PROTOCOLO API

API 20 E es un sistema estandarizado que permite la identificación de Enterobacteriaceae y

otros bacilos Gram negativos no exigentes, que incluye 21 tests bioquímicos miniaturizados,
así como una base de datos. La lista completa de las bacterias posibles de identificar con
este sistema se presenta en la Tabla de Identificación al final de la presente ficha técnica.

La galería del sistema API 20 E se compone de 20 microtubos que contienen los substratos
deshidratados. Los microtubos se inoculan con una suspensión bacteriana que reconstituye
los tests. Las reacciones producidas durante el periodo de incubación se traducen en
cambios de color espontáneos o revelados mediante la adición de reactivos. La lectura de
estas reacciones se lleva a cabo utilizando la Tabla de Lectura, y la identificación se obtiene
con la ayuda del Catálogo Analítico o del software de identificación.

La galería API 20 E no debe ser utilizada directamente a partir de muestras de origen clínico
o de otro tipo. Los microorganismos a identificar deben aislarse en una primera fase sobre
un medio de cultivo adecuado según las técnicas usuales de bacteriología.

MODO DE EMPLEO
Test de la Oxidasa
El test Oxidasa debe ser realizado según las instrucciones de utilización del fabricante, y
constituye el test de identificación n°21 a anotar en la hoja de resultados.
Preparación de la galería
• Reunir fondo y tapa de una cámara de incubación y repartir aproximadamente 5 ml de
agua destilada o desmineralizada [o cualquier agua sin aditivos o derivados susceptibles de
liberar gases (Ej.: Cl2, CO2...)] en los alvéolos para crear la atmósfera húmeda.
• Inscribir la referencia de la cepa en la lengüeta lateral de la cámara (no inscribir la
referencia sobre la tapa, ya que ésta puede quedar desplazada durante la
manipulación).
• Sacar la galería de su envase.
• Colocar la galería en la cámara de incubación.

NOTA: La galería API 20 E debe ser utilizada con las Enterobacteriaceae y/o los bacilos
Gram negativos no exigentes. Los microorganismos exigentes y que necesitan
precauciones de manipulación particulares (Ej.: Brucella y Francisella) no forman parte de la
base de datos API 20 E. Conviene usar otras técnicas para excluir o confirmar su presencia.

Preparación del inóculo

• Abrir una ampolla de API NaCl 0,85% Medium (5 ml) o una ampolla de API Suspension
Medium (5 ml), como se indica en el párrafo “Precauciones de utilización” de la presente
ficha técnica o utilizar un tubo que contenga 5 ml de agua fisiológica estéril o de agua
destilada estéril, sin aditivos.
• Con una pipeta o una PSIpipete, extraer una sola colonia bien aislada sobre medio agar.
Utilizar preferentemente cultivos jóvenes (18-24 horas).
• Realizar una suspensión bacteriana homogeneizando cuidadosamente las bacterias en el
medio. Esta suspensión debe ser utilizada inmediatamente después de su preparación.

NOTA: La mayoría de las especies de Vibrio son halófilas. En caso de sospechar la

presencia de un Vibrio, realizar la suspensión bacteriana en el API NaCl 0,85%
Medium.

Inoculación de la galería
• Introducir la suspensión bacteriana en los tubos de la galería con la ayuda de la misma
pipeta (para evitar la formación de burbujas en el fondo de los tubos,colocar la punta de la
pipeta o de la PSIpette sobre la pared de la cúpula, inclinando ligeramente la cámara de
incubación hácia delante) :

- Para las pruebas CIT , VP y GEL , llenar el tubo y la cúpula,

- Para las otras pruebas, llenar únicamente los tubos (no las cúpulas),
- Para las pruebas : ADH, LDC, ODC, H2S, URE crear una atmósfera anaerobia llenando la
cúpula con aceite de parafina.
• Cerrar la cámara de incubación.
• Incubar a 36oC ± 2oC durante 18-24 horas.

LECTURA E INTERPRETACIÓN

Lectura de la galería
• Después de la incubación, la lectura de la galería debe hacerse remitiéndose a la Tabla de
Lectura.
• Caso de que 3 o más ensayos (test GLU + o -), resultasen positivos, anotar en la hoja de
resultados todas las reacciones espontáneas y después revelar los ensayos que necesitan
la adición de reactivos:
- Prueba TDA: agregar una gota del reactivo TDA. Un color marrón-rojizo indica una
reacción positiva que se anotará en la hoja de resultados.
- Prueba IND: agregar 1 gota del reactivo JAMES. Un color rosado que se difumina en toda
la cúpula indica una reacción positiva, que se debe anotar en la hoja de resultados.
- Prueba VP: agregar una gota de los reactivos VP 1 y VP 2. Esperar un mínimo de 10
minutos. Un color rosa o rojo indica una reacción positiva que se anotará en la hoja de
resultados. Una débil coloración rosa que aparece después de 10 minutos debe ser
considerada como negativa.

NOTA: La prueba de investigación sobre la producción de Indól debe ser realizada en último
lugar, pues esta reacción libera gases que pueden alterar la interpretación de las otras
pruebas de la galería. No volver a colocar la tapa de la cámara de incubación después de
agregar el reactivo.
• Si el número de pruebas positivas antes de añadir los reactivos (incluyendo el ensayo
GLU) es inferior a 3:
- Reincubar la galería 24 horas (± 2 horas) suplementarias sin volver a añadir los reactivos.
- Revelar los ensayos que precisan adición de reactivos (ver párrafo precedente).
- Para completar la identificación, puede ser útil realizar ensayos complementarios
(consultar el párrafo "Identificación").
Tira de prueba bioquímica API 20 E
Estos incluyen:

ONPG: prueba de la enzima β-galactosidasa mediante hidrólisis del sustrato

o-nitrofenil-bD-galactopiranósido.
Descripcion: onpg Se investiga la presencia de betagalactosidasa el medio contiene onpg
que es incoloro la enzima rompe estamolécula generando un producto de color amarillo por
ello el color amarillo indica una reacción positiva en tanto que la reacción negativa es
incolora.

