Microorganismos: bacterias, hongos (mohos y levaduras), parásitos, virus.

→ Distintos grupos en los alimentos:

→ Fermentativos: beneficiosos para el hombre (lácteos, pan, vino, etc.).

→ Alteradores: causan deterioro de los alimentos (normalmente hongos filamentosos).

→ Patógenos: producen enfermedad transmitida por alimentos (ETA). Pueden producir

infecciones, intoxicaciones, toxiinfecciones.

→ Infecciones: hay un solo mo en el alimento, te lo comes y el mo se desarrolla en tu

cuerpo y produce la enfermedad, tiene un tiempo de incubación para que el mo se
multiplique en el tu cuerpo. Ej. La salmonella produce gastroenteritis.

→ Intoxicación: el mo está en el alimento y se multiplica en el alimento y produce

toxina en el alimento, te comes el alimento con la micotoxina.

→ Toxiinfecciones: aquellos que actúan por las dos vías.

→ Eucariotas:

→ Hongos (mohos y levaduras): deterioro, micotoxinas (patógenos), fermentaciones.

→ Procariotas:

​ → Bacterias: deterioro, fermentaciones, infecciones/intoxicaciones.

​ ​ → Gram+:

→ Esporulados: bastones.

→ Aerobios o AF (anaeróbios facultativos): bacillus sp. (deterioro),

B. cereus (patógeno o indicador).

→ Anaerobios: clostridium sp., C. botulinum (patógeno o indicador),

C. perfringens (patógeno o indicador).

​ ​ ​ → No esporulados: cocos o bastones.

→ Cocos: S. aureus (patógeno o indicador), Enterococcus sp.

(patógeno o indicador), Micrococcus sp. (deterioro), Streptococcus
sp. (deterioro, bacteria láctica fermentaciones).

→ Bastones: Listeria sp. (patógeno o indicador), Lactobacillus sp.

(deterioro, bacteria láctica fermentaciones).

​ ​ → Gram-:

→ Enterobacteriaceae: bastones, no esporulados, anaerobios facultativos.

→ E. coli -Salmonella sp. (patógeno o indicador), Cronobacter

sakazakii (patógeno o indicador), Erwinia sp. (deterioro).

→ Pseudomonadaceae: bastones, no esporulados, aerobios.

 → Pseudomonas sp. (deterioro), P. aeruginosa (patógeno o
indicador).

→ Otros: Vibrio sp. (patógeno o indicador), Campylobacter sp. (patógeno o

indicador).

Análisis microbiológicos de los alimentos:

→ Permite evaluar en forma rutinaria:

→ Inocuidad: ausencia de patógenos.

→ Eficiencia tecnológica: determinar si un proceso dado está bien realizado.

→ Vida útil.

→ Microorganismos indicadores:

→ Su detección es mucho más fácil, rápida, segura y económica que la determinación de

microorganismos patógenos.

→ Permiten monitorear la calidad microbiológica de los alimentos en forma rutinaria.

→ Grupos de microorganismos que indican deficiencias microbiológicas en relación a su

procesado, manipulación y/o conservación. Ej: coliformes (indicadores de calidad
alimentaria). No necesariamente dicen que el organismo tiene patógenos, no dice nada de la
insalubridad del alimento.

→ Microorganismos cuya detección indica la posible presencia de patógenos ecológicamente

relacionados. Ej: E. coli. (indicadores de inocuidad alimentaria). No son patógenos.

→ Microorganismos indicadores de calidad alimentaria:

→ Evaluación del número total de microorganismos y/o su actividad metabólica en

el alimento (BAM) “utilidad” (contaminación general, deterioro incipiente, reducción
de vida útil).

→ Indicadores de eficiencia del tratamiento tecnológico o de recontaminación o de

almacenamiento (coliformes). Más específicos.

→ Coliformes: fermentadores de lactosa con producción de gas a 37 grados.

Sensibles al calor a 60 grados muere, no tienen resistencia a los desinfectantes.

→ Criterios para ver si es bueno como indicador de calidad:

→ Estar presentes en los alimentos a evaluar (que estén en el alimento de

entrada).

→ Ser fácilmente detectables para ser contados, y diferenciarse de otros

microorganismos.

→ Poder ser enumerados en breve tiempo (24 a 48 hs).

→ La microbiota normal de alimento no debe interferir en el crecimiento del

indicador.

→ No tiene que tener las mismas formas de crecimiento.

→ Microorganismos indicadores de inocuidad alimentaria:

→ Indicadores de potencial contaminación fecal o humana o posible presencia de

patógenos (E. coli) “mo índice”.

→ Criterios:

→ Detectable y diferenciable en forma fácil, rápida y segura.

→ Estar siempre presente cuando se encuentre el patógeno de interés.

→ Poseer velocidad de crecimiento y necesidades nutricionales iguales a la

del patógeno.

→ Tener una tasa de muerte paralela a la del patógeno y mayor persistencia

que el patógeno en cuestión (porque si mato al indicador se que mate al
patógeno).

→ Presentar mayor resistencia a los desinfectantes que los patógenos en

cuestión.

→ Indicadores fecales: especificidad, alto N° en heces, resistencia al medio

extraintestinal.

→ Grupo de mo indicadores:​

→ Recuento de bacterias (o mo) aerobias mesófilas:

→ Características higiénicas generales del alimento (alim. no perecederos).

→ Perfil tiempo-temperatura de almacenaje (en alimentos perecederos).

→ Recuento de bacterias (o mo) anaerobias mesófilas.

