BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLAFACULTAD DE CIENCIAS

QUÍMICAS
LICENCIATURA: QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA

Practica No. 1
Seminario: pruebas de hemaglutinación (HA) e inhibición de lahemaglutinación
(IHA) fundamentos y aplicaciones

Introducción
Desde el descubrimiento de los virus se estableció que, de acuerdo con sus propiedades moleculares,
estos agentes infecciosos requieren del empleo de sistemas biológicos para su reproducción; esta
condición hace particularmente difícil emplear sistemas adecuados tales como los animales de
laboratorio o cultivos celulares. De esta manera se tuvieron que buscar alternativas para el estudio de
virus en el laboratorio que eliminasen la necesidad de emplear células vivas.
Prueba de Hemaglutinación (HA)
Inicialmente, la HA se aplicó para el análisis del virus Influenza, sin embargo, se puede aplicar para
otros viriones que posean proteínas estructurales con capacidad hemaglutinante. El nombre de
hemaglutinación se debe al hallazgo de que los virus Influenza podían aglutinar eritrocitos;
posteriormente se determinó que el origen de esta propiedad se debía a la existencia de una
glicoproteína presente en la envoltura viral a la cual se le denominó hemaglutinina. Esta proteína actúa
como el ligando viral que reconoce a su receptor en células blanco. En términos generales, este receptor
corresponde a moléculas de ácido siálico presentes sobre la superficie de diversos tipos celulares,
organizadas en diferentes enlaces químicos con otros carbohidratos.
La función de la hemaglutinina viral no es simplemente aglutinar eritrocitos, sino mediar la adsorción
en la replicación viral, pero sus propiedades son empleadas para desarrollar pruebas de selección tal
como la hemaglutinación. Esta prueba de presenta algunas ventajas, perotambién limitaciones que se
enlistan a continuación:
 Fig. 1 Ilustración del virus Influenza

Ventajas:
• Desarrollo sencillo.
• No requiere de una infraestructura elaborada.
• Económica.
• Ideal cuando se emplean muestras con alta concentración de viriones.
• Aplicación en ensayos que orientan sobre la naturaleza química de receptores celulares.
Limitaciones:
• Empleada sólo como diagnóstico presuntivo.
• Especificidad limitada por agentes no virales que pueden hemaglutinar
• Poca sensibilidad.
• Riesgo de obtención de resultados falsos negativos.

El fundamento de esta prueba consiste en poner de manifiesto la presencia de viriones con proteínas
hemaglutinantes que reconocen receptores celulares. De esta manera, los virus se unirán a los
eritrocitos de diferentes especies siempre que posean en su superficie moléculas de ácido siálico (fig.2).
 Fig. 2. Representación de la reacción de HA

Esta prueba requiere contar con muestras que contengan un número elevado de viriones, tales como
suspensiones virales provenientes de lotes vacunales, cosechas virales obtenidas de células en cultivo,
o bien, muestras clínicas tomadas durante la fase aguda de la enfermedad.
Para procesar las muestras se preparan diluciones seriadas al doble, desde una dilución 1:10 hasta
1:1280 empleando como diluyente solución reguladora de fosfatos. Posteriormente a cada dilución se
le adiciona la misma cantidad de una suspensión de eritrocitos preparada al 1%, incluyendo un control
de reacción que solo contendrá solución reguladora de fosfatos y eritrocitos.
El soporte para llevar a cabo este ensayo son microplacas de 96 pozos con fondo en U, de tal manera
que los eritrocitos aglutinados forman una “red o malla” en el fondo del pozo, mientras que los no
aglutinados sedimentan por gravedad formando un “botón” homogéneo (fig. 3).

