PRÁCTICA N° 2: COLORACIONES DE BACTERIANAS

I. INTRODUCCIÓN:

La tinción de bacterias es una técnica esencial en lo que es el campo de microbiología, eta es utilizada
para poder ver y también diferenciar microorganismos bajo el microscopio. Este proceso es clave tanto en el
diagnóstico preciso como en la investigación microbiológica y el desarrollo de nuevas terapias
antimicrobianas. 1

Entre las metodologías que más se usan se encuentra la tinción de Gram, está fue creada por el bacteriólogo
danés Christian Gram en 1884 y obtiene el nombre en su honor. Esta técnica nos va a permitir clasificar las
bacterias en gram-positivas y gram-negativas, esto se hace basándose en las variaciones de la estructura de
sus paredes celulares. 2

Otra técnica también muy importante es la tinción de Ziehl-Neelsen, esta es mayormente utilizada para
identificar bacterias ácido-alcohol resistentes, como el Mycobacterium tuberculosis, que es la bacteria
responsable de la tuberculosis.3

Con los avances de la tecnología de hoy en día, se han desarrollado métodos de tinción más avanzados, como
la tinción de Gram modificada y técnicas de fluorescencia, que van ofrecen una mayor resolución y una
identificación más precisa de los microorganismos.4

Que logremos entender y usar adecuadamente las técnicas de tinción bacteriana no solo es fundamental para
un diagnóstico médico que sea efectivo, sino también para la investigación científica y la prevención de
enfermedades infecciosas que también haremos en nuestro campo de la Obstetricia. Estas técnicas van a jugar
un rol fundamental en la identificación precisa de los microorganismos patógenos, lo que va a facilitar tanto
el control de brotes infecciosos como el desarrollo de estrategias para su tratamiento. Además, su aplicación
va a contribuir al avance de la microbiología para detectar enfermedades a tiempo, esto al permitir una mejor
comprensión de la dinámica de los patógenos y su interacción con los organismos que serían los huéspedes.5

OBJETIVOS:
• Conocer los fundamentos de las diferentes coloraciones utilizadas en la observación microscópica de
bacterias.
• Aplicar las principales técnicas de coloración empleadas en bacteriología.

II. MATERIALES Y METODOS:

2.1 Materiales:
• Muestras: cultivos bacterianos
• Microscopios • Mecheros
• Asa de Koll • Set de Gram
• Ron para mechero • Tinta china negra
• Verde de Malaquita
• Safranina
 • Laminas portaobjetos
• Laminilllas cubre objeto

2.2 Métodos
A. COLORACIÓN SIMPLE: se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se
tiñen con la misma tonalidad (azul metileno, cristal violeta, etc.). El fundamento de la tinción, de
hecho, se basa en afinidad de la célula por el colorante de acuerdo a la carga de ambos.
Esta tinción es para detectar al microorganismo entero, de manera que la morfología y las
agrupaciones celulares resulten visibles.

TINCIÓN SIMPLE

B. COLORACIONES COMPUESTAS:
Coloración Gram:
Fundamento
Este método permite diferenciar a las bacterias en Gram positivas y Gram negativas y se basa en
la composición química y el contenido de peptidoglucano en la pared celular de las bacterias.
Esta tinción se basa en colocar como colorante primario cristal violeta, el cual tiene afinidad por
el peptidoglucano de la pared bacteriana. Posteriormente, se coloca lugol, el cual sirve como
mordiente e impide la salida del cristal violeta por la formación de un complejo cristal violeta-
yodo que satura los espacios del péptidoglicano de la pared bacteriana. Posteriormente, se aplica
una mezcla de alcohol-acetona, las bacterias Gram positivas retienen con mayor fuerza el
complejo cristal violeta-yodo y las Gram negativas no lo pueden retener. Por último, se coloca
fucsina, la cual actúa como colorante secundario o de contraste y colorea a las bacterias Gram
negativas.
a) Muestra: Cultivo bacteriano Gram + (Staphylococccus aureus )
Gram – ( Escherichia coli)
b) Reactivos: cristal violeta, lugol, alcohol acetona, safranina

Procedimiento
1. Posterior a la fijación, cubrir la muestra con cristal violeta por un tiempo de 30 a 60 segundos.
2. Lavar con agua a chorro leve
3. Agregar lugol y dejar por 30 segundos.
4. Lavar cuidadosamente con agua
5. Decolorar con alcohol acetona hasta que ya no desprenda colorante de la lámina.
6. Lavar inmediatamente con agua
7. Cubrir la muestra con safranina por 10 a 30 segundos.
8. Lavar, secar y observar con objetivo a inmersión.
Interpretación: Célula bacteriana violeta: Gram positiva
Célula bacteriana roja: Gram negativa

TINCIÓN DE GRAM
Coloración de Ziehl Neelsen:
Todas las bacterias se tiñen con la colorante fucsina en presencia de calor. Sin embargo, la
mayoría de las bacterias se decoloran después del tratamiento con etanol/HCl, excepto
las micobacterias y géneros relacionados que resisten al tratamiento decolorante y retienen
al colorante. Esta ácido alcohol resistencia se debe al alto contenido de sustancias
hidrofóbicas (ácidos micólicos) en la pared celular.
a) Muestra: esputo
b) Reactivos: carbolfucsina, alcohol ácido, azul de metileno

Procedimiento:
1. Efectuar un extendido fino sobre un portaobjeto limpio y desengrasado.
2. Cubrir con colorante carbolfucsina y calentar a la llama hasta desprendimiento de vapores
por tres veces consecutivas sin llegar a la ebullición.
3 Lavar con agua
4. Decolorar con alcohol ácido.
5. Lavar con agua
6. Colorear con azul de metileno
7. Lavar, secar y observar a inmersión.