→ Recuento de bacterias aerobias/anaerobias termófilas.

→ Recuento de bacterias esporuladas.

→ Recuento de bacterias psicrófilas.

→ Recuento de enterobacterias totales (de calidad pero de eficiencia tecnológica).

→ Recuento de coliformes (de calidad pero de eficiencia tecnológica):

→ Enterobacteriaceae: fermentan lactosa (ácido y gas); hábitat intestinal

(fecal) o medio ambiental (agua, suelo, vegetales – no fecal).

→ Sensibles a tratamientos tecnológicos (temperatura - desinfectantes).

Indicador de eficiencia de tratamiento tecnológico: fallas de procesado,

recontaminación, falta de refrigeración, inadecuada potabilización.

No tienen relación con contaminación fecal o presencia de patógenos.

→ Recuento de coliformes fecales (de inocuidad).

→ Recuento de enterococos (de calidad pero de eficiencia tecnológica).

 → Recuento/investigación de Escherichia coli (de inocuidad):

​ → Indicador fecal muy sensible (contaminación reciente).

→ Indicador de probable presencia de patógenos ecológicamente entéricos

relacionados: Salmonella, Shigella, Vibrio, virus entéricos. Inadecuado
tratamiento tecnológico.

→ Recuento de Staphylococcus aureus coagulasa (+):

→ Indicador de potencial contaminación por manipulación humana o

presencia de patógenos (microbiota propia de piel y vías respiratorias en
humanos – animales enfermos, en baja cantidad).

→ Indicador de recontaminación-falta de refrigeración en alimentos

procesados y/o manipulados.

→ Recuento de anaerobios (clostridium) sulfito reductores.

→ Recuento de mohos y levaduras.

→ Recuento de deteriorantes: bacterias lipolíticas – b. Proteolíticas.

→ Métodos:

Recuento microscópico directo:

→ Contar partículas en un volumen dado usando una célula de

Petroff-Hauser o de Neubauer (portaobjetos modificado en el que
una rejilla permite conocer el volumen que se observa).

→ Procedimiento barato, rápido y sencillo.

→ No se requiere material estéril.

→ No distingue células vivas - células muertas.

→ 0,01 ml - 100.000 mo/ml.

→ Sistemas Coulter Counter (automático):

→ Sencillo y rápido.

→ Diferencia de conductividad.

→ Permite determinar el número de partículas presentes en una

suspensión y la distribución de sus tamaños.

→ No distingue entre células vivas y muertas ni entre células y agregados de

material insoluble presente en la suspensión del cultivo.

→ Turbidimetría:

→ Turbidez proporcional a la masa de las partículas en

suspensión (células vivas o muertas).

→ Espectrofotómetro (medir absorbancia de luz).

 → Longitud de onda 550 - 600 nm.

→ Densidad óptica.

→ Sencillo.

→ No distingue entre células vivas y muertas.

→ No detecta densidades < a 10.000 células/ mililitros.

→ Medida de Peso Seco:

→ Consiste en la filtración del cultivo a través de una membrana que retenga las
células y su posterior desecación hasta peso constante. No diferencia células vivas de
muertas. Sensibilidad limitada.

→ Medida de ATP:

→ Medida relativamente sencilla basada en la emisión de luz por la luciferasa de

luciérnaga (Photimus pyralis) en presencia de O2 y de ATP. Mide la concentración de
ATP en un volumen o superficie dada. La concentración de ATP decae rápidamente en
las células muertas, por lo tanto, es medida indirecta detecta únicamente las células
vivas (estimación).

Medida de Actividad Metabólica

Recuento de células viables

Recuento en Placa

NMP (número más probable).

Filtración por membrana

→ Mo indicadores:

→ Verificar si el contenido en determinado tamaño de unidad de muestra analítica

encuadra dentro de los límites cuantificables establecidos (implica contar o estimar
cantidades), (células totales, células viables, masa microbiana, metabolitos o
componentes celulares).

→ Métodos cuantitativos (recuento):

→ Directos: recuento en placa, FM.

→ Indirectos: NMP, absorbancia.

→ Verificar ausencia en determinado tamaño de unidad analítica ( 0,1; 1,0; 10; 100
gramos o ml). Implica determinar la presencia o ausencia del microorganismo
buscado (investigación).

→ Métodos cualitativos (investigación): enriquecimiento, aislamiento e

identificación. Si está presente o no. Es decir si quiero saber si hay presencia
o ausencia de un mo, lo aisló en las condiciones de crecimiento del mo que
busco y luego lo analizo y veo si hay, ya que este se reproducirá.
 → Patógenos: demostrar ausencia en determinada cantidad de muestra (en 25; 50; 100
gramos o ml). Ej. salmonella shigella, etc.

→ Métodos cualitativos (investigación):

→ Enriquecimiento no selectivo (caldo): recuperación celular.

→ Enriquecimiento selectivo (caldo): controlar competidores.

→ Método Convencional (referencia):

→ Aislamiento (placas).

→ Identificación bioquímica.

→ Pruebas complementarias (antisueros).

→ Métodos rápidos:

→ ELISA, Inmunocaptura, sondas ADN, PCR.

​ ​ → Detección de Salmonella:

​ ​ ​ → 1. Enriquecimiento no selectivo.

→ 2. Enriquecimiento selectivo.

→ 3. Siembra en placa de medios sólidos selectivos-diferenciales.

→ 4. Estudio de características bioquímicas.

→ 5. Análisis antigénico.

→ Recuento: es para indicadores, solo en algún caso puede ser para patógenos (cuantitativo).