Fig. 3. Sedimentos en la prueba de HA

Una prueba de HA positiva sugiere la presencia de un virus con capacidad hemaglutinante en la muestra,
sin embargo, la identificación final del virus debe establecerse con un ensayo complementario.
Prueba de Inhibición de la Hemaglutinación (IHA)
Para realizar un diagnóstico viral definitivo debe llevarse a cabo una prueba que demuestre un tipo de
respuesta específica del huésped hacia un virus en particular, tal como la producción de anticuerpos
que se pone de manifiesto en pruebas del tipo de la Inhibición de la Hemaglutinación (IHA).
Este ensayo se basa inicialmente en la unión de anticuerpos específicos con la hemaglutinina viral, tal
que se impida en una reacción posterior, la formación de puentes entre los ligandos virales y los
receptores presentes sobre la superficie de los eritrocitos que darían lugar a una reacción de
hemaglutinación.
La prueba de IHA, puede representarse esquemáticamente de la siguiente manera:

Primera etapa: Reconocimiento Ag viral – Ac

Viriones con proteínas Anticuerpos anti-HA Neutralización

hemaglutinantes de proteínas
hemaglutinantes
Segunda etapa: Reacción de complejos Ag-Ac con eritrocitos

La presencia de anticuerpos que puedan reconocer aislamientos virales permite realizar un diagnóstico
específico, tomando como base un principio fundamental en inmunología el cual establece que la
presencia de anticuerpos en un hospedero, es la consecuencia de una exposición previa al antígeno que
originó su producción.
En esta prueba se realizan diluciones seriadas al doble de un suero que contenga anticuerpos contra un
virus hemaglutinante, iniciando con una dilución 1:2 y hasta alcanzar 1:256. A cada dilución del suero
se le agregan 4 unidades hemaglutinantes (concentración que seconoce a través de un ensayo preliminar
de hemaglutinación) de un virus determinado, incubando durante 10 minutos para permitir el
reconocimiento Ag-Ac. Finalmente se adiciona una suspensión de eritrocitos al 1%. Al igual que en la
prueba de hemaglutinación, se incluye un control de reacción que solo contendrá solución reguladora
de fosfatos y eritrocitos. Si el ensayo se realiza en microplacas de 96 pozos con fondo en U, los
resultados esperados serán lossiguientes:

Fig.4. Sedimentos correspondientes a las pruebas de IHA+ e IHA –

 CUESTIONARIO

• Fundamento teórico:
Explica el principio básico de las pruebas de hemaglutinación (HA) y cómo se utiliza esta técnica para
detectar la presencia de virus en una muestra.

• Aplicaciones prácticas:
Menciona dos aplicaciones clínicas o de investigación de la prueba de hemaglutinación y describe cómo
contribuyen al diagnóstico o estudio virológico.

• Inhibición de hemaglutinación (IHA):

¿Qué mide la prueba de inhibición de la hemaglutinación (IHA) y cuál es la importancia de los
anticuerpos en esta técnica?

• Interpretación de resultados:
Si en una prueba de hemaglutinación se observa aglutinación en los pozos con bajas diluciones pero no
en los de altas diluciones, ¿cómo interpretarías este resultado? ¿Qué indica esto sobre la concentración
del virus y su capacidad hemaglutinante?

• Diseño experimental:
Describe cómo prepararías una prueba de inhibición de hemaglutinación para determinar la eficacia de
un suero específico contra un virus hemaglutinante. ¿Qué controles incluirías y por qué?
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CIENCIAS QUÍMICAS
LICENCIATURA: QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA

Practica No. 2
Pruebas de hemaglutinación (HA) para el diagnóstico preliminar del virus dela
enfermedad de Newcastle
Introducción
Muchos virones animales posen en su envoltura proteínas codificadas por el genoma viral capaces de
unirse con eritrocitos. Tales virus pueden por tanto formar puentes entre los glóbulos para constituir
una red. Este fenómeno conocido como Hemaglutinación fue primeramente descrito para el análisis
del virus Influenza. En este caso la proteína hemaglutinante (Hemaglutinina) en la superficie del virión
es una glicoproteína que en adición de la Neuraminidasa se proyecta en la envoltura viral. El virión
se unirá a cualquier eritrocito de la especie que sea siempre que lleve los receptores complementarios
que en este caso son moléculasde Acido N-Acetil-Neuramínico.
El virus de la enfermedad del Newcastle es un miembro de la familia Paramyxoviridae; esun patógeno
primario de aves en quienes produce infecciones respiratorias y digestivas con trastornos ocasionales
en el S.N.C. que conducen a parálisis y muerte; en el humano puede ocasionalmente producir
conjuntivitis autolimitada.
Se requieren aproximadamente 107 viriones de Newcastle para causar aglutinación, por lo que la
Hemaglutinación no es un indicador sensible de la presencia de pequeñas cantidades de viriones pero
por su simplicidad constituye un ensayo conveniente si se dispone de grandes cantidades de viriones.
Objetivos
1. El alumno dominará el manejo de la técnica de la reacción de Hemaglutinación (HA).
2. El estudiante determinará la concentración de viriones presentes en una suspensión, la
cual expresará en Unidades Hemaglutinantes (UHA).
Material
▪ Solución reguladora de fosfatos (SRF) de Dulbecco con pH = 7.2
▪ Microplacas de poliestrireno con fondo en U.
▪ Micropipetas de volúmen variable de 20- 200 L.
▪ Puntillas para micropipeta.
▪ Vacuna viral (viriones atenuados, cepa La Sota)
▪ Suspensión de glóbulos rojos de pollo al 1% en solución reguladora de fosfatos con pH =
7.2.