TINCIÓN DE ZIEHL – NEELSEN

C. COLORACIONES ESPECIALES
1. Coloración de esporas: Método Wirtz
Fundamento: La pared de las esporas es relativamente impermeable, sin embargo, los
colorantes pueden penetrarla si se calienta la preparación y la misma impermeabilidad sirve
para prevenir la decoloración. Las esporas se tiñen con verde de malaquita..
a) Material: cultivo de bacilos esporulados (Bacillus sp)
b) Colorantes: Verde de malaquita
Safranina
Procedimiento:
• Realizar la extensión de la muestra y dejar fijar.
• Cubrir la muestra con verde de malaquita
• Calentar hasta el desprendimiento de vapores por 3 a cuatro veces.
• Lavar
• Agregar safranina de 30 a 60 segundos.
• Lavar, secar y observar a inmersión.
Interpretación: Esporas: verdes
Cuerpos bacterianos: rojos

TINCIÓN DE ESPORAS

2. Coloración de cápsulas: Método de Maneval

Fundamento: La capsula es difícil de colorear con los colorantes por lo que se recurre a
tinciones negativas. El campo alrededor se tiñe con un colorante ácido, mientras que la célula
se tiñe con un colorante básico de otro color. En estas condiciones se observa un área
brillante translúcida alrededor de la célula.
a) Material: cultivo de germen capsulado (Klebsiella)
b) Colorantes: Rojo de congo (Maneval A)
Fucsina ácida (Maneval B)
 Procedimiento:
• Preparar una suspensión turbia del microorganismo.
• Colocar una gota de rojo de congo en una lámina portaobjetos.
• Trasladar una asada de la suspensión turbia del germen, mezclar con la gota de rojo de
congo y extender sobre la lámina y dejar secar a temperatura ambiente.
• Agregar fucsina ácida sobre la extensión tratando de cubrirla completamente por lo menos
por un minuto.
• Lavar con agua destilada con mucho cuidado, secar y observar al microscopio.
Interpretación: cápsula sin color, cuerpo bacteriano color rojo y fondo azul.

MÉTODO MANEVAL

3. Coloración de cápsula: Método tinción negativa

Fundamento: La tinción negativa o tinción de tinta china, tiñe toda la preparación excepto la
cápsula bacteriana debido a que no la penetra, resalta su estructura y esta se puede observar
como un área clara que rodea a la célula. Se utilizan diferentes métodos de tinción negativa
para evaluar estructuras individuales. Este método es muy útil, aunque está limitado por la
presencia de un fondo oscuro que no permitirá la correcta identificación de forma nítida y
detallada de los componentes de dichas estructuras
a) Material: Cultivo de bacteria capsulada ( Klebsiella)
b) Colorante: Tinta china negra

Procedimiento:
• Colocar sobre un portaobjetos una pequeña cantidad de solución fisiológica, agua o caldo,
con un ansa en anillo, dispersar en ella una pequeña cantidad del inóculo bacteriano
joven.
• Agregar con un ansa en anillo, una pequeña cantidad de tinta china, mezclar bien y cubrir
inmediatamente con un cubreobjetos, dejando que el líquido se extienda formando una
delgada película. Se debe evitar la formación de burbujas de aire en el preparado.
• Observar el preparado con el objetivo de inmersión.
III. RESULTADOS: esquematizar los procedimientos de las coloraciones realizadas en práctica.

TINCIÓN DE ZIEHL NEELSEN

Con un hisopo especial retirar la Con el hisopo, en una lámina Ya fijada la muestra le
mucosa bucal (saliva) intentando portaobjetos hacer movimientos agregamos la fucsina fenicada
cubrir todo el hisopo, dando lineales de arriba hacia abajo hasta cubrir la lámina.
círculos internamente para esparcir la muestra.

Durante 5 min. mientras está el Luego de lavarlo con agua, Lavamos con agua nuevamente y
colorante estará al calor del decoloramos con alcohol acido coloreamos con azul de metileno
mechero y hasta salir vapores, durante 3 minutos por 1 minuto, luego enjugamos y
evitar llegar a la ebullición dejamos secar.
 TINCIÓN DE GRAM

Con un asa esterilizada vamos a En 4 laminas ya fijadas Luego lavamos a chorro evitando
recoger un poco del cultivo a usar agregamos cristal violeta hasta que caiga directamente en la
y lo vamos a colocar en una gota cubrir la lámina y mover por toda muestra, sino que resbale por
de agua, mezclamos y fijamos esta. Esperar 1 minuto esta.

Agregamos bastante Lugol hasta Luego lavamos nuevamente a Agregamos alcohol acetona y
cubrir y lo dejamos por 30 chorro sin chocar directamente a lavamos hasta que ya no
segundos. la muestra desprenda colorante de la lámina
y lavamos inmediatamente

Agregamos la safranina como Hacemos el ultimo lavado a

último y luego la dejamos chorro y dejamos secar hasta
durante 1 minuto verlo al microscopio.
IV. DISCUSION

Pues bien, en este informe hemos revisado varias técnicas de tinción bacteriana, cada una con su finalidad
y utilidad en el laboratorio de microbiología. La primera mencionada fue la tinción simple, que como su nombre
indica, es sencilla y básicamente tiñe todas las bacterias de un solo color ya que utiliza un solo colorante.
Esta técnica puede parecer básica, pero es útil para observar la forma y disposición de los microorganismos.

Luego tenemos la tinción de Gram, que es sin duda una de las más importantes porque permite diferenciar
entre bacterias grampositivas y gramnegativas. Esto se debe a las diferencias en las paredes celulares de las
bacterias, lo que es crucial para saber qué tipo de tratamiento antimicrobiano podría ser más eficaz. Por este
motivo, la tinción de Gram es casi obligatoria en cualquier diagnóstico bacteriano.

La tinción de Ziehl-Neelsen, por otro lado, es específica para bacterias acidorresistentes, como *Mycobacterium
tuberculosis*. Esta tinción es importante cuando se investigan enfermedades como la tuberculosis, en las que
otras tinciones no serían tan útiles para identificar el agente infeccioso.

También se habló de la tinción de esporas, que, como su nombre indica, se utiliza para detectar bacterias
formadoras de esporas. Estas estructuras son bastante resistentes, por lo que es importante reconocerlas, ya
que pueden sobrevivir en condiciones difíciles y causar infecciones.

Por último, está la tinción capsular, que es esencial para identificar bacterias con cápsulas protectoras. Las
cápsulas pueden hacer que las bacterias sean más virulentas porque dificultan que el sistema inmunitario
las ataque, por lo que identificar estas bacterias es clave para comprender la gravedad de ciertas infecciones.

En resumen, cada técnica tiene su lugar y su función, y aunque algunas son más complejas que otras, todas
son herramientas valiosas para diagnosticar e investigar enfermedades infecciosas.

VI. CONCLUSIONES

En conclusión, las distintas técnicas de tinción bacteriana, como la de Gram y Ziehl-Neelsen, son esenciales
tanto para el diagnóstico médico como para la investigación científica. Cada método tiene su importancia,
ayudando a identificar y clasificar bacterias de manera precisa. Además, los avances tecnológicos permiten
una mayor precisión en los resultados. Aplicar correctamente estas técnicas mejora el control de infecciones
y contribuye al avance de la microbiología, especialmente en áreas como la obstetricia, donde es clave prevenir
enfermedades infecciosas.

ASI QUE:
1. Con esta practica queda claro que conocer y aplicar las técnicas de tinción bacteriana, como Gram y
Ziehl-Neelsen, es básico para poder identificar correctamente las bacterias. Esto nos ayudará a realizar
diagnósticos más precisos y a elegir mejor los tratamientos para combatir las infecciones en la práctica
clínica.
 2. Además, aplicar estas técnicas en el día a día mejora la prevención y el control de las enfermedades
infecciosas. Con los avances tecnológicos, disponemos de métodos más precisos que nos permiten obtener
mejores resultados y esto, por tanto, contribuye al desarrollo de nuevas terapias y estrategias.

RECOMENDACIONES

1. Sería bueno que los profesionales de la salud continúen aprendiendo sobre las nuevas técnicas de tinción
bacteriana porque, con los avances, se pueden obtener mejores diagnósticos.

2. Es recomendable practicar estas técnicas con regularidad para asegurarse de que las bacterias se
identifican correctamente y así mejorar el tratamiento de los pacientes.

3. Por este motivo, también sería útil aplicar estas tinciones en áreas como la obstetricia para prevenir
infecciones y proteger tanto a las madres como a los bebés.

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1. Madigan MT, Martinko MJ, Bender KKS, Buckely DH, Stahl BA, Clarck BP. Brock. “BIOLOGÍA DE LOS
MICROORGANISMOS” 15AVA EDICIÓN (2018)
2. Palomino JC, Leao SC, Ritacco V. “TUBERCULOSIS: DIAGNOSTICO, TRATAMIENTO Y PREVENCIÓN” (2018)
3. Havyland RP. “EL MANUAL: UNA GUÍA PARA SONDAS FLUORESCENTES Y TECNOLOGÍAS DE ETIQUETADO”
14VA EDICIÓN (2010).
4. Barer MR, Magrave L, Moghton M. “EL PAPEL DE LA MICROSCOPÍA EN EL DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES
INFECCIOSAS (200)
5. Ziehl Neelsen A. “MICROBIOLOGÍA DIAGNÓSTICA” 14VA EDICIÓN (2020)