→ Investigación: se usa generalmente para patógeno y en algunos casos para indicadores más que
nada de calidad (cualitativo).

Medios de cultivo.
→ Soluciones acuosas (líquidas o gelificadas) que contienen, en concentraciones adecuadas, los
nutrientes necesarios para el crecimiento de los microorganismos de interés.

AGUA + C + N + (macro-micro) + F. Crecimiento

→ Clasificación:

→ Según consistencia: líquidos, semisólidos, sólidos.

→ Según composición.

→ Según función: muchos medios pueden cumplir más de una función a la vez,
predominando muchas veces alguna de ellas.

→ Generales: no selectivos, líquidos o sólidos.

→ Tienen los nutrientes necesarios para el crecimiento de la mayoría de los

microorganismos no exigentes.

→ Utilizados principalmente para realizar recuentos microbianos.

→ Ej. Tripticasa Soya Agar (TSA): Peptonas de caseína y de soja, cloruro de

sodio, agar; Plate Count Agar (PCA - APC): peptona de caseína, glucosa,
extracto de levadura y agar.

→ De Enriquecimiento: selectivos o no, Líquidos.

→ Aumentar la cantidad de los microorganismos que se buscan, a niveles

detectables.

→ Líquidos: en NMP (recuento) y en métodos cualitativos.

→ Algunos suelen ser selectivos para inhibir la microbiota acompañante.

→ Ej: Caldo Mac Conkey sus agentes selectivos son las sales biliares y cristal
violeta.

→ Selectivos: la mayoría líquidos.

→ Medios orientados a la búsqueda de un grupo o microorganismo

específico, que contiene agentes de selección que inhiben el desarrollo de la
microbiota acompañante.

→ Agentes selectivos:

→ Ácidos.

→ Sales: afectan a las gram negativas. Puede ser cloruro de litio,

telurito de potasio, etc.

→ Colorantes: afectan a las gram positivas. Puede ser verde

brillante o cristal violeta.

→ Inhibidores respiratorios

→ Antimicrobianos (antibióticos): afectan a un amplio espectro.

Pueden ser ampicilina, cloranfenicol, etc.

→ Agentes tensioactivos: afectan a las gram positivas. Pueden ser

la sales biliares, etc.

→ Temperatura – Anaerobiosis - pH.

 → Bilis.

→ Diferenciales: la mayoría sólidos.

→ Permiten ver una reacción bioquímica, como indicador de ph.

→ Tienen componentes específicos (indicadores) que permiten distinguir

visualmente distintos tipos de microorganismos que crecen en el medio por
su diferente comportamiento frente a estos componentes.

→ Ej. indicadores ácido-base, colorantes, campanas de Durham, lecitina,

indicadores de H2S, yema de huevo, sangre.

→ Nuevos agentes diferenciales son los sustratos cromogénicos, ponen en

evidencia alguna reacción bioquímica.

Especificación microbiológica (límites) y metodologías:

→ Concentración máxima de microorganismos o toxina que se utiliza para determinar la

aceptabilidad del alimento.

→ Criterios microbiológicos de aceptación:

→ Estándar o norma: criterio obligatorio que forma parte de una ley u ordenanza (CAA -
MERCOSUR - SENASA).

→ Directriz o recomendación: criterio aconsejado por autoridad responsable de control, por

asociación o por fabricante, para indicar lo que se puede esperar si se aplican BPM.

→ Especificación: acuerdo entre comprador y vendedor, no son penalizadas y están dentro

del CAA.

→ Modelos de “límites”:

→ Tradicional: alimentos dietéticos - CAA Art. 1340. Que tengo que buscar y cuanto tiene
que haber de ese mo en el producto.

→ Planes de atributos: leche en polvo - CAA Art. 567. Planes de tres clases es porque puede
ser aceptable,marginalmente aceptable o no aceptable.

→ n: es la cantidad de muestras analizadas.

→ m: es el mínimo que puede dar (m=0 es

ausencia).

→ M: es el máximo que puede dar.

 → c: es el número máximo de muestras cuyos resultados pueden estar comprendidos
en el rango entre m y M.

→ Metodologías:

→ Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (“CM”) (APHA:

American Public Health Association).

→ FDA: Food and Drug Administration.

→ BAM: Bacteriological Analytical Manual.

→ AOAC: Association of Official Analytical Chemists. “Official Methods of Analysis”.

→ ICMSF: International Commission on Microbiological Specifications for Foods.

→ IDF/FIL: Federación Internacional de Lechería International Dairy Federation.

→ ISO: International Organization for Standarization.

Reglas de seguridad para el trabajo en laboratorio (operador, ambiente,

producto).
→ Filtración de aire Filtros HEPA (High Efficiency Particulate Air):

→ Compuestos por pliegues de acetato de celulosa, usados para filtración de aire.

→ Remoción de hasta el 99,97% de partículas mayores de 0,3 micrones de diámetro.

→ Cabinas de flujo laminar y gabinetes de seguridad biológica.

→ Cabina de Flujo Laminar Horizontal: protege la muestra, no al operador.

→ Gabinetes de seguridad biológica:

→ Tipo I: gabinete de presión negativa con ingreso de aire por abertura frontal. Aire
egresado al exterior después de pasar a través de filtro HEPA. Protege al operador y al
ambiente pero no al producto.

→ Tipo II: diseño que protege.

→ Operador: posee presión negativa e ingresa aire por su parte anterior.

→ Producto: flujo laminar hacia abajo de aire filtrado con HEPA.