▪ Solución de Hipoclorito de Sodio 1:10 en agua destilada.

▪ Algodón alcohol al 70%.
▪ Recipiente para recolectar desechos.
Metodología
1. Empleando solución reguladora de fosfatos con pH = 7.2, realizar una serie de diluciones
seriadas al doble de la vacuna viral, desde 1:10 hasta 1:1280 (Esquema No. 1); es muy
importante incluir un pozo control que no contendrá virus. PASOS:
a. En un frasco con tapón de rosca preparar una dilución 1:10 de la vacuna viral. Agregar
al pozo A1 de la microplaca 200 L de la dilución 1:10.
b. Agregar 100 L de solución reguladora de fosfatos con pH = 7.2 de los pozos A2 hasta
el A9.
c. Transferir 100 L de la dilución 1:10 al pozo A2, homogenizar por pipeteo suave.
d. Nuevamente transferir 100 l de ésta dilución (1:20) al pozo A3 mezclando en forma
homogénea; de esta manera se obtendrá ahora una dilución 1:40.
e. Repetir este procedimiento hasta el pozo A8 que corresponderá a una dilución 1:1280.
f. Desechar 100 L de la suspensión viral del pozo A8, tranfiriéndolos al pozo A12 y
teniendo cuidado en no agregar dilución viral al pozo A9 que sirve como control de la
reacción.
 Esquema No. 1

2. Agregar a todos los pozos 100 L de una suspensión al 1% de glóbulos rojos de pollo
(comenzar del pozo A9 hacia el A1).
3. Rotar la microplaca sobre la mesa de trabajo e incubar a temperatura ambiente hasta que
los eritrocitos del pozo A9 hayan sedimentado.
4. Identificar la última dilución en que se presente una reacción positiva de hemaglutinación,
la cual corresponderá a 1 unidad hemaglutinante (1 UHA), es decir, la concentración
mínima de viriones que es capaz de aglutinar una suspensión de referencia de eritrocitos de
pollo al 1% en solución reguladora de fosfatos con pH = 7.2.
5. Reconocer la dilución del virus vacunal que contenga 4 UHA.
Cuestionario
1. Mencione tres ejemplos de virus que puedan ser analizados mediante la prueba de HA.
2. Anote dos razones por las que se puedan obtener resultados falsos negativos en la prueba
de HA.
3. ¿De qué otra especie animal se pueden emplear eritrocitos para la prueba de HA?
4. ¿Porque la prueba de HA no se considera confirmatoria?
5. ¿Cuál sería la muestra clínica para diagnosticar infección por virus del Newcastle
aplicando la prueba de HA.?
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CIENCIAS QUÍMICAS
LICENCIATURA: QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA

Practica No. 3
Prueba de inhibición de la hemaglutinación (IHA) para el diagnóstico
definitivo del virus de la enfermedad del Newcastle
Introducción
La prueba de Hemaglutinación es un diagnóstico preliminar de enfermedad por virus Newcastle, de
manera que si resulta positiva, no permite concluir que este virus sea el agente causal del cuadro clínico
en el ave con enferma.
Con base en lo anterior, para realizar un diagnóstico definitivo se debe demostrar una respuesta
específica del huésped hacia este virus, determinando la presencia de anticuerpos por medio de la
reacción de Inhibición de la Hemaglutinación (IHA).
Esta prueba se basa en la unión de un anticuerpo específico hacia la hemaglutinina del virión que impida
la formación de puentes entre el ligando viral y el receptor celular. Este hecho permite identificar
completamente a virus hemaglutinantes y se conoce también como neutralización vírica.
Objetivos
1. El estudiante desarrollará la técnica de Inhibición de la Hemaglutinación para determinar
el título de un suero problema.
2. El alumno será capaz de interpretar los resultados obtenidos al realizar esta prueba de
identificación viral.
Material
▪ Solución reguladora de fosfatos (SRF) de Dulbecco con pH = 7.2.
▪ Microplaca de poliestireno de 96 pozos con fondo en U.
▪ Micropipetas de volúmen variable de 20- 200 L.
▪ Puntillas para micropipeta.
▪ Vacuna viral (viriones atenuados, cepa La Sota).
 ▪ Suspensión de glóbulos rojos de pollo al 1%.
▪ Suero problema.
▪ Solución de Hipoclorito de Sodio 1:10 en agua destilada.
▪ Algodón y alcohol al 70%.
▪ Recipiente para recolectar desechos.

Metodología
Con base en los resultados de la práctica anterior, preparar en un frasco con tapón derosca una
dilución del virus de la enfermedad de Newcastle que contenga 4 UHA, empleando solución reguladora
de fosfatos; considerar un volumen suficiente para realizar la prueba de IHA. De esta manera, si el
resultado de la práctica de HA hubiese sido:
Dilución 1:40 de la vacuna viral = 1 UHA, Por lo tanto: Dilución
1:10 de la vacuna viral = 4 UHA
Volúmen suficiente para realizar la prueba de IHA = 2 ml. Entonces:
Vacuna viral concentrada 200 l
+
SRF 1800 l

Volúmen final 2000 ml de una dilución viral con 4 UHA

1. Hacer diluciones seriadas al doble del suero problema, desde 1:2 hasta 1:256 de acuerdo
al esquema No. 2; incluir un pozo control que no contendrá antisuero ni suspensión viral:
a) Agregar 100 L de una dilución 1:2 del suero problema al pozo A1.
b) Adicionar 50 L de SRF de los pozos A2 al A8; en el pozo A9 colocar 100 l de la misma solución.
c) Transferir 50 L del pozo A1 al pozo A2, homogenizar por pipeteo suave para obtener una dilución
del suero problema de 1:4.
d) Nuevamente transferir 50 l ahora del pozo A2 al A3 (para obtener una dilución 1:8), homogenizar
y repetir el procedimiento hasta el pozo A8 que corresponderá a una dilución 1:256.
e) Desechar 50 L del pozo A8 colocándolos en el pozo A12, teniendo cuidado en no agregar ninguna
dilución del suero al pozo A9 ya que sirve como control de la reacción.
 Esquema No. 2

2. Agregar a cada uno de los 8 pozos con suero problema, 4 UHA del virus vacunal en un
volumen de 50 L.
3. Rotar la microplaca sobre la mesa de trabajo para que haya reacción antígeno-anticuerpo e
incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
4. Agregar 100 L de la suspensión de glóbulos rojos al 1% a todos los pozos, desde A1 hasta
A9; nuevamente rotar la microplaca e incubar a temperatura ambiente hasta que los
glóbulos rojos del pozo A9 que sirven como control hayan sedimentado.
5. Determinar el título del suero problema identificando la última dilución en que se observe
inhibición de la hemaglutinación.
Cuestionario
1. ¿Cuál es la interpretación que debe darse a un resultado negativo en la prueba de IHA?
2. ¿Qué interpretación diagnóstica debe señalarse para un resultado positivo en la prueba de
IHA?
3. Combinando los resultados de las pruebas de HA e IHA, cuál es la interpretación
diagnóstica en los siguientes casos: a) HA: positiva, IHA: negativa; b) HA: negativa, IHA:
positiva; c) HA: positiva, IHA: positiva
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CIENCIAS QUÍMICAS
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DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA

Practica No. 4
Seminario: modelos biológicos para el cultivo e identificación de virus. Huevo
fértil de pollo, animales de laboratorio y cultivos celulares.
Introducción
Gran parte de nuestro conocimiento sobre la herencia, el desarrollo, la fisiología y los procesos
celulares y moleculares subyacentes se derivan de los estudios de un modelo u organismos de
referencia; a pesar de la gran diversidad de formas de vida y su alto grado de complejidad, algunas
características compartidas entre los seres vivos han permitido la búsquedade respuestas ante las
interrogantes planteadas por los investigadores.
Se cree que Gregor Mendel fue el primero que eligió cuidadosamente un organismo para responder
experimentalmente preguntas universales relacionadas con la herencia. Mendel fue muy cuidadoso
con las características filogenéticas y la susceptibilidad a la investigación experimental que debía tener
un organismo modelo para evitar obtener resultados dudosos; estas características siguen siendo
actualmente la base para la selección de un modelo biológico.
Los modelos biológicos representan sólo una ínfima fracción de la biodiversidad que existe en el
planeta por lo que podría ser una muestra sesgada de los seres vivos, por lo que se asume que el
conocimiento de estos organismos permite extrapolar la información obtenida al resto de organismos
considerando un origen común de las especies. Sin embargo, queda la interrogante de si el corto ciclo
vital de la mayoría de los modelos biológicos y la facilidad de manipulación, son representativos de
todos los seres vivos o si sus caracteres excepcionales permiten hacer generalizaciones del mundo vivo
(figura 1).
Fig. 5 Árbol de la vida, mostrando una selección de varios organismos. Los organismos utilizados
con mayor frecuencia en la investigación como modelos biológicos se indican en color
rojo (Ciccarelli et al., 2006; Letunic et al., 2007)

Criterios de selección
En la actualidad los criterios utilizados para seleccionar un modelo biológico para experimentación es
su posición filogenética, ya que cualquier organismo seleccionado para un estudio es un modelo si es
tomado como representante de algunas características de un grupo mayor (género, familia, orden o
phylum) o de un taxón inaccesible y la disponibilidad experimental, pues estos organismos son
seleccionados de acuerdo a características muy específicas de la investigación que se realiza, siendo
importante controlar su pureza y evitar su contaminación biótica, por lo que se requiere que su
producción sea estandarizada, que tengan características genéticas y sanitarias definidas, que sean
criados o cultivados en ambientes
controlados, que respeten los requerimientos de la especie y que se cumplan los principios éticospara
su bienestar.
Ejemplos de algunas especies utilizadas como modelos biológicos en virología
Drosophila
Fue adoptada como animal de experimentación genética por Thomas
Morgan a principiosdel siglo XX. También llamada mosca del vinagre o
mosca de la fruta, es una especie de dípterobraquícero de la familia
Drosophilidae. Recibe su nombre debido a
que se alimenta de frutas en proceso de fermentación. Es una especie
utilizada frecuentemente en experimentación genética, dado que posee un reducido número de
cromosomas (4 pares), breve ciclo de vida (15-21 días) y aproximadamente el 61% de los genes
de
enfermedades humanas que se conocen tienen una contrapartida identificable en el genoma de las
moscas de la fruta y el 50% de las secuencias proteínicas de la mosca tiene análogos en los mamíferos.
Para propósitos de investigación, fácilmente pueden reemplazar a los humanos. Actualmente se utiliza
como modelo para estudiar numerosos procesos biológicos incluyendo la respuesta inmunológica a
más de 20 virus de RNA diferentes como el VIH, virus del dengue, Fiebre amarilla, etc.
Neurospora
Es un género de hongos Ascomyceto. La especie más conocida de este
género es Neurospora crassa. The National Institute of Health lo reconoció
como uno de los 12 organismos eucariotes modelo para la investigación en
Genética y Biología Molecular, debido a que es fácil de cultivar y tiene un
ciclo de vida haploide que simplifica el análisis genético ya que los rasgos
recesivos se mostrarán en la descendencia;
el análisis de la recombinación genética es facilitado por el arreglo ordenado de los productos de la
meiosis. Este hongo es utilizado para expresar los genes de herpes virus thymidine-kinase, permitiendo
el estudio de drogas anticancerígenas y antivirales.
Bacteria
Entre los organismos modelo más utilizados se encuentra la bacteria Escherichia coli, una bacteria
Gramnegativa, anaerobia facultativa y no esporulada, con un genoma de aproximadamente 4'6 kb.
Algunas cepas de esta bacteria son enormemente versátiles en
 laboratorio, tolerando muy bien la manipulación genética e incluso
perdiendo su capacidad patogénica. Se ha observado que gran parte de sus
estructuras y funciones son extrapolables en cierta medida a un gran
número de microorganismos, incluida la célula eucariota. También se
utiliza como almacén de material genético, fábrica devirus, vector de
plásmidos, etc.

