UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN
FACULTAD DE AGRONOMÍA
Reporte de prácticas
Bioquímica de alimentos
Docente: Dra. Sugey Sinagawa Ramona García
Enix Yanaris Guzman Jimenez 1953160
Extracción de proteínas 1
Práctica 1: Extracción de proteínas
Introducción:
Las proteínas son biomoléculas formadas básicamente por carbono, hidrógeno,
oxígeno y nitrógeno. Pueden, además, contener azufre y en algunos tipos de
proteínas, fósforo, hierro, magnesio y cobre entre otros elementos. Son
polímeros de aminoácidos que están unidos mediante enlaces peptídicos. Sus
propiedades químicas dependen de su composición en aminoácidos, y, por lo
tanto, están sujetas a las propiedades químicas de los mismos.
La extracción de proteínas implica la ruptura de las células o tejidos de la fuente biológica
para liberar las proteínas contenidas en su interior, seguidas de una serie de pasos para
separarlas y purificarlas. La elección de los métodos y condiciones de extracción depende
de factores como la naturaleza de la proteína (su tamaño, carga, solubilidad y estabilidad),
el tipo de célula o tejido, y el objetivo final de la purificación. Entre los métodos más
comunes se incluyen la centrifugación, la homogeneización y la lisis celular, así como el uso
de solventes, detergentes y agentes químicos específicos.
Propósito: El alumno aprenderá a desarrollar métodos de extracción de proteínas
comparará la eficacia de cada solvente usado.
Objetivo: desarrollar métodos de extracción de proteínas para comparar la
eficacia de cada solvente usado.
Materiales y reactivos:
• Agua destilada
• Harina de trigo
• 100 ml de solución de 0.1M Tris HCl pH 6.8 con NaCL al 0.5 M
• Acetona fría
Equipos y materiales:
• Micropipetas
• Tubos de 15 ml
• Centrifuga refrigerada
• Incubadora
• Vortex
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• Termómetro
• Gradilla para tubos
• Hielo
Metodología:
1. Pesar 6.25 gramos de harina de maíz.
2. Agregar 60 ml de agua.
3. Colocar en plancha de agitación durante 10 minutos.
4. Preparar solución salina de 200ml a la 0.1M.
5. Posteriormente, centrifugar a 6,000 rpm durante 15 minutos a una
temperatura de 4 ºC.
6. Extraer sobrenadante (solución acuosa).
7. Repetir procedimiento anterior, pero cambiando los 60 ml de agua a
60 ml de solución salina previamente preparada.
8. Descartar sobrenadante.
9. Re suspender precipitado en un volumen de 500 µl.
10. Finalmente, el resuspendido será la fuente de proteínas.
Resultados:
Descripción de los extractos obtenidos, así como discutir el protocolo realizado
las modificaciones y los puntos críticos.
Descripción de los resultados, volumen de los extractos obtenidos,
características, etc.
Conclusión:
En conclusión, la extracción de proteínas es un proceso esencial para obtener
proteínas de alta calidad y funcionalidad a partir de diversas fuentes biológicas.
A través de técnicas especializadas, es posible separar y purificar las proteínas
de otros componentes no deseados, lo que permite su uso en una amplia gama
de aplicaciones industriales, alimentarias y científicas. La eficiencia y éxito del
proceso dependen de varios factores, como la elección del método de
extracción, las condiciones de purificación y el tratamiento posterior, lo que
asegura que las proteínas obtenidas cumplan con los requisitos de pureza y
funcionalidad necesarios. Con el avance de las tecnologías, las técnicas de
extracción continúan evolucionando, permitiendo mejorar los rendimientos y la
calidad de las proteínas de manera más sostenible y eficiente.
Cuestionario
0. ¿Cuáles son los criterios que se deben de considerar en los procesos de
extracción de proteínas? Se deben considerar la fuente de la proteína, su
concentración, solubilidad, estabilidad, cargas, la naturaleza celular,
temperatura, tiempo de proceso, costos y disponibilidad de equipos.
Extracción de proteínas 3
1. ¿Por qué cree que debe haber variación en el proceso de extracción
dependiente del solvente? La variación en el proceso de extracción
dependiendo del solvente es necesaria porque las proteínas tienen una amplia
diversidad en cuanto a sus propiedades físico-químicas (como su carga,
estructura y solubilidad). Esto implica que responden de manera diferente a
distintos solventes, los cuales pueden alterar sus conformaciones, solubilidad y
actividad biológica. Por lo tanto, el solvente debe seleccionarse en función de las
características específicas de cada proteína para maximizar la eficiencia de la
extracción sin causar desnaturalización o pérdida de actividad.