→ Ambiente: el aire se elimina después de pasar a través de un filtro HEPA.

→ Tipo III: mayor nivel de protección al operador, al producto y al ambiente.

→ Herméticamente cerrados.

→ Guantes sellados a pared frontal de la cabina.

→ Presión negativa - Aire ingresante pasa a través de filtro HEPA.

→ Aire egresante pasa por dos filtros HEPA colocados en serie o a través de un filtro
HEPA y posterior tratamiento con calor.
→ Cabina de Seguridad Biológica Clase II (con Flujo Laminar Vertical): protege la muestra, el
operador y el medio ambiente.

→ Higiene y orden personal:

→ Evitar abrir las placas de Petri de recuento en placa. Las bacterias presentes en pequeño
número en el alimento se multiplican significativamente en la placa de cultivo y pueden
provocar una infección por inhalación.

→ Una vez finalizada la tarea debe prepararse el material para su esterilización y limpieza
con el mismo cuidado con que se trabajó:

→ Colocar los frascos vacíos en los fuentones plásticos de color blanco destinados
para limpieza.

→ Colocar las placas de Petri en bolsas de descontaminación para autoclave para

luego ser descontaminadas.

→ Colocar los tubos de ensayo usados en canastos metálicos para luego ser
descontaminados. Colocar las pipetas en la solución desinfectante para luego ser
lavadas.

→ Colocar los portaobjetos en un recipiente con alcohol al 70 %. Colocar los

portaobjetos destinados a la realización de pruebas serológicas (Ej: Salmonella y
Escherichia coli O157:H7) en la solución desinfectante.

Análisis microbiológico de alimentos (etapas).

→ Muestreo:

→ Objetivo: obtener muestras representativas del lote o partida de alimento.

→ Etapas:

→ 0. Elección de plan de muestreo.

→ 1. Recolección de la muestra:

→ Recipientes y utensilios.

→ Procedimiento y Etiquetado.

→ Extracción o toma de muestras para análisis de rutina: muestras

acondicionadas e identificadas correctamente, consignando los siguientes
datos:

→ Nombre del producto.

→ Marca del producto.

→ Datos de la firma elaboradora.

→ Fecha y hora de extracción de la muestra.

→ Datos del rótulo (RNPA, RNE, Nº de Lote).

→ Hacer constar la cantidad existente en cada muestra.

 → Condiciones en las que se extrae la muestra.

→ Fecha de elaboración y vencimiento.

→ Temperatura en el momento de la recolección.

→ 2. Almacenamiento intermedio y transporte:

→ Rapidez y hermeticidad de envase.

→ Contaminación cruzada y Temperatura.

→ Mantenimiento y envío al laboratorio:

→ Envío de muestras evitando toda demora en la recepción del

Laboratorio, en envases y métodos de conservación que aseguren
una idéntica calidad, sanidad y temperatura a la verificada en el
momento de extracción.

→ Alimentos refrigerados y congelados: deben mantenerse en esas

condiciones hasta la realización de los análisis correspondientes.

→ Por ello, se debe disponer de áreas para refrigeración (0 a 4,0 ºC)

o congelamiento (-20 ºC).

→ Productos desecados o enlatados no requieren refrigeración.

→ Extracción y traslado de muestras: auditor o personal idóneo.

→ Si el Laboratorio se encuentra a distancias alejadas: extremar

medidas de seguridad e inviolabilidad.

→ Toma de muestra de agua para análisis microbiológico:

→ Limpiar la canilla con cepillo si es necesario. Abrirla y dejar correr

el agua un minuto.

→ Cerrar el grifo y desinfectar con etanol 70 %. Si es metálico,

flamear unos minutos con hisopo embebido en alcohol encendido o
con encendedor.

→ Abrir la canilla y dejar correr agua durante algunos minutos.

Mientras tanto preparar el frasco estéril de 500 cm3 (se compra en la
farmacia)

→ Sosteniendo el frasco desde el fondo con una mano, se destapa

con la otra justo al lado del chorro de agua y, teniendo cuidado de no
tocar la boca ni el interior del frasco, se da vuelta, se llena
completamente con el agua y se tapa en forma inmediata, cerrando
luego la canilla.

→ Rotular el frasco: remitente – fecha y hora de toma de muestra –

lugar de toma – origen del agua (red, pozo, etc.)

→ Remitir a la brevedad al laboratorio o conservar en heladera (4 –

10 °C) hasta llevarlo. Plazo máximo de 24 h.
 → 3. Recepción de muestras:

→ Fecha, descripción y estado de la muestra.

→ Temperatura.

→ Preparacion de unidad analitica:

→ Líquido - Sólido:

→ Homogenato: poner 1 porción de alimento en 9 de un

diluyente y lo someto a un tratamiento mecánico para su
disgregación (dilución 1 en 10).

→ Asepsia.

→ Mezclado.

→ Estado de la muestra.

→ Tamaño de unidad de analítica .

→ Equipos y materiales:

→ Stomacher o licuadora mecánica (bolsas y vasos).

→ Balanza de 2000 g de capacidad ( 0,1 g).

→ Utensilios y pipetas (1- 10 ml) estériles.

→ Solución diluyente apropiada.

→ Preparación del homogenato:

→ Pesar asépticamente bajo flujo laminar 10 g de muestra.

→ Adicionar 90 ml de agua de peptona al 0,1 % (dilución 1/10).

→ Homogeneizar en Stomacher 2 minutos a potencia media.

→ Recuentos: técnica de dilución (“diluciones seriadas”).