Bacteriofagos

Los fagos o virus que infectan bacterias, se establecieron como modelos

biológicos por la iniciativa de Max Delbrück. Los fagos cumplen un papel
de gran importancia en la Biología Molecular al ser utilizados como
vectoresde clonación para insertar ADN dentro de las bacterias y obtener
como resultado bibliotecas genómicas. Los fagos más utilizados con este fin
son el Fago λ y el Fago T4. Algunos estudios realizados en los
bacteriófagos son: Proteínas involucradas en la síntesis de ADN, ARN y proteínas Regulación génica;
Cáncer y control de la proliferación celular, Transporte de proteínas y organelos dentro de las células;
Infección e inmunidad; Posible vía de acceso para terapia génica. En la actualidad están siendo
utilizados como modelos biológicos para inducir la respuesta inmunológica.
Caenorhabditis elegans
Es un nemátodo con una longitud aproximada de 1 mm, estructura bilateral simétrica y ciertos
precursores de órganos superiores, a saber, boca (estoma),faringe, intestino y gónadas principalmente.
Es un nemátodo transparente por lo que permite diferenciar visualmente todas sus estructuras, es
hermafrodita, facilitando la transmisión de mutaciones. Su genoma de 97 Mb está estructurado en 5
pares de cromosomas másdos cromosomas X en hermafroditas y un sólo X en machos (un
0'05% del total de una descendencia). Si juntamos las características anteriores con su ciclo vital de dos
o tres semanas en laboratorio y la implicación de larvas en el desarrollo se consigue un organismo
modelo con nuevas perspectivas en investigación. El estudio de este organismo aportagran cantidad de
información sobre diferenciación celular y apoptosis, especialmente útil en la rama conocida como
biología del desarrollo. Los investigadores de la Universidad de California en Riverside (UCR), han
desarrollado de C. elegans como modelo para estudiar la repñroducción
de virus altamente peligrosos como el virus del Ebola, VIH, Hepatitis C, Fiebre del Nilo, etc.;
permitiendo trazar un mapa de la delicada interacción entre virus y anfitrión; demostrado que la copia
del virus en el gusano provoca una respuesta antiviral conocida como ARN silenciador o ARN
interferencia (ARNi) que destruye el ARN viral.
Ratón
El ratón común (Mus musculus), es una especie de roedor miomorfo de la
familiaMuridae. Es la especie más frecuente de ratón. Se cree que es la
segunda especie de mamíferoscon mayor número de individuos, después del
Homo sapiens. Habita
siempre cerca a los humanos, con los que mantiene una relación de
comensalismo. Es también el mamífero más utilizado en experimentos de laboratorio y existen
multitud de variantes transgénicas que simulan enfermedades genéticas humanas. Los principales
estudios realizados en
el ratón común son: desarrollo de tejidos corporales, función del sistema inmune de los mamíferos,
formación y función del cerebro y del sistema nervioso, modelos de cánceres y de otras enfermedades
humanas, regulación génica y herencia, enfermedades infecciosas virales y la respuesta inmunológica.
Huevo Fértil de Ave
El huevo fértil de ave es una fuente de tejido vivo empleado como un
sistema sensible
para el cultivo, titulación e identificación de virus. En comparación con
los animales de laboratorio empleados para otros ensayos virales, el
modelo de huevo fértil ofrece diversas ventajas tales como: desarrollo
en condiciones de esterilidad; no poseen funciones inmunológicas
desarrolladas; bajo costo; manipulación relativamente sencilla; no requieren de una infraestructura
compleja. El huevo fértil empleado
para el cultivo de virus, debe obtenerse de aves libres de patógenos específicos (ALPES), para evitar
la presencia de virus que comúnmente afectan a las aves, en especial Adenovirus, Coronavirus,
Bronquitis Infecciosa Aviar, etc., o bien, bacterias de los géneros Salmonella,Pseudomonas,
Pasteurella, etc. Para el cultivo y titulación de virus, es indispensable determinar la viabilidad del
embrión, así como tener destreza en el dominio de las técnicas de inoculación,
todo ello debido a la especificidad que presentan algunos viriones por determinadas células o
tejidos.
Cultivos Celulares
En 1949 John Enders, Thomas Weller y Frederick Robbins describieron
las condicionesbajo las cuales Poliovirus podía cultivarse en células
eucarióticas de origen no neuronal, lo queles permitió ganar años más
tarde el premio Nobel en Fisiología y
Medicina. A partir de entonces, los cultivos de células reemplazaron a los
animales de laboratorio como modelo de reproducción de virus y ennuestros
días son utilizados en muchos campos del área biomédica.
Este modelo biológico está conformado por conjuntos de células con características definidas que se
mantienen en condiciones de laboratorio sobre soportes inertes (invitro), pero mantienen capacidad de
proliferar a través de divisiones mitóticas requiriendo de medios de cultivo con una composición
compleja que les provea de los nutrientes necesarios parasu preservación y desarrollo. Las células se
obtienen inicialmente de tejidos sanos o tumorales y se disocian mediante diferentes métodos hasta
obtener fragmentos más pequeños que pueden ser disgregados con enzimas proteolíticas para formar
suspensiones celulares.