2. Si usted evaluara varios solventes para establecer un método de
extracción de proteínas (enzimas), ¿qué criterios tomaría en cuenta para su
selección? Consideraría la solubilidad de la enzima, la capacidad del solvente
para no desnaturalizarla, su facilidad de eliminación, costo, disponibilidad y
seguridad.
3. Si usted quisiera a partir de los extractos seleccionados purificar su
proteína (enzima), ¿qué criterios tomaría en cuenta para seleccionar el tipo
de técnicas cromatográfica? Tomaría en cuenta la hidrofobicidad, estabilidad,
afinidad de la proteína, tamaño molecular, costo del equipo y escalabilidad del
proceso.
Práctica 2: Cuantificación de la concentración de proteínas (enzimas)
extraídas a partir de diferentes fuentes por el método de Lowry
Introducción:
Extracción de proteínas 4
La cuantificación precisa de proteínas es un paso crucial en la investigación
bioquímica, biotecnológica y en aplicaciones industriales. Uno de los métodos
más utilizados para la determinación de la concentración proteica es el método
de Lowry, desarrollado en 1951 por Lowry y colaboradores. Este método es
ampliamente empleado debido a su alta sensibilidad y confiabilidad, permitiendo
medir concentraciones de proteínas en un rango desde microgramos hasta
miligramos por mililitro. El método de Lowry se basa en una reacción química
entre los grupos fenólicos presentes en los residuos de tirosina y triptófano de
las proteínas con el reactivo de Folin-Ciocalteu. En presencia de proteínas, este
reactivo produce un cambio de color en la muestra que puede ser medido
espectrofotométricamente. La intensidad de este cambio es proporcional a la
concentración de proteínas en la muestra.
Propósito: El alumno aprenderá a determinar la concentración de proteínas por
el método de Lowry.
Materiales biológicos y reactivos:
• Solución Standard de Albumina Bovina (2 mg/ml).
• -Reactivo de Lowry, compuesto por tres soluciones que se mezclan en
el momento de su utilización, y que son las siguientes:
A: Carbonato sódico al 2% en NaOH 0.1 M
B: Sulfato cúprico al 1%
C: Tartrato sódico-potásico al 2%
Nota: En el momento de su uso se mezclan 50 ml de A con 0.5 ml de B y 0.5 ml
de C.
• Reactivo de fenoles de Follin-Ciocalteau. Este reactivo viene preparado
comercialmente y se debe mantener en refrigeración. Para su uso se
diluye inmediatamente antes en la relación de 1 parte de reactivo por 2
de agua destilada.
• Extractos enzimáticos
Equipos y Materiales:
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• Espectrofotómetro
• Micropipetas
• Microtubos
• Incubadora• Vortex
• Gradilla para tubos
• Hielo.
Metodología:
1. Preparación de los reactivos tal como se describen arriba en la sección de
material biológico y reactivos
2. Preparación de la curva de calibración según la siguiente tabla:
3. Se agita vigorosamente y se deja reposar durante 10 min
4. Agregar 100 µL del reactivo de Follin-Ciocalteau
5. Se agita vigorosamente y se deja reposar durante 45 min en obscuridad
total
6. Leer las muestras en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 700
nm
7. Para la lectura de las muestras se sigue el mismo procedimiento que para
la curva, solo se sustituye la albumina por 100 µL de la muestra problema.
Resultados:
Extracción de proteínas 6
Solución acuosa Solución salina
0.679 0.526
0.478 0.552
0.476 0.562
Conclusión
Este método es particularmente útil cuando se extraen proteínas o enzimas de
diversas fuentes biológicas, como células, tejidos o fluidos biológicos. La
cuantificación precisa de la proteína extraída es fundamental para la
caracterización, purificación y análisis funcional de las proteínas de interés, como
las enzimas, que tienen un papel esencial en una amplia gama de procesos
metabólicos y biotecnológicos.