→ Diluciones seriadas (de 10-1 a 10-5 según el grado de contaminación supuesta)

con el mismo diluyente AP al 0,1%.

→ Agitar continuamente el líquido (vortex).

→ Transferir con rapidez las alícuotas para evitar la sedimentación.

→ Análisis propiamente dicho, recuentos de mo:

→ Etapa inicial en los 3 métodos: hacer diluciones de la muestra y sembrar alícuotas en

medio de cultivo (sólido o líquido).

→ Recuento de células viables:

→ Recuento en Placa.
 → NMP.

→ Filtración por membrana.

→ Recuento en placa: recuento de microorganismos aerobios mesófilas.

→ Técnicas de recuento en placa:

→ Colocar en un medio de cultivo agarizado un volumen determinado de

muestra.

→ Cada célula originará una colonia, el número de colonias permite estimar

el número de células presentes en la muestra sembrada (ufc/cantidad de
muestra).

→ Siembra en superficie (extender volumen de muestra sobre el medio de

cultivo sólido) o en profundidad (mezclar volumen de muestra con el medio
de cultivo antes que solidifique).

→ Recuento en placa – siembra en profundidad:

→ Materiales:

→ 1. Placas de Petri estériles.

→ 2. Pipetas graduadas estériles (descartables o de vidrio).

→ 3. Diluyentes (ej. agua de peptona al 0,1 %), medio de

cultivo agarizado ( ej. PCA).

→ 4. Muestra a ser analizada (líquida u homogenato).

→ Equipos:

1. Balanza granataria.

2. Flujo laminar.

3. Stomacher.

4. Vortex.

5. Estufa de incubación a 30 – 37 °C.

6. Baño termostático para mantener medios de cultivo

agarizados a 45 °C.

7. Microondas o baño marÍa para fundir medios de cultivo.

→ Siembra: 1 ml de la dilución en el fondo de la caja de Petri y

distribuir el medio de cultivo sobre ella. Por duplicado.

→ Recuento de microorganismos viables (totales) mediante

siembra en profundidad: (siembra e incubación).

→ Fundir el Agar PCA en horno a microondas y templarlo a

45 ºC 1 ºC en baño termostático. La temperatura del medio
 de cultivo se debe controlar cuidadosamente a fin de evitar
la lesión o muerte de microorganismos una vez que el agar
sea vertido sobre la muestra.

→ Seleccionar las diluciones a sembrar de manera tal de

obtener placas que presenten entre 30 y 300 colonias, de
acuerdo con nivel esperado de microorganismos (si se
desconoce el nivel aproximado de moo).

→ Tomar 3 placas estériles y transferir (en cada una) 1 ml de

las tres diluciones seleccionadas.

→ Verter aproximadamente 15 ml de PCA fundido y

templado en las placas de Petri. Mezclar inmediatamente la
dilución con el medio fundido por medio de movimientos
uniformes de rotación hacia ambos lados y en cruz. Permitir
solidificar.

→ Una vez que el agar haya solidificado, invertir las placas e

incubarlas en estufa a 30 - 37 1 ºC durante 24 – 72 horas.

→ Recuento en placa – siembra en superficie:

→ Siembra: 0,1 ml de la/s dilución/es y se extiende por la superficie

con una espátula triangular de vidrio. Por duplicado.

→ Técnica de siembra en placa en superficie:

→ 1. Colocar el inóculo en la placa de Petri que ya contiene

el medio de cultivo agarizado.

→ 2, 3. Esterilizar el asa de vidrio.

→ 4. Extender el inóculo en la placa.

 → Recuento de colonias de microorganismos viables (lectura de placas):

→ Recuento de microorganismos viables en placa (ICMSF): cálculo del recuento en

placa (siembra en profundidad, 1 ml): entre 30 y 300.

→ Elegir la/s placa/s, correspondiente/s a diluciones que presenten entre 30

y 300 colonias.

→ Contar las colonias de cada placa y multiplicar por el factor de dilución (la
inversa de la dilución cuyas placas han sido seleccionadas para recuento)
(ejemplo 1).

→ Si hubieran sido 2 placas en la misma dilución (duplicado), previamente

hallar la media aritmética (promedio) del número de colonias de ambas
placas (ejemplo 2).

→ Cada ejemplo es una muestra y cuando hay dos en un ejemplo es porque

hay duplicados.

Ej Dil. 1/100 Dil. 1/1000 Ufc/g

1 234 28 23000

2 175 26 19000

208 27

191,5 x f.d. Expresar los resultados con 2 cifras significativas.

→ Cálculo del recuento en placa (otro ejemplo):

→ Si dos diluciones consecutivas presentan entre 30 y 300 colonias, hallar los

recuentos en placa de cada dilución y se dará como resultado la media
(promedio) de los dos valores obtenidos (ejemplo 1), a no ser que uno de
ellos sea superior al doble del otro, en cuyo caso dar como resultado el valor
más bajo (en vez de que sea 32000 queda el de 14000) (ejemplo 2).

→ Si una de las placas de la dilución elegida presenta algo menos de 30 o

algo más de 300, contar también todas las colonias, hallar la media y
multiplicarla por el factor de dilución (ejemplo 3).

Ej Dil. 1/100 Dil. 1/1000 Ufc/g

1 293 41 35000

2 140 32 14000

→ Cálculo del recuento en placa (estimado), ninguna entre 30 y 300:

 → Cuando ninguna de las placas de una misma dilución tiene entre 30 y 300
colonias, pero una o más tienen más de 300 colonias, usar para el cómputo
final la/s placa/s de la dilución que tenga el número de colonias más cercano
a 300 (ejemplo 1). Si son más de una hago promedio.