ADH: descarboxilación del aminoácido arginina por la arginina dihidrolasa

LDC: descarboxilaciones del aminoácido lisina por la lisina descarboxilasa
ODC: descarboxilaciones del aminoácido ornitina por la ornitina descarboxilasa

Descripcion: adh, ldc, odc ureasa si la bacteria presenta esas enzimas argenina de
hidrolasa lisina de carboxilasa, ornitina de carboxilasa y ureasa degradará los diferentes
sustratos generando una subida de pH Que hará que el indicador de pH rojo fenol via color
rojo la ausencia de la enzima reacción negativa dará un color amarillo

CIT: utilización de citrato como única fuente de carbono

Descripcion: Cit se investiga la capacidad de la bacteria de crecer con citrato como única
fuente de carbono la utilización de citrato origina una subida de pH que hace que el
indicador azul de bromotimol vire a color azul la prueba negativa se detectará por un color
verde pálido o amarillo.

H2S: producción de sulfuro de hidrógeno

Descripcion: h2s si la bacteria realiza respiración anaerobia usando como aceptor final de
electrones el tiosulfato sódico que hay en el medio se generará un precipitado negro la no
aparición del precipitado se dará como resultado negativo.

URE: prueba de la enzima ureasa

Descripcion: Ureasa degradará los diferentes sustratos generando una subida de pH Que
hará que el indicador de pH rojo fenol via color rojo la ausencia de la enzima reacción
negativa dará un color amarillo.

TDA (Triptófano desaminasa): detección de la enzima triptófano desaminasa: Reactivo a

poner- Cloruro Férrico.

IND: Prueba de indol: producción de indol a partir de triptófano por la enzima triptofanasa.
Reactivo: el indol se detecta mediante la adición del reactivo de Kovac.

VP: la prueba de Voges-Proskauer para la detección de acetoína (acetilmetilcarbinol)

producida por la fermentación de glucosa por bacterias que utilizan la vía del butilenglicol

Descripcion: Hay otras pruebas que requieren un revelado de forma que una vez incubada
la galería Es necesario Añadir ciertos reactivos para leer la prueba estas son tda si la
bacteria tiene triptófano deaminasa tras Añadir cloruro férrico aparecerá una coloración
pardor rojiza si el color es amarillo o anaranjado la prueba será negativa ind se estudia si la
bacteria degrada el triptófano con la producción de indol una vez crecida la bacteria se
añadirá reactivo de covax si después de 2s minutos aparece un anillo rojo en la cúpula la
reacción es positiva si es amarillo la reacción es negativa vp la prueba de bojes prosc
permite determinar si la bacteria lleva a cabo una fermentación de tipo butilenglicólicos.
Añadir al cultivo unas gotas de koh y de Alfa naftol si después de 10 minutos aparece un
color rojo la reacción es positiva.

GEL: prueba para la producción de la enzima gelatinasa que licúa la gelatina.

Descripcion: Gel se estudia si la bacteria puede hidrolizar la gelatina en tal caso la
degradación de esta liberará un pigmento negro que difundirá por el medio en caso negativo
no difundirá

GLU: fermentación de la glucosa (azúcar hexosa)

MAN: fermentación de manosa (azúcar hexosa)
INO: fermentación del inositol (polialcohol cíclico)
SOR: fermentación del sorbitol (azúcar alcohólico)
RHA: fermentación de la ramnosa (azúcar metilpentosa)
SAC: fermentación de la sacarosa (disacárido)
MEL: fermentación de la melibiosa (disacárido)
AMY: fermentación de la amigdalina (glucósido)
ARA: fermentación de arabinosa (azúcar pentosa)

Descripcion: las bacteria utiliza diversos azúcares se acidificar el medio de tal forma que el
indicador de pH azul de bromotimol virará amarillo el color azul o verde significa una
reacción negativa además.

hay otras pruebas que requieren un revelado de forma que una vez incubada la galería Es
reducción de nitratos esta prueba se lee sobre el tubo glue se investiga si la bacteria tiene
el enzima nitrato reductasa y en consecuencia produce nitrito Para ello se le añade al tubo
una gota de ácido sulfanílico y otra de Alfa naftilamina esperamos dos o tres minutos si
aparece un color rojo la reacción es positiva la bacteria tiene nitrato reductasa el color rojo
se debe a la reacción del nitrito con los reactivos añadidos si el tubo permanece de color
amarillo la prueba sería negativa no hay nitrito en el medio en este caso habrá que
comprobar si la bacteria tiene los dos enzimas nitrato y nitrito reductasa y en consecuencia
todo el nitrato habría pasado nitrógeno o por el contrario si carece de ambas enzimas Para
ello se añade polvo de zinc que reduce químicamente el nitrato a nitrito esperar 5 o 10
minutos si el tubo permanece amarillo indica una reacción positiva hay nitrógeno molecular
la bacteria tiene los dos enzimas si el tubo vira a color rojo sería la prueba negativa la
bacteria no tiene nitrato ni nitrito reductasa El zinc ha reducido químicamente el nitrato
a nitrito
por último haremos la prueba de la oxidasa ox esta prueba no la haremos en la galería para
determinar si la bacteria tiene citocromo oxidasa añadiremos una gota de tetrametil para
fenilendiamina sobre una colonia crecida en una placa de petri la reacción es positiva si da
un color púrpura antes de 20 minutos