Cuestionario
1. Explique el fundamento del método de cuantificación de proteínas utilizado:
La elección del método de cuantificación de proteínas dependerá del tipo de
muestra, la pureza de la proteína y la sensibilidad requerida. Los métodos más
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comunes se basan en reacciones colorimétricas, donde la intensidad del color
generado es proporcional a la concentración de proteína. Estos métodos
aprovechan las propiedades químicas de las proteínas, como la presencia de
enlaces peptídicos, residuos aromáticos o grupos funcionales específicos.
2. ¿Por qué hay variaciones en el contenido de proteínas a partir de las
diferentes solventes de extracción utilizados?
El contenido de proteínas obtenido en una extracción puede variar
significativamente dependiendo del solvente utilizado. Esto se debe a que la
solubilidad de una proteína está influenciada por factores como:
Naturaleza de la proteína: Su composición de aminoácidos y estructura
tridimensional determinan su interacción con el solvente.
Propiedades del solvente: La polaridad, fuerza iónica y pH del solvente afectan
la solubilidad de las proteínas.
Interacciones moleculares: Las proteínas pueden interactuar con otras
moléculas en la muestra, lo que afecta su extracción.
Condiciones de extracción: La temperatura, el tiempo de extracción y la fuerza
centrífuga también influyen en la eficiencia de la extracción.
3. Explique que otros métodos para cuantificar proteínas existen y
fundaméntelos:
Además del método de Bradford, existen otros métodos ampliamente utilizados
para cuantificar proteínas:
• Método de Lowry: Combina la reacción de Biuret con la reducción del
reactivo de Folin-Ciocalteau.
• Método BCA: Utiliza el reactivo de ácido bicinconínico, que forma un
complejo coloreado con las proteínas.
• Espectrofotometría UV: Mide la absorbancia de las proteínas a 280 nm
debido a los anillos aromáticos de los aminoácidos triptófano y tirosina.
• Métodos inmunológicos: Utilizan anticuerpos específicos para detectar y
cuantificar proteínas.
• Espectrometría de masas: Permite identificar y cuantificar proteínas a
nivel molecular.
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Practica 3: Detección de la actividad enzimática
Introducción:
La actividad enzimática es un parámetro clave para evaluar la funcionalidad de
una enzima en diversos procesos biológicos y aplicaciones industriales. Las
enzimas son proteínas biológicas que catalizan reacciones químicas específicas,
acelerando la conversión de sustratos en productos sin ser consumidas en el
proceso. La capacidad de una enzima para realizar esta función catalítica,
conocida como su actividad, puede ser medida y cuantificada a través de
diversos métodos experimentales.
La detección de la actividad enzimática es esencial en estudios bioquímicos,
biotecnológicos y farmacológicos, donde se busca comprender el mecanismo de
acción de las enzimas, su eficiencia en condiciones específicas, o su potencial
en aplicaciones industriales como la producción de biofármacos,
biocombustibles, y alimentos. La actividad enzimática también se mide para
evaluar el impacto de factores como el pH, la temperatura, la concentración de
sustrato, y la presencia de inhibidores o activadores.
Existen múltiples enfoques para medir la actividad enzimática, dependiendo del
tipo de enzima y la reacción que cataliza. Entre los métodos más comunes se
incluyen la medición de la producción o consumo de productos, la modificación
de las características espectrofotométricas de los reactivos, o el uso de sustratos
cromogénicos que generan un cambio de color en la presencia de la enzima
activa. Estas técnicas permiten calcular la velocidad inicial de la reacción, la
afinidad de la enzima por su sustrato, y otros parámetros cinéticos importantes,
como la constante de Michaelis (Km) y la velocidad máxima (Vmax).
Propósito: El alumno aprenderá a cuantificar la actividad enzimática tipo α-
amilasas
Materiales biológicos y reactivos:
• Extractos enzimáticos
• Reactivo DNS
• Maltosa para curva estándar solución stock 2 mg/mL
Extracción de proteínas 9
• Buffer de reacción - El buffer en el que se llevara a cabo la reacción es una
solución de Na2HPO4 20 mM con 6.7 mM de NaCl pH 5 y pH 6. EL pH se
ajustará con ácido cítrico 0.1 M.
• Sustrato de almidón al 1% en buffer de reacción (pH5 y pH6) y
calentando para favorecer la disolución del almidón.
• Solución de amilasa de saliva (como control positivo).
Equipos y Materiales:
• Espectrofotómetro
• Micropipetas
• Microtubos
• Incubadora
• Vortex
• Gradilla para tubos
• Hielo.