→ Si las placas de todas las diluciones tienen menos de 30 colonias, registrar

el número de colonias de la placa de la menor dilución y expresarlo como
recuento total/ml estimativo (ejemplo 2).

→ Si las placas de todas las diluciones de una muestra no presentan colonias

y no se detectaron en ellas sustancias inhibitorias, expresar los resultados
como menos de 1 por la inversa de la menor dilución (ejemplo 3).

Ej Dil. 1/100 Dil. 1/1000 Ufc/g

1 355 - 34.000 (est)

325 25

2 18 2 1800 (est.)

3 0 0 Menos de 100

→ Si se hubiera sembrado menos de 1 ml por placa, debe considerarse en el cálculo

de ufc el “factor volumen”.

→ En la dilución que corresponda:

Promedios Nº colonias de las placas x Factor de dilución (inversa de dilución,

10-2 → 100) x Factor volumen (inversa de Volumen 0,1 ml → 10).

→ Si hay que contar 2 diluciones:

→ Calcular el promedio de cada una de ellas (con [Link]ón y

[Link]).

→ Calcular el promedio entre ambas.

→ Expresar este último promedio con 2 cifras significativas.

→ Recuento de microorganismos viables en placa (forma de contar alternativa):

→ Entre 25 y 250 colonias se cuentan (mediante la fórmula BAM).

→ Recuento de microorganismos en placa:

→ Casos:

→ Recuento (dentro del rango):

→ ICMSF: 30 - 300.

→ BAM: fórmula - placas dentro del rango 25 - 250.

→ Recuento estimado (< o > al rango):

→ > al rango (ICMSF): si hay más de 200 ufc en 1/8 placa, >
1600 x fd

→ < al rango (ICMSF): considera el n° de colonias, o < a 1

por fd de < dilución.

→ > al rango (BAM):

→ < al rango (BAM):

→ Expresión de resultados:

→ Expresar el resultado de recuento de microorganismos viables en

unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro de alimento (u.f.c./g o
ml).

→ Límite de detección:

→ Profundidad: 10 ufc/g (sólidos c/homogenato) o 1 ufc/ml

(líquidos s/homogenato).

→ Superficie: 100 ufc/g (sólidos c/homogenato) o 10 ufc/ml

(líquidos s/homogenato).
 → Fuentes de error:

→ Colonias formadas a partir de células individuales o cúmulo de células.

Colonias difusas.

→ No crecimiento de colonias por condiciones experimentales (medio –

temperatura – atmósfera).

→ Errores en la medida de la unidad analítica y en el conteje de colonias

(fatiga, difusión).

→ Esterilización incompleta o recontaminación de materiales de laboratorio

utilizados. Asepsia en el área de trabajo. Accidentes de laboratorio.

→ Presencia de sustancias inhibitorias (material de vidrio, diluyente,

productos).

→ Partículas en suspensión en las diluciones más bajas → TTC (Cloruro de

Tetrazolio o de trifeniltetrazolio).

→ Recuento de Bacterias Viables utilizando filtros de membrana (0,45 m):

→ Cada colonia sobre el filtro proviene a partir de una célula viva.

→ Alta sensibilidad (1 – 100 ml).

→ Buena reproducibilidad.

→ Rápido.

→ Requiere equipo de filtración - filtros.

→ Procedimiento en laboratorio:

→ 0. Limpieza y desinfección de área de trabajo: ordenamiento de materiales.

→ 1. Fluidificación del medio: (microondas, vapor fluente) y mantenimiento a

temperatura 44-46 °C (profundidad). Superficie: preparación y secado de placas.

→ 2. Rotulado de materiales de recuento: placa de petri, tubos, envases (bolsas,

erlenmeyers, etc) número de muestra, dilución, fecha, otra información (nombre de
medio de cultivo).

→ 3. Preparación del homogenato.

→ 4. Diluciones.

→ 5. Siembra.

→ 6. Agregado de Medio.

→ 7. Incubación.

→ 8. Recuento de colonias.

→ 9. Cálculo y Reporte de Resultados.

→ Reporte de resultados(protocolo):

→ Documento legal que acredita el resultado y conclusiones del análisis efectuado por el
Laboratorio.

→ Firmado por el profesional responsable del laboratorio.

→ Datos y especificaciones técnicas del análisis realizado.