Cuestionario
1. ¿Cuáles son las limitantes del uso de huevo fértil para la propagación de virus?
2. Mencione las ventajas y desventajas del empleo de animales de laboratorio para el análisis
de virus.
3. ¿Qué virus se propagan únicamente en animales de laboratorio?
4. Cite las desventajas del modelo de cultivos celulares.
5. Mencione ejemplos de bacterias, diferentes de Escherichia coli, en las que se pueden
propagar bacteriófagos y cite ejemplos de éstos.
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CIENCIAS QUÍMICAS
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DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA

Practica No. 5
Ensayos de las vías de inoculación en huevo fértil de pollo
Introducción
El huevo fértil de ave es una fuente de tejido vivo empleado como un sistema sensible para el cultivo,
titulación e identificación de virus. En comparación con los animales de laboratorio empleados en los
ensayos virales, el modelo de huevo fértil ofrece diversas ventajas tales como:
▪ Son estériles.
▪ No tienen funciones inmunológicas desarrolladas.
▪ No son costosos.
▪ Son accesibles y no requieren para su manejo de tanta destreza técnica en comparación
con otros sistemas biológicos, tales como el mantenimiento yreproducción de cultivos
celulares.

El huevo fértil empleado para el cultivo de virus debe obtenerse de aves sanas ALPES, aves libres de
patógenos específicos o SPF por sus siglas en inglés, para de esta manera eliminar la presencia de virus
que comúnmente afectan a las aves como Adenovirus o Bronquitis Infecciosa Aviar, etc.

Para la propagación, cultivo y titulación de virus, es indispensable determinar la viabilidad del

embrión, así como dominar las técnicas para las diferentes vías de inoculación debido a la especificidad
que presentan algunos viriones por determinadas células o tejidos. En lafigura 3 se presenta en esquema
de las diferentes zonas que conforman a un huevo fértil.

Una vez realizado el ensayo de la inoculación, deberá observarse el conjunto del huevo fértil para
reconocer las cavidades y fluidos que constituyen al sistema biológico empleado.
 3 4 1 Cavidad Alantoidea