Metodología:
1. Realizar la curva estándar de maltosa de acuerdo con la siguiente tabla:
Para la curva de maltosa, por triplicado, se realizaron diluciones de la
misma utilizando el stock de 2 mg/mL
2. Agregar 100 µL de reactivo de DNS
[Link] los tubos en baño maría por 5 min en hielo molido.
[Link] 900 µL de agua destilada a cada uno de los tubos
[Link] lectura en el espectrofotómetro a 540 nm
[Link] amilasa de saliva humana como control positivo
[Link]ón de las muestras se sigue el mismo procedimiento, pero su usa
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la muestra enzimática de acuerdo con la siguiente tabla:
*la primera incubación se realizó durante 30 min a la temperatura
designada en la tabla
*después del baño maría NO se incubo en hielo molido
8. Una vez obtenido el volumen total se procede a dar lectura mediante
espectrofotometría a 540 nm
9. Cálculos:
Al momento de realizar la curva estándar de maltosa se adquieren 2
lecturas de absorbancias por cada una de las diluciones preparadas
(duplicado), estas lecturas se promedian, se grafican y se obtiene la
ecuación de la recta y= mx + b
Donde: y corresponde a la absorbancia X representa la concentración de la
muestra
Resultados:
• Datos de las absorbancias de la curva estándar de maltosa
• Grafica de la curva estándar de maltosa
• Cálculos de la actividad enzimática de acuerdo con las lecturas de
absorbancias y ecuación de la línea recta de la curva estándar
• Cálculos de las unidades de actividad enzimática especifica (U/ml) y
realice el cálculo para expresarlos en U/mg de proteína, con el uso de
las concentraciones de proteínas.
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Conclusión:
La detección de la actividad enzimática es un componente esencial en el estudio
de las enzimas y sus aplicaciones biotecnológicas. A través de métodos
experimentales adecuados, es posible medir la capacidad de las enzimas para
catalizar reacciones químicas de manera eficiente, proporcionando información
valiosa sobre su funcionalidad, condiciones óptimas de trabajo y potencial para
aplicaciones industriales. Además, la cuantificación de la actividad enzimática
permite una comprensión más profunda de los mecanismos bioquímicos
involucrados en diversas rutas metabólicas.
Cuestionario:
1. ¿Explique la importancia de medir la actividad enzimática en términos de
¿Unidades de actividad por minuto?
Comparación: Permite comparar la actividad entre diferentes muestras.
Pureza: Evalúa la pureza de preparaciones enzimáticas.
Cinética: Determina parámetros cinéticos como Vmax y Km.
Monitoreo: Sigue el progreso de reacciones enzimáticas.
Control de calidad: Garantiza la calidad de productos enzimáticos.
2. ¿Por qué hay variaciones en el contenido de actividad enzimática de
diferentes muestras?
Tipo de tejido: Diferentes tejidos expresan diferentes enzimas.
Estado fisiológico: La actividad enzimática varía con el estado del organismo.
Condiciones de extracción: El proceso de extracción afecta la actividad
enzimática.
Purificación: La purificación puede causar pérdida de actividad.
3. ¿Cuáles son las condiciones que se deben de considerar al medir la
actividad enzimática de una enzima?
pH: Cada enzima tiene un pH óptimo.
Temperatura: Afecta la velocidad de reacción.
Concentración de sustrato y enzima: Influyen en la velocidad de reacción.
Tiempo de incubación: Debe ser suficiente para una reacción detectable.
Cofactores y coenzimas: Algunos son necesarios para la actividad enzimática.
Inhibidores: Pueden reducir o eliminar la actividad.
4. ¿Que función tiene el almidón en la reacción?
Sustrato: Puede ser el sustrato sobre el que actúa la enzima (ej: amilasa).
Agente gelificante: Proporciona un medio viscoso para la reacción.
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Bibliografías:
Nelson, D. L., & Cox, M. M. (2017). Lehninger: Principios de bioquímica (7ª
ed.). Omega.
Voet, D., Voet, J. G., & Pratt, C. W. (2016). Fundamentos de bioquímica: La
vida a nivel molecular (4ª ed.). Panamericana.
Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., & Randall, R. J. (1951). Protein
measurement with the Folin phenol reagent. Journal of Biological Chemistry,
193(1), 265-275.
Hummel, B. C. W. (1959). A method for rapid determination of proteins in dilute
solution. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology, 37(12), 239-245.
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