Agua potable.
→ Potable significa: libre de microorganismos patógenos, y de minerales y sustancias orgánicas que
puedan producir efectos fisiológicos adversos. Estéticamente aceptable y, por lo tanto, libre de
turbidez visible, color y sabor objetables y poseer una temperatura razonable para los fines
propuestos. Podrá ser ingerida o utilizada en el procesamiento de alimentos sin temor por los efectos
nocivos que pueda producir sobre la salud.
Indicadores microbianos de calidad:
→ Hay indicadores de calidad e indicadores de inocuidad.
→ Tanto el recuento de bacterias mesófilas como el recuento de coliformes son indicadores de
calidad (eficiencia tecnológica).
→ A su vez E. coli es además un indicador de inocuidad por ser indicador de contaminación fecal.
→ E. coli: indicador de contaminación fecal (indicador de inocuidad).
→ Fácilmente detectable por métodos analíticos simples.
→ No debe crecer en agua.
→ Persistencia en agua similar a patógenos.
→ Remoción por tratamiento similar a patógenos.
→ Pertenece a los Coliformes Termotolerantes.
→ Requiere identificación bioquímica.
→ Origen (hábitat) intestino del hombre y animales de sangre caliente en alta concentración
(+/- 109 UFC/gramo).
→ Su presencia en alimentos indica:
→ Contaminación fecal (indicador fecal muy sensible). Indica contaminación reciente.
→ Indicador de probable presencia de patógenos ecológicamente relacionados
(entéricos: Salmonella, Shigella, Vibrio, virus entéricos).
→ Inadecuado tratamiento tecnológico.
→ Coliformes (totales):
→ Hábitat: intestinal (fecal) y medio ambiental (agua, suelo, vegetales, etc. – no fecal).
→ Sensibles a tratamientos desinfectantes.
→ Indicador de: inadecuada potabilizada recontaminación.
→ Resistencia a sales biliares – Fermentación de Lactosa con producción de gas 37 °C – 48 h.
 Patógeno hídrico:
→ Pseudomonas aeruginosa:
→ Características:
→ Bacilo Gram negativo, no fermentador (TSI), oxidasa positivo, móvil (flagelo
polar), produce pigmentos, no esporulado.
→ Patógeno oportunista.
→ Muy diseminado en el medio ambiente.
→ Moderada resistencia a la cloración.
→ Su presencia en agua indica:
→ Contaminación durante el procesado (agua envasada).
→ Crecimiento en las instalaciones.
→ Riesgo de infección (agua recreacional).
→ Indicador de eficiencia de cloración.
→ Bacterias mesófilas (heterótrofas):
→ Características:
→ Grupo heterogéneo que se desarrolla en medios complejos.
→ Un recuento elevado indica:
→ Tratamiento de potabilización ineficiente.
→ Crecimiento microbiano en las instalaciones (cañerías, tanques, etc.).
→ De acuerdo a la temperatura de incubación se puede inferir su origen.

→ Agua potable: CAA Art. 982.

→ En la evaluación de la potabilidad del agua ubicada en reservorios de almacenamientos
domiciliarios entre los parámetros microbiológicos a controlar deberá incluirse el Recuento
de bacterias mesófilas en APC durante 24h a 37°C.
→ En el caso que el recuento supere las 500 ufc/ml se deberá exigir la higienización del
reservorio y un nuevo recuento.
→ No es obligatoria la presencia de cloro activo.
Toma de muestra de agua para análisis microbiológico:
→ Limpiar la canilla con cepillo si es necesario. Abrirla y dejar correr el agua un minuto.
→ Cerrar el grifo y desinfectar con etanol 70%. Si es metálico, flamearlo unos minutos con hisopo
embebido en alcohol encendido o con encendedor.
→ Abrir la canilla y dejar correr agua durante algunos minutos. Mientras tanto preparar el frasco
estéril de 500 cc (se compra en la farmacia).
→ Sosteniendo el frasco desde el fondo con una mano, se destapa con la otra justo al lado del chorro
de agua y, teniendo cuidado de no tocar la boca ni el interior del frasco, se da vuelta, se llena
completamente con el agua y se tapa en forma inmediata, cerrando luego la canilla.
→ Rotular el frasco: remitente – fecha y hora de toma de muestra – lugar de toma – origen del agua
(red, pozo, etc.).
→ Remitir a la brevedad al laboratorio o conservar en heladera (4 – 10°C) hasta llevarlo. Plazo
máximo 24 hs.
Recuento de bacteria mesófilas:
→ Método de recuento en placa para agua potable: muestra 0,1 ml y 1 ml
→ Agregar 12 - 15 ml de agar PCA fundido y enfriado a 45 - 47 ºC, homogeneizar, dejar
solidificar. Incubar a 37 ºC las placas invertidas durante 24 hs.
→ Contar las colonias en cada placa, promediar el resultado, multiplicar por f.d.
→ Expresar como: ufc/ml.

Recuento de coliformes NMP:

→ Método APHA (parte 1):
→ Muestra:
→ Inocular 10 ml de muestra en cada uno de los 10 tubos de Caldo Lauril Triptosa
(CLT) doble concentración con campanita de Durham.
→ Incubar en estufa o baño termostatizado a 35 - 37 ºC durante 24 hs.
→ Confirmar los tubos positivos (turbidez + producción de gas en CLT) transfiriendo
un ansa a tubos de Caldo lactosa-bilis-verde brillante (BRILLA) con campanita de
Durham.
→ Incubar 48 hs a 35 - 37 ºC.
→ Método APHA (parte 2):
→ Incubar 48 hs a 35 - 37 ºC.
→ Leer los tubos positivos (crecimiento y producción de gas). Con el número de tubos
positivos de cada dilución calcular el NMP utilizando la tabla.
→ Ej. Tubos positivos (confirmados): 3 (tres) Resultado: NMP 3,6 / 100 ml.
→ En caso de no obtenerse desarrollo el resultado se expresa < 1,1/100 ml.

→ Caldos selectivos para coliformes:

→ La técnica del número más probable (NMP) se basa en la obtención de resultados

positivos o negativos en una o más diluciones decimales de la muestra para estimar el
número de organismos presentes en la misma.

→ El resultado se expresa como “el número más probable de mo por gramo o por ml o por
100 ml” según los casos.

→ El método deriva de la aplicación de la teoría de probabilidad para la determinación de

mo en una muestra.

→ A diferencia del recuento en placa, el NMP no constituye una medida directa del recuento
bacteriano y sus resultados suelen ser más variables que los del recuento en placa.

