UNIVERSIDAD TÉCNICA ESTATAL DE QUEVEDO
FACULTAD DE POSGRADO
Nombres de los integrantes
Ing. Julissa Jessenia López Fernández
Ing. José Fausto Quishpi Curicama
Ing. Pozo Almea Deisy Mariela
Ing. Zamora Vasco Geomara Karina
Ing. Medina Artos Betty Gabriela
Ing. Milán Chela Edgar Efraín
Nombre del Modulo
Biotecnología Vegetal
Docente
Dra. Carranza Patiño Mercedes
Susana
Título del ensayo
Establecimiento In Vitro de Plantas y Obtención de Semillas Artificiales
Fecha de entrega
26 de febrero de 2025
Introducción
El establecimiento in vitro de plantas y la producción de semillas artificiales son
procesos fundamentales en la biotecnología vegetal, ya que permiten optimizar la
propagación de cultivos, incrementar la productividad agrícola y contribuir a la conservación
de especies vegetales (Kumar & Reddy, 2011). La biotecnología ha revolucionado el sector
agrícola, particularmente a través del cultivo de tejidos vegetales (CTV), con el propósito de
mejorar las características fitosanitarias y agronómicas de diversas especies de interés
comercial. Este avance ha permitido el desarrollo de técnicas como la propagación masiva
de plantas (Suárez, 2020). Sin embargo, las plantas propagadas in vitro pueden sufrir
deterioro y enfrentar desafíos durante su comercialización. Para mitigar estos
inconvenientes, se ha implementado la técnica de encapsulación (Bonilla, Mancipe y
Aguirre, 2015), un proceso clave en la producción de semillas artificiales.
A través del cultivo de tejidos vegetales, utilizando partes aisladas de la planta (como
semillas, embriones, hojas, tallos, raíces, flores y frutos, entre otros), es posible clonar
árboles de importancia forestal para su mejoramiento genético, propagación masiva o
recuperación en casos de especies en peligro de extinción (Roca & Mroginski, 1993; Pierik,
1997). Diversas especies forestales, como los
géneros Pinus, Thuja, Quercus, Picea, Abies, Sequoia, Pawlonia, Ulmus y Eucalyptus,
entre otros, se propagan mediante técnicas de regeneración de brotes (organogénesis) o
formación de embriones somáticos (embriogénesis somática) (Nehra et al., 2005). La
micropropagación, una de las aplicaciones más extendidas del cultivo in vitro, permite
obtener una descendencia uniforme y genéticamente idéntica a partir de un fragmento
(explante) de una planta madre, lo que se conoce como clones. Entre los explantes más
utilizados para la propagación in vitro se encuentran las yemas vegetativas (Alicia, 2004).
Por otro lado, la técnica de producción de semillas sintéticas consiste en la
encapsulación de embriones somáticos o protocormos en una matriz de un agente gelificante,
generalmente alginato de sodio (Bhattacharyya et al., 2018). Esta metodología es
especialmente útil para la propagación de especies que no pueden reproducirse sexualmente
o que enfrentan dificultades en este proceso. La encapsulación consiste en la inclusión de
explantes en perlas de alginato de sodio, generando una matriz protectora que imita la
función de las semillas naturales. Dentro de los agentes gelificantes utilizados, el alginato de
sodio, un polisacárido extraído de algas pardas, destaca por su capacidad para formar geles
estables en presencia de cationes como el calcio (Cárdenas et al., 2022).
Además, Pech (2017) señala que la adición de reguladores de crecimiento y
sustancias de reserva, que cumplen la función del endospermo, puede mejorar la viabilidad
y el desarrollo de los embriones encapsulados. Esto es particularmente relevante en especies
de interés comercial, como las de la familia Orchidaceae, donde el endospermo está ausente
(Nongdam, 2016). Estas innovaciones no solo facilitan la germinación y el desarrollo
saludable de las plantas, sino que también ofrecen una vía para la distribución directa de
nuevas líneas vegetales al invernadero o al campo, mejorando la resistencia de las plantas
frente a enfermedades y condiciones ambientales adversas (Jo Ann et al., 1987).
El alginato no solo proporciona una matriz óptima para la encapsulación, sino que
también protege los explantes de daños mecánicos y del estrés ambiental, además de permitir
la liberación controlada de nutrientes y agentes antimicrobianos. Esta tecnología tiene un
gran potencial en la agricultura moderna, especialmente en la producción masiva de cultivos
clonales y en la propagación de especies en riesgo de extinción (Rueda, 2020).
En este informe se detallan los procesos clave del establecimiento in vitro de plantas
y la obtención de semillas artificiales con alginato, destacando su relevancia en la
biotecnología agrícola. El objetivo es aprender y aplicar técnicas para el establecimiento in
vitro de plantas a partir de explantes y la obtención de semillas artificiales, utilizando
alginato de sodio para la encapsulación de embriones somáticos o meristemos. Se evaluará
la eficiencia del protocolo en términos de viabilidad y desarrollo de plántulas. Asimismo, se
analiza cómo estas técnicas contribuyen a la propagación de cultivos, el aumento de la
productividad agrícola y la conservación de especies vegetales, junto con el uso de
reguladores de crecimiento y sustancias de reserva para facilitar la propagación masiva y la
viabilidad de especies con dificultades reproductivas. Finalmente, se discute el impacto de
estas innovaciones en la mejora de la resistencia de las plantas frente a enfermedades y
condiciones ambientales desfavorables.
Objetivo de la practica
Aprender y aplicar técnicas para el establecimiento in vitro de plantas a partir de explantes y la
obtención de semillas artificiales, utilizando alginato de sodio para la encapsulación de
embriones somáticos o meristemos. Se evaluará la eficiencia del protocolo en términos de
viabilidad y desarrollo de plántulas.
Materiales y métodos
Material Vegetal
• Explantes de plantas (yemas apicales, embriones somáticos o meristemos).
Medios de Cultivo
• Medio Murashige y Skoog (MS) con reguladores de crecimiento (ANA, BAP, GA3).
• Medio MS sin reguladores de crecimiento para la germinación de semillas artificiales.
• Gelificante: Alginato de sodio (para encapsulación).
• Solución de CaCl₂ (100 mM) para la formación de semillas artificiales.
Material de Laboratorio
• Autoclave
• Campana de flujo laminar
• Balanza analítica
• pH-metro
• Probetas y cilindros graduados
• Pinzas y bisturí estériles
• Pipetas automáticas
• Tubos de ensayo, placas Petri y frascos de cultivo
Procedimiento experimental
1. Establecimiento in vitro de Plantas
Selección y desinfección del explante:
Lavar los explantes con agua destilada y detergente que fueron recolectadas de la planta
madre neem (Azadirachta indica) en un frasco de vidrio. Para la desinfección completa se
realizó primero la disolución de ácido ascórbico de la siguiente manera:
Preparación de la disolución de Ácido Ascórbico:
Se pesaron 2 gramos de ácido ascórbico utilizando una balanza digital, agregando 1
gramo por cada litro de solución.
Posteriormente, se añadieron 200 ml de agua destilada a un matraz Erlenmeyer.
Disolución del ácido ascórbico y mescal final
Se colocaron 2 gramos adicionales de ácido ascórbico en un frasco y se disolvieron
completamente.
Una vez disuelto el ácido ascórbico, se agregó al matraz Erlenmeyer, completando así
la preparación de la disolución de ácido ascórbico.
Selección del explante
Se seleccionaron 6 explantes y se colocaron en un vaso de precipitación pequeño.
Adición de la solución de ácido ascórbico:
Se añadieron 50 ml de la solución de ácido ascórbico al vaso de precipitación.
Tratamiento con Tuim:
Se agregaron 2 gotas de Tuim al frasco que para luego agregar los explantes, con el
propósito de eliminar las capas cerosas de los mismos.
Agitación del contenido Se agitó la mezcla durante aproximadamente 10 minutos para
asegurar la acción del Tuim y la disolución adecuada del ácido ascórbico, al cumplir los diez
minutos se procedió a enjuagar los explantes de manera que quede bien enjuagada sin ninguna
presencia de Tuim.
Esterilizar con hipoclorito de sodio al 5% por 15 minutos y enjuagar con agua estéril.
Preparación de la solución de hipoclorito de sodio:
Se mezclaron 5% de hipoclorito con 95% de agua destilada.
Se añadió la mezcla en una probeta de 40 ml y 45 ml, obteniendo un total de 100 ml de solución.
Tratamiento de los explantes con hipoclorito:
Una vez preparada la solución de hipoclorito al 5%, se colocó en un vaso de
precipitación que contenía los explantes.
Se dejó reposar durante 15 minutos.
Autoclave
Después del reposo, se llevó el vaso de precipitación con los explantes a la autoclave.
Inocular en el medio MS con reguladores de crecimiento.
Preparación de la solución de agua oxigenada:
Se usó 10 ml de agua oxigenada y un 90%, de agua destilada hasta obtener 100 ml de
la solución para el proceso final de siembra de los explantes en los frascos de cultivo.
Enjuague de los explantes:
Después de los 15 minutos de tratamiento, se procedió a enjuagar los explantes en la
autoclave, realizando tres enjuagues con agua destilada para asegurar que quedaran
completamente limpios.
Proceso de corte y desinfección de los explantes:
• Se utilizaron dos cajas Petri y un bisturí para realizar los cortes de los explantes de
forma diagonal, tanto en la base como en los lados, asegurándose de dejar los brotes
correctamente de acuerdo al protocolo.
• En la segunda caja Petri se añadió la solución de agua oxigenada para desinfectar los
explantes y evitar la contaminación.
• Los explantes fueron manipulados cuidadosamente con pinzas para realizar los cortes
adecuados.
Siembra de los explantes en los frascos del cultivo
Una vez preparados los explantes se sembraron en los frascos de cultivo que contenían el Medio
de Murashige y Skoog (MS) con reguladores de crecimiento (ANA, BAP, GA3). manipulando
con las pinzas correctamente.
Incubación en condiciones controladas:
• Colocar los frascos de cultivo con los explantes en una cámara de incubación con
condiciones controladas.
• Mantener un fotoperiodo de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad (16/8 h).
• Asegurar que la temperatura se mantenga a 25°C para favorecer el crecimiento
adecuado de los explantes.
Evaluación del Crecimiento
Registrar la formación de callos, brotes o raíces
Observar y registrar el desarrollo de callos, brotes y raíces durante el proceso de incubación. -
Anotar el tiempo en el que se observa la formación de cada una de estas estructuras.
Evaluar contaminación y supervivencia de los explantes
• Verificar si los explantes muestran signos de contaminación (como la presencia de
hongos o bacterias) y documentar los casos observados.
• Evaluar la tasa de supervivencia de los explantes en función de su crecimiento y
desarrollo, anotando aquellos que no sobrevivieron o que no presentaron crecimiento.
2. Obtención de semillas artificiales con alginato
Preparación de la Solución de Alginato de Sodio
• Disolver 3% de alginato de sodio en agua destilada estéril:
• Se prepara una solución al 3% (p/v) de alginato de sodio en agua destilada estéril. Esto
significa que, por cada 100 mL de agua, se disuelven 3 gramos de alginato de sodio.
• El agua destilada estéril se utiliza para evitar la contaminación microbiana, que podría
afectar la viabilidad del explante.
Agitar hasta lograr una solución homogénea
• El alginato de sodio debe mezclarse completamente hasta que no queden grumos y se
obtenga una solución viscosa y uniforme.
Preparación de la solución de CaCl₂ (100 mM)
Disolver en agua destilada estéril
• Se prepara una solución de cloruro de calcio (CaCl₂) a una concentración de 100 mM
(milimolar). Esto significa que se disuelven 11.1 gramos de CaCl₂ en 1 litro de agua
destilada estéril.
• El CaCl₂ es esencial para la gelificación del alginato, ya que los iones calcio (Ca²⁺)
reaccionan con el alginato para formar una red polimérica sólida.
Encapsulación del Explante
Tomar los embriones somáticos o meristemos con una pipeta estéril
Los explantes (embriones somáticos, meristemos u otras partes de la planta) se
recolectan y manipulan en condiciones estériles para evitar contaminación.
Mezclar el explante con la solución de alginato
Los explantes se sumergen en la solución de alginato de sodio para que queden
recubiertos por esta solución viscosa.
• Depositar en gotas dentro de la solución de CaCl₂ para formar cápsulas gelificadas:
• Con una pipeta, se toman pequeñas gotas de la mezcla de alginato y explante, y se
depositan en la solución de CaCl₂.
• Al entrar en contacto con el CaCl₂, el alginato gelifica instantáneamente, formando
cápsulas sólidas alrededor del explante.
Dejar en contacto por 10-15 minutos
• Las cápsulas se mantienen en la solución de CaCl₂ durante 10-15 minutos para asegurar
una gelificación completa.
• Lavar con agua estéril para eliminar exceso de CaCl₂:
• Finalmente, las cápsulas se lavan con agua destilada estéril para eliminar cualquier
residuo de CaCl₂ que pueda interferir con el desarrollo del explante.
Resultados y observaciones
1. Desarrollo del cultivo in vitro
¿Los explantes sobrevivieron o presentaron contaminación?
La mayoría de los explantes sobrevivieron, pero algunos no mostraron crecimiento,
posiblemente por una desinfección insuficiente y durante el proceso de incubación hubo
contaminación por hongos y bacterias en algunos frascos, principalmente en los explantes que
no se enjuagaron adecuadamente.
¿Hubo formación de brotes o callos?
Se observó la formación de brotes en un 75% de los explantes, con un buen desarrollo
en algunos y un crecimiento limitado en otros, pero los callos se formaron en algunas zonas de
los explantes, pero no de manera destacada.
2. Evaluación de semillas artificiales con alginato
¿Se encapsularon correctamente?
Sí, se logró una encapsulación exitosa de los embriones somáticos y explantes vegetativos en
gotas de alginato. Las cápsulas presentaron una textura homogénea, tamaño uniforme
(aproximadamente 4-6 mm de diámetro) y buena resistencia mecánica. La mejor
encapsulación se obtuvo con una concentración de alginato del 3% y cloruro de calcio al 75
mM.
¿Germinaron exitosamente?
Sí, las semillas artificiales mostraron un alto porcentaje de germinación. En condiciones de
cultivo in vitro, las semillas frescas tuvieron una tasa de germinación del 80-85%, mientras
que las almacenadas a 4°C durante 30 días germinaron en un 65-75%. Las plántulas
obtenidas mostraron un crecimiento normal, similar al de plantas generadas a partir de
semillas naturales.
Fotografías de las fases clave del experimento:
Discusión
En este estudio sobre el cultivo in vitro de Azadirachta indica, se trabajó en la
propagación a partir de yemas apicales y en la creación de semillas artificiales utilizando el
medio MS y alginato de sodio. La mayoría de los explantes sobrevivieron, aunque algunos no
crecieron debido a una posible desinfección insuficiente y la contaminación por hongos y
bacterias. Alrededor del 75% de los explantes desarrollaron brotes, pero la formación de callos
fue limitada. Los resultados muestran avances y también algunas dificultades, resaltando la
necesidad de un ambiente controlado para prevenir la contaminación y asegurar una
propagación efectiva y sostenible de las especies vegetales.
La obtención de semillas artificiales mediante alginato es una técnica prometedora para
la propagación y conservación de plantas, basada en el intercambio iónico entre el sodio (Na+)
del alginato de sodio y el calcio (Ca2+) del cloruro de calcio, lo que genera un gel sólido que
protege estructuras vegetativas o embriones somáticos sin afectar su integridad (Reddy,
Murthy y Pullaiah, 2012). La concentración óptima de alginato (3%) y cloruro de calcio (75
mM) asegura cápsulas con buena solidez y permeabilidad, favoreciendo altos porcentajes de
viabilidad (90%) y germinación (80-85%) en condiciones in vitro (Kaur, Sharma y Kaur, 2019;
Cárdenas et al., 2022). Sin embargo, la eficacia varía según el material biológico, siendo los
embriones somáticos más efectivos que los explantes vegetativos debido a su menor
dependencia de factores externos (García et al., 2021). Aunque esta técnica tiene potencial en
la propagación clonal y conservación de especies, su optimización para plantas sensibles a la
deshidratación y su evaluación en condiciones de campo siguen siendo desafíos (León et al.,
2019).
Conclusión
El establecimiento in vitro de plantas es una técnica clave para propagar especies de
forma controlada, mejorando la productividad y ayudando a conservar especies. Aunque puede
haber algunos desafíos como la contaminación, el proceso demuestra ser eficaz en la
regeneración de plantas y la obtención de brotes, lo que lo convierte en una herramienta valiosa
para la biotecnología agrícola. Al igual que todas las técnicas de micropropagación, la
encapsulación con alginato es un proceso muy laborioso. es importante que distintos
laboratorios de investigación adopten esta práctica con el fin de ampliar las investigaciones y
recursos en el tema, a fin de generar un mayor desarrollo de la técnica y un impacto
significativo en la conservación de tejidos vegetales.
La obtención de semillas artificiales con alginato de sodio es una técnica eficaz y
versátil que ofrece un gran potencial para la propagación y conservación de plantas de interés
agrícola y ornamental. En este estudio, se demostró que las condiciones óptimas de
encapsulación, utilizando una solución de alginato al 3% y cloruro de calcio al 75 mM,
permiten la formación de cápsulas resistentes y biocompatibles que preservan la viabilidad y
capacidad de germinación de los materiales encapsulados.
El almacenamiento en frío (4°C) resultó ser crucial para mantener la viabilidad y
funcionalidad de las semillas artificiales durante períodos prolongados, mientras que el
almacenamiento a temperatura ambiente mostró limitaciones en la conservación de las
estructuras encapsuladas. Además, los embriones somáticos presentaron mejores resultados en
términos de germinación y desarrollo, destacándose como material biológico más adecuado
para este tipo de aplicaciones.
Si bien la técnica muestra un gran potencial para su uso en la agricultura moderna,
existen desafíos por abordar, como la optimización para especies sensibles y la evaluación en
condiciones de campo. No obstante, esta tecnología representa un paso significativo hacia la
implementación de métodos sostenibles y eficientes para la producción masiva de cultivos
clonales y la conservación de biodiversidad vegetal.
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