PCR
Fases Descripción Elementos T° y tiempo
Desnaturalización Las dos cadenas de dsADN se separan en dos • ADN muestra T°= 94°C-98°C
inicial ssADN (cadenas molde) con la introducción de • Buffer de Reacción Tiempo=8 minutos
energía a través de calor.
Desnaturalización Las dos cadenas de dsADN se separan en dos • ADN muestra T°= 94°C-98°C
ssADN (cadenas molde) con la introducción de Tiempo=30 segundos
energía a través de calor.
Hibridación Una vez desnaturalizado la temperatura se • Cebadores directo y T°=Tm cebador más baja –
reduce, el dúplex se vuelve a asociar de una reversos específicos a la 5°C
manera específica de secuencia, donde se secuencia a amplificar. Tiempo = 30 segundos
forman dsADN específicos de secuencia corta •
mediante hibridación con dos oligonucleótidos
cortos, denominados cebadores.
Elongación Las secuencias de cebadores presentan un • Se requieren nucleótidos T°=72°C
grupo OH 3´libre a partir del cual la ADN de A, T, C, G Tiempo = depende de la
polimerasa en presencia de dNTPs y Mg+2 • Taq DNA polimerasa capacidad de extensión de la
puede iniciar la extensión de ADN en dirección • Mg+2 polimerasa y la extensión del
5´-3´usando cada cadena como molde. ADN
Amplicón = 2n
Elongación final Última elongación por la cantidad de ciclos • Se requieren nucleótidos T°=72°C
dada de A, T, C, G Tiempo=5 minutos
• Taq DNA polimerasa
Mg+2
Control Descripción
Positivo Reacción de PCR con un molde de ADN conocido que da como
resultado una amplificación exitosa en las condiciones de reacción
utilizadas.
Negativo Reacción de PCR sin muestras de ADN para demostrar la ausencia de
ADN contaminante en los productos químicos de reacción utilizados.
Una Tm muy baja conducirá a una
PCR hibridación inespecífica ya que
permitirá
apareamientos de regiones
homólogas (no idénticas) al molde
de ADN generando
productos de amplificación de
Problema Soluciones PCR inespecíficos.
Productos inespecíficos o “chorreado” ➢ Aumentar la T° de hibridación
➢ Reducir el magnesio
➢ Reducir la cantidad de molde
➢ Reducir la concentración de cebadores
➢ Usar el tiempo de elongación correcto
Dímeros de cebador ➢ Aumentar la T° de hibridación
➢ Reducir la concentración de cebadores
➢ Reducir el magnesio
➢ Diseño de nuevos cebadores
Paso a paso para armar un cebador Pasos previos: 1. Lisis celular, ej química con SDS
➢ De 15-30 bases de longitud 2. Purificación ADN
3. Cuantificación de ADN con fluorescencia
➢ Cebador directo y reverso 4. Evaluación de la integridad del ADN
➢ Siempre se presenta en dirección 5´-3´ 5. Purificar ADN de geles de electroforesis
➢ Tm entre 42-65°C Pasos post. : 1. Cuantificación y verificación amplicón.
➢ Diferencia entre Tm no mayores a 5°C 2. Se puede hacer qPCR y obviar paso (1)
➢ Evitar complementariedad de bases entre cebador directo y reverso
Si el fragmento o secuencia de ADN a amplificar se da como solamente la hebra 5´-3´:
➢ El cebador directo, La secuencia más cercana al extremo 5´ que esté dentro de nuestro gen, lo mejor posible desde 5´ y 15 o 30 bases
en dirección corriente abajo. Esta secuencia la escribo tal cual.
➢ El cebador reverso, en este caso, la secuencia que se encuentra en el gen, se plantea su secuencia complementaria 3´5´ y luego se
escribe en sentido 5´3´.
Si el fragmento o secuencia de ADN a amplificar se da como la hebra 5´-3´ y 3´5´:
➢ El cebador directo, La secuencia más cercana al extremo 5´ que esté dentro de nuestro gen, lo mejor posible desde 5´ y 15 o 30 bases
en dirección corriente abajo. Esta secuencia la escribo tal cual.
➢ El cebador reverso, efectuó el mismo procedimiento que el directo, pero viendo la secuencia más cercana al extremo 5´ de la secuencia
de abajo. La escribo en sentido 5´3´.
La reacción de PCR necesita un mínimo de dos cebadores: uno que se une a la
cadena antisentido (cebador directo) uno que se une a la cadena sentido
(cebador reverso).