→ Es adecuado para estimar la población de mo especialmente en situaciones donde se

encuentran densidades extremadamente bajas, ya que posee mayr sensibilidad que el
recuento en placa.
→ Número más probable por 100 ml, usando 10 tubos de 10 ml.
 Investigación de E. coli por filtración por membrana:
→ Muestra de 100 ml.
→ Filtrar 100 ml de muestra en el monitor de filtración.
→ Ubicar la membrana en superficie de agar CCA.
→ Incubar 24 hs a 36 ºC.
→ Colonias β - D - galactosidasa positiva (color rosa a rojo): bacterias
coliformes presuntivas que no son E. coli. Se confirman con test de oxidasa.
→ Colonias β - D - glucuronidasa (color azul oscuro a violeta): bacterias
coliformes que son E. coli.

Investigación de Pseudomonas aeruginosa:

→ Muestra de 100 ml.
→ Filtrar 100 ml de muestra en el monitor de filtración.
→ Sembrar en superficie de agar pseudomonas CN.
→ Incubar 48 hs a 37 ºC.
→ Observar morfología de colonias: A, B y C.

Pruebas confirmatorias Pseudomonas aeruginosa oxidasa (+):

→ Medio agar F: fluoresceína, peptona de caseína (alto P) y carne, fosfato dipotásico, sulfato de
magnesio, glicerol.
→ Producción de pigmento fluoresceína en agar F:
→ Pasar el cultivo en agar F e incubar hasta 5 días a 36 ± 2°C, usualmente 24 hs
es suficiente.
→ Examinar bajo luz UV diariamente y observar presencia de fluorescencia.
→ En la imagen se ve una placa con repique de colonias presuntivas pseudomonas en
agar F.
→ Caldo acetamida: la desaminación de la acetamida produce amoníaco que aumenta el pH del
medio. Se evidencia por un cambio de color del rojo fenol de naranja - rojo a púrpura - rojo.
→ Producción de amonio a partir de acetamida:
 → A partir del cultivo obtenido en Agar Pseudomonas y tras comprobar que es un
microorganismo oxidasa positivo, este medio permite la confirmación por la
producción de amonio a partir de acetamida.
→ Una vez inoculado el tubo, incubar a 34 - 38 ºC aproximadamente durante 16 - 24
horas.
→ Añadir 1 - 2 gotas de Reactivo Nessler.
→ Observar la producción de amonio por la presencia de pigmento de color amarillo
o anaranjado.

→ Esta prueba está basada en la identificación de una enzima bacteriana llamada citocromo C
oxidasa y para reducir el nombre se le dice oxidasa.
→ Todas las bacterias aerobias obtienen su energía en forma de ATP a partir del proceso de
respiración llamado cadena respiratoria, este se lleva a cabo en la membrana celular bacteriana.
→ La cadena respiratoria tiene la finalidad de producir ATP.
→ En la respiración hay una secuencia de enzimas y transportadores que pasan los electrones desde
sus sustratos hasta llegar al citocromo C, la enzima llamada citocromo C oxidasa le quita electrones
al citocromo C, estos electrones son transferidos por la enzima al oxígeno siendo este el último
aceptor de electrones en la cadena respiratoria, finalmente debido a que el oxígeno tiene un exceso
de electrones puede atraer átomos de Hidrógeno formando dos posibles productos: Agua o peróxido
de hidrógeno.
→ Reactivos usados en la prueba de oxidasa:
→ Se utilizan colorantes cromógenos que actúan como aceptores artificiales de electrones
que sustituyen de cierta manera al oxígeno usado por la bacteria, los más usados son:
Tetrametil - p - fenilendiamina.
→ El reactivo basado en una disolución acuosa de tetrametil - p - fenilendiamina al 1 %, es el
más común.
→ Este reactivo se puede impregnar en discos o fragmentos de papel filtro grueso.
→ Observación:
→ Comercialmente se venden tiras o discos impregnados con el reactivo.
→ Fundamento:
→ El reactivo es incoloro pero al ponerlo en contacto con la enzima citocromo C oxidasa
cambia a un color morado debido a que el tetrametil - p - fenilendiamina es una amina
aromática y la oxidación de esta produce quinolonas de color morado-azulado.
→ Procedimiento prueba de la oxidasa:
→ Se toma con un palillo grueso de madera una muestra bacteriana a partir de una colonia
aislada proveniente de un cultivo de 24 hs.
→ La muestra se pone en contacto con la tira o disco impregnado.
→ Se debe observar una coloración morada en un lapso no mayor a 30 segundos para que
sea positivo, de lo contrario el resultado es negativo.
→ Control positivo: Pseudomonas aeruginosa.
→ Control negativo: Escherichia coli.
→ Factores a considerar en la prueba de oxidasa:
→ No considerar un resultado positivo después de 30 segundos ya que el oxígeno molecular
del ambiente oxida al reactivo.
→ No usar asa bacteriológica metálica ya que la mayoría de estas contienen hierro y este es
capaz de oxidar el reactivo dando los falsos positivos.
→ No realizar la prueba de bacterias que provienen de colonias obtenidas de medios de
cultivos que contienen glucosa u otro carbohidrato ya que la fermentación del carbohidrato
inhibe a la oxidasa dando como resultado falsos negativos en la prueba.
→ Para realizar la prueba usar bacterias provenientes de medios de cultivo como son: Agar
sangre, Agar BHI, agar tripticasa soya, agar nutritivo, agar Mueller Hinton.
 Medios de cultivo:
→ Agentes selectivos y diferenciales.