5 2 Saco de Aire

2 3 Saco Amniótico

4 Saco Vitelino

5 Membrana Corioalantoidea

1
Fig. 6. Compartimentos del huevo fértil de ave.
Objetivos:
Al finalizar la sesión, el alumno:
1. Determinará al ovoscopio la viabilidad del embrión.
2. Dominará las técnicas comúnmente utilizadas para la inoculación de huevos fértiles de
ave.
3. Diferenciara las estructuras embrionarias observando la organización de los tejidos fuera
de su cutícula.
Material:
▪ 3 Huevos fértiles de ave de 10 ▪ Jeringas de insulina
días de inoculación (+/- 1 día),
calidad ALPES.
▪ Ovoscopio y pinzas de disección ▪ Agujas de 20 x 38 mm.
▪ Recipiente para recibir desechos ▪ Colorantes
▪ Charola o plato de unicel para ▪ Guantes.
abrir los huevos
▪ Perforadores, bulbos y lápiz. ▪ Papel para evitar manchar las
mesas
▪ Pegamento de secado rápido. ▪ Alcohol
▪ Torundas ▪ Mecheros
Desarrollo:
I.- Confirmación de la viabilidad del embrión
Transluminar cada embrión colocando el extremo romo en la ventana del ovoscopio. Un embriónno
viable puede reconocerse a través de:
• Desprendimiento de la membrana corioalantoidea de la parte interna de la cutícula.
• Falta de irrigación.
• Falta de movimiento.
• Cualquier coloración de verde a negra que indica por lo general contaminación bacteriana.
II.- Técnicas de inoculación
A Cavidad alantoidea
a Transluminar el huevo fértil con ayuda del ovoscopio.
b Marcar un punto o cruz de 2 a 3 mm. por arriba del límite de la cámara de aire del lado
contrario al embrión y en una zona escasamente irrigada.
c Perforar la marca señalada.
d Con una jeringa que porte aguja de insulina o tuberculina, inocular en ángulo de 45
grados con respecto al huevo fértil de ave.

B Saco vitelino
a Localizar la parte más alta del embrión sobre la cámara de aire y marcar con un punto o
cruz.
b Marcar otro punto o guía que indicara la localización del embrión.c
Perforar la marca señalada
d Introducir una aguja de 20 x 38mm recta con ligera inclinación opuesta a la localización
del embrión

C Membrana corioalantoidea
a Localizar la parte más alta de la cámara de aire y marcar un punto o cruz (*).
b Marcar otro punto en la parte media opuesta a la localización del embrión en un área con
la menor irrigación posible.
c Perforar ambas marcas.
d Succionar con un bulbo de goma a través del punto marcado en la primera posición (*),
creando así una cámara de aire falsa en la parte media del embrión.
e Inocular empleando jeringas con aguja de insulina en el lugar que sedesarolóla cámara de
aire falsa.
Procedimiento parte 1:

1. Con un lápiz, marca el contorno de la cámara de aire en cada huevo. Etiqueta el huevo 1
como "Cavidad alantoidea", el huevo 2 como "Saco vitelino" y el huevo 3 como
"Problema".
2. Inocula el embrión del huevo 1 con 100 µL (10 U) de cristal violeta.
3. Inocula el embrión del huevo 2 con 100 µL de cristal violeta.
4. Una vez realizada la técnica, se abrirán los huevos fértiles de ave para analizar si la vía
fue efectivamente inoculada, vertiendo el contenido del embrión sobre cajas de Petri o los
platos de unicel.
5. Inocula el embrión del huevo 3 con 10 µL del virus proporcionado por el docente,
utilizando la vía de inoculación que prefieras (si en el equipo hay cuatro personas, usa
dos para cada vía; es importante anotar la vía de inoculación):
a) Junto al mechero, desinfectar el sitio a perforar con tintura de yodo, alcohol y/o
benzal, antes y después de perforar.
b) Toma la muestra viral e inocula al huevo
c) Sella la perforación con pegamento líquido de secado rápido. Marca el huevo
infectado con tus datos personales y los del profesor, e incuba durante una
semana.

Procedimiento parte 2:
Después de una semana de incubación, toma una muestra del líquido transparente del huevo y úsala
para realizar un ensayo de hemaglutinación, siguiendo el procedimiento descrito en la práctica número
dos. Reportar las UHAs observadas.

Cuestionario
1. De acuerdo con lo observado después de abrir los embriones de pollo y según la vía de
inoculación empleada; esquematice para cada vía, cuales zonas deben quedar teñidas y
cuáles no, si la inoculación se realizó correctamente.
2. Cite ejemplos de virus que puedan ser inoculados por vía saco vitelino, mencionando las
lesiones que causan.
3. Cite ejemplos de virus que puedan ser inoculados por vía membrana corioalantoidea
mencