Generalidades
En general, los distintos métodos de aislamiento de ADN comparten algunos pasos
comunes: lisis (rotura de la membrana plasmática), purificación (eliminación de
contaminantes biológicos y químicos) y recuperación del ADN
las muestras de tejido incluían trozos de músculo, lengua y aletas caudales
almacenados en condiciones de congelación (sin alcohol) o en etanol al 90% para ser
analizados utilizando los tres protocolos de extracción de ADN mencionados anteriormente.
Todas las muestras se mantuvieron a -20°C como parte del banco de tejidos de Lutjanidae
en el Laboratorio de Genética Aplicada (LAGA) ,
ARNasa
Extracción de ADN mediante solución salina (NaCl)
Principios: Lisis celular a temperaturas elevadas utilizando detergente aniónico
(SDS) y enzima degradante de proteínas (proteinasa K). Precipitación de proteínas con sal
(NaCl) seguida de precipitación de ADN con isopropanol.
Lisis celular por medio de SDS que es un detergente Capaces de romper las membranas
celular y nuclear, y liberar el ácido nucleico de las células de donde se extraerá el ADN.
Proteinasa K enzima degradante de proteínas.
Sales desnaturalizan y se eliminan las proteínas.
Isopropanol precipita el ADN
Etanol limpia el ADN y quita las sales
Mayor cantidad de concentración y calidad del ADN integridad y pureza
Protocolo
protocolo informado por [ 24 ] se llevó a cabo con ligeras modificaciones. En
primer lugar, se homogeneizaron 20 mg de tejido macerado en 400 µL de solución de lisis
(6,5 ml de Tris-HCL, 2 M, pH 9,0; 10 ml de EDTA 0,1 M, pH 8,0; y 6 ml de SDS al 20 %)
y 5 µL de ARNasa ( 10 mg/ml). Luego, la mezcla se homogeneizó en un vórtex durante 10
segundos y se incubó a 37°C durante 30 minutos. Posteriormente, se agregaron 10 μL de
proteinasa K (10 mg/mL), seguido de incubación a 55°C durante 3 h. Después de
comprobar que el tejido estaba completamente disuelto, se añadieron a cada muestra 350
μL de NaCl (5 M en agua destilada). Las muestras se agitaron nuevamente durante 10
segundos, luego se congelaron durante 1 hora y se centrifugaron durante 30 minutos a
10.000 rpm. El material sobrenadante (600 μL) se transfirió a un tubo nuevo que contenía
600 μL de isopropanol al 100% y se centrifugó a 10.000 rpm durante 15 min. El
sobrenadante se descartó mediante inversión del tubo, se agregaron 500 μL de etanol
refrigerado (70%) al sedimento de ADN y el tubo se centrifugó durante 15 minutos a
10.000 rpm. El líquido se descartó mediante inversión del tubo y el tubo se dejó abierto a
37°C durante 15 min hasta completar la evaporación de los residuos de alcohol. El ADN se
hidrató en un volumen de 35 μL de agua ultrapura a temperatura ambiente durante 12 h y
luego se almacenó a -20°C.
Ventaja La extracción de ADN usando el protocolo con sal común (NaCl) es una
alternativa simple, fácil, rápida y no contaminante que permite obtener ADN de buena
calidad, en cantidades sufi cientes, desde muestras de tejido de peces.
Resultado El protocolo modifi cado de extracción con sal común permitió obtener
un ADN íntegro a partir de muestras de aleta y larva, sin signos de degradación o
fragmentación y con una baja extracción de contaminantes (proteínas y ARN).
Las muestras tratadas con ARNsa mostraron un ADN libre de ARN, lo que contrastó
con los resultados obtenidos en muestras sin tratar con ARNsa (Figura 1a y b), donde el
ADN extraído mostró alta presencia de ARN, pudiendo inter ferir en la correcta cuantifi
cación y amplifi cación del ADN.
arios protocolos de extracción de ADN requieren la utilización de ARNasa para
degradar el ARN, como lo recomienda [
Este protocolo de extracción puede substituir protocolos que utilizan elementos químicos
contaminantes y peligrosos, como es el caso de protocolos con fenol-cloroformo. Cinco
pasos fueron esenciales en el proceso de extracción con sal común: 1. Liberación de
componentes celulares, 2. Eliminación de proteínas y lípidos, 3. Precipitación del ADN
mediante la utilización de NaCl, 4. Remoción del RNA y 5. Almacenaje.
Fenol cloroformo
Principio Lisis celular a temperaturas elevadas utilizando detergente aniónico (SDS) y
enzima degradante de proteínas (proteinasa K). Purificación de ADN con fenol, cloroformo
e isopropanol. Precipitación de ADN con etanol.
Lisis celular por medio de SDS que es un detergente Capaces de romper las membranas
celular y nuclear, y liberar el ácido nucleico de las células de donde se extraerá el ADN.
Proteinasa K enzima degradante de proteínas
Fenol observe las proteínas
Cloroformo contiene y separa los lípidos
Isopropanol precipita el ADN
Etanol limpia eel ADN y quita las sales
Protocolo
El protocolo de [ 25 ] se realizó con algunas modificaciones. Se colocaron
aproximadamente 20 mg de tejido macerado en un tubo Eppendorf de 1,5 ml que contenía
600 µl de tampón de lisis (Tris-HCL, 2 M, pH 9,0; EDTA, 0,1 M, pH 8,0; SDS al 20 % y
agua destilada). Después de agregar 5 μL de RNAsa, la solución se incubó a 37°C durante
30 min. Luego se agregaron 15 μL de Proteinasa K, seguido de incubación durante 3 h de
incubación en una cámara húmeda a 55°C o hasta que el tejido se disolvió por completo.
Realizamos dos pasos de lavado en el material lisado. En primer lugar, agregamos 700 μL
de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (proporción 25:24:1), mezclamos la solución
manualmente durante 10 minutos para homogeneizar la mezcla y luego centrifugamos las
muestras a 10,000 rpm durante 10 minutos. Posteriormente, se eliminó el sobrenadante y se
transfirió a un tubo nuevo que contenía 700 μL de cloroformo-alcohol isoamílico (relación
24:1), que nuevamente se mezcló manualmente durante 10 min y se centrifugó a 10.000
rpm durante 10 min. La capa superior de sobrenadante se eliminó cuidadosamente y se
transfirió a otro tubo Eppendorf, seguido de la adición de 100 µl de acetato de sodio (AcNa
3 M, pH 4,8) y la homogeneización. Para precipitar el ADN extraído, se agregaron 700 μL
de isopropanol a temperatura ambiente y las muestras se almacenaron a -20 °C durante 1 h.
Luego, los tubos que contenían los sedimentos de ADN se centrifugaron durante 10
minutos a 10.000 rpm y el sobrenadante se descartó cuidadosamente. Posteriormente, se
agregaron 200 μL de etanol al 70% a -4°C y las muestras se centrifugaron nuevamente
durante 5 min a 10.000 rpm. Se descartó el sobrenadante y el sedimento de ADN se secó a
37°C. Finalmente, el ADN se hidrató en 35 μL de agua ultrapura durante 12 h y luego se
almacenó a -20°C.
Desventaja
Tradicionalmente, los protocolos de extracción de ADN basados en la adición de
disolventes orgánicos, como fenol y cloroformo, se han utilizado con frecuencia para aislar
ADN genómico de especies animales (Lopera-Barrero et al., 2008). Aunque estos métodos
producen resultados aceptables para muestras de diversos orígenes, consumen mucho
tiempo y requieren el uso de reactivos que no sólo pueden contaminar químicamente el
ADN extraído, sino que también representan un peligro para la salud (Yue y Orban, 2001).
El fenol y el cloroformo son disolventes orgánicos altamente tóxicos que provocan
quemaduras en la piel, hepatotoxicidad, nefrotoxicidad y carcinogénesis
Ventajas uso del protocolo de extracción con fenolcloroformo ha sido el método más usado
para obtener ADN genómico de peces. Estos protocolos tienen buenos resultados para
muestras de diversos orígenes.
La fase superior es acuosa y contiene el DNA y el RNA. Esta parte contiene el buffer, la
parte hidrófila (soluble en agua), el DNA…
La fase inferior contiene el fenol. En la fase de abajo se encuentran todas las moléculas
hidrofóbicas (no solubles en agua) junto con el fenol y el cloroformo.
La interfase gruesa y blanquecina está formada por la coagulación de las proteínas
desnaturalizadas por el fenol y el cloroformo.
Por lo general, la presencia de proteínas y residuos como fenol y etanol está implicada en
los valores reducidos en la proporción 260/280
El kit comercial (Promega)
Principio
Lisis celular con detergente, tratamiento con RNasa, precipitación de proteínas con
tampón que contiene sal (NaCl); concentración de ADN y desalación con isopropanol.
RNasa elimina el ARN enzima
Protocolo
nicialmente, se prepararon 60 µL de solución de EDTA 0,1 M (pH 8,0) y 250 µL de
solución de lisis de núcleos en un tubo Falcon (15 ml) para cada muestra. Esta solución
permaneció en el frigorífico durante aproximadamente 5 min. El tejido macerado
(aproximadamente 20 mg) se colocó en tubos Eppendorf de 1,5 ml que contenían 300 µl de
solución de lisis de núcleos/EDTA refrigerada (un tubo por muestra). Posteriormente, se
agregaron 5 μL de ARNasa a cada tubo, se agitaron durante 10 segundos y luego se
incubaron a 37 ° C durante 30 minutos. Luego, se agregaron 10 μL de proteinasa K a cada
muestra, seguido de una incubación a 55°C durante 3 h. Posteriormente, se agregaron 100
μL de solución de precipitación de proteínas a cada tubo a temperatura ambiente y la
solución se agitó a velocidad máxima durante 10 s. Las muestras se mantuvieron a -20oC
durante 10 min y luego se centrifugaron durante 6 min a 13.000 rpm. El sobrenadante que
contenía ADN se eliminó cuidadosamente y se transfirió a tubos nuevos que contenían 300
μL de isopropanol. La solución se mezcló suavemente mediante inversión del tubo y se
centrifugó durante 10 minutos a 13.000 rpm. Luego se descartó con cuidado el
sobrenadante. Se agregaron 300 μL de etanol al 70% a temperatura ambiente, se invirtieron
los tubos varias veces para lavar el ADN y luego se centrifugaron las muestras durante 5
min a 13.000 rpm. El etanol se descartó cuidadosamente mediante inversión del tubo.
Luego, los tubos se dejaron abiertos a 37°C durante 15 min hasta la completa evaporación
del alcohol. La rehidratación se realizó con 35 μL de agua ultrapura durante 12 h. Después
de este período, los productos de ADN extraídos se almacenaron a -20°C.
kits de extracción de ADN requieren reactivos listos para usar, lo que reduce el tiempo de
preparación del material y exige un número reducido de pasos operativos, lo que hace que
todo el proceso sea simple y fácil de realizar incluso por un técnico no capacitado. Por otro
lado, si bien los kits comerciales son métodos sencillos y que ahorran tiempo, su utilización
aumenta el costo asociado con la extracción de una muestra individual
El kit comercial (Promega) presentó los mejores rendimientos en el estudio de [ 67 ],
debido al mayor volumen de tejido biológico y la cantidad más significativa de Proteinasa
K utilizada respecto a los otros métodos analizados
En cambio, nosotros estandarizamos la cantidad de tejido biológico (20 mg) y Proteinasa K
(10 μL) para los métodos salinos y el kit comercial, eliminando estos factores de los
resultados.