309 En el caso del agar almidón, se observaron 86 colonias, de las cuales 22 mostraron
310 halos tras el revelado con lugol, lo que equivale a 2.2 × 10⁵ UFC/g con actividad
311 amilolítica. Estas colonias se asociaron a morfologías típicas de bacilos y cocos Gram
312 positivos, los cuales son conocidos por su capacidad de degradar polisacáridos como el
313 almidón (Singh et al., 2019). Esto respalda la idea de que los suelos pueden contener
314 bacterias con aplicaciones potenciales en industrias como la alimentaria y la textil.
315
316
317
318
319
320 En los medios de agar leche y agar tributirina, que detectan actividad proteolítica y lipolítica respectivame
321
322
323
324
325
326 La Tabla 3 resume las características macroscópicas y microscópicas de las colonias
327 con mayor actividad hidrolítica. Las colonias en agar celulosa, particularmente la Colonia
328 1 (10 mm de halo), presentaron micelio denso y estructuras conidióforas, lo que sugiere
329 su pertenencia a hongos filamentosos capaces de secretar enzimas extracelulares. Estas
330 observaciones coinciden con estudios que destacan el rol de estos hongos en la
331 degradación de biomasa vegetal (Steffen et al., 2007).
332
333 Además, se constató que los halos de hidrólisis permitieron seleccionar de manera
334 eficiente aquellas colonias con mayor capacidad enzimática, siendo este un método
335 clásico y aún vigente en estudios de prospección microbiana (Fu et al., 2010). Como
336 resultado, se propusieron colonias candidatas para estudios posteriores de identificación
337 molecular y evaluación cuantitativa de la actividad enzimática en condiciones
338 fermentativas.
339

39
40 8
 41
42 PEER-REVIEWED A
43
340 La inclusión de tablas claras y completas fue clave para visualizar los resultados, tal
341 como se recomienda en publicaciones científicas como el ejemplo que pusieron las
342 tutoras tanto en la guía de laboratorio como en los ejemplos de cómo hacerlo.
343
344
345
346
347
348
349
350 CONCLUSIONES
351
352 1. Se confirmó que las muestras de suelo analizadas contienen una diversidad
353 microbiana relevante, con capacidad para producir enzimas de interés industrial,
354 especialmente celulasas y amilasas.
355
356
357
358 2. El medio de agar celulosa fue el que presentó mayor número de colonias con halos de hidrólisis 5 mm, lo
359
360
361
362 3. Las colonias con mayor actividad enzimática mostraron características
363 morfológicas compatibles con hongos filamentosos y bacterias Gram positivas, lo cual
364 respalda su potencial para la producción de enzimas extracelulares.
365
366
367 4. La metodología utilizada, basada en siembras seriadas y revelado con colorantes
368 específicos, resultó efectiva para el aislamiento y selección preliminar de
369 microorganismos hidrolíticos.
370
371
372 5. La evaluación visual de los halos permitió discriminar entre colonias con
373 diferente capacidad enzimática, siendo una herramienta práctica y confiable para estudios
374 de prospección microbiana.
375
376
377 6. La actividad proteolítica y lipolítica observada fue menor en comparación con la
378 actividad amilolítica y celulolítica, pero no por ello irrelevante, ya que se identificaron
379 colonias con halos superiores a 5 mm en estos medios.
380
381
382

44
45 9
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47 PEER-REVIEWED A
48
383
384 AGRADECIMIENTOS:
385
386 Queremos expresar nuestro más sincero agradecimiento a la Pontificia
387 Universidad Javeriana, por brindarnos el espacio, los recursos y la formación
388 académica que hicieron posible la realización de esta práctica. De manera
389 especial, agradecemos a nuestras tutoras, quienes nos apoyaron y guiaron en
390 cada etapa del proceso con paciencia, compromiso y dedicación. Su
391 acompañamiento incondicional y su calidad humana hicieron de esta experiencia
392 no solo un ejercicio académico, sino también un aprendizaje significativo y
393 enriquecedor. Valoramos profundamente el esfuerzo y el cariño con el que
394 comparten sus conocimientos con nosotros.
395
396
397 REFERENCIAS CITADAS:
398
399 Baldrian, P., y Vendula, V. (2008). Degradation of cellulose by basidiomycetous
400 fungi. FEMS Microbiology Reviews, 32(3), 501–521.
401 [Link]
402 • Cappuccino, J. G., & Sherman, N. (2008). Microbiology: A
403 Laboratory Manual (8th ed.). Pearson Benjamin Cummings.
404 • Fu, X., Liu, P., Lin, L., Hong, Y., Huang, X., Meng, X., & Liu, Z.
405 (2010). A novel endoglucanase (Cel9P) from a marine bacterium Paenibacillus
406 sp. BME-14. Applied Biochemistry and Biotechnology, 160(6), 1627–1636.
407 [Link]
408 • Madigan, M. T., Martinko, J. M., Dunlap, P. V., & Clark, D. P.
409 (2012). Brock Biology of Microorganisms (13th ed.). Pearson Education.
410 • Singh, R. S., Pandey, A., & Singh, T. (2019). Microbial enzymes—
411 An overview. En R. S. Singh, R. R. Singhania, A. Pandey, & C. Larroche (Eds.),
412 Biomass, Biofuels, Biochemicals: Advances in Enzyme Technology (pp. 1–20).
413 Elsevier. [Link]
414 • Steffen, K. T., Cajthaml, T., Šnajdr, J., & Baldrian, P. (2007).
415 Differential degradation of oak (Quercus petraea) leaf litter by litter-decomposing
416 basidiomycetes. Research in Microbiology, 158(5), 447–455.
417 [Link]
418
419
420
421 APPENDIX
422
423 A1. Fórmulas utilizadas
424 1. Cálculo de UFC/g
425
n de colonias contadas
426 UFC /mL o g = ∗Dilucin inversa
Volumen sembrado (mL)
427 2. Cálculo del halo de hidrólisis
428
429 C=A-B
430 Donde:
49
50 10
 51
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53
431
432 A = Diámetro de la colonia más el halo (mm)
433 B = Diámetro de la colonia (mm)
434 C = Diámetro del halo de hidrólisis (mm)
435
436
437
438
439
440 A2. Composición de medios de cultivo (g/L)
441
442 Agar almidón 1%
443 Almidón: 10.0
444 Extracto de levadura: 2.5
445 Peptona universal: 2.5
446 Sulfato de amonio: 0.5
447 Cloruro de calcio: 0.5
448 Fosfato monobásico de potasio: 0.1
449 Fosfato dibásico de potasio: 0.1
450 Agar-Agar: 15.0
451 pH final: 7.0 ± 0.2
452
453 Agar celulosa 1%
454 Carboximetil celulosa: 10.0
455 Extracto de levadura: 2.5
456 Peptona: 2.5
457 Sulfato de calcio: 0.5
458 Cloruro de calcio: 0.5
459 Fosfato monobásico de potasio: 0.1
460 Fosfato dibásico de potasio: 0.1
461 Agar: 15.0
462 pH final: 7.0 ± 0.2
463
464
465 A3. Observaciones de campo
466 Se observaron halos más definidos en las colonias cultivadas en agar celulosa,
467 especialmente en la Colonia 1 (halo de 10 mm).
468 Las colonias con halo en agar leche y tributirina fueron más escasas pero
469 detectables.
470 Se empleó tinta de Gram para las descripciones microscópicas.
471 El trabajo se realizó bajo condiciones estériles con buenas prácticas de
472 laboratorio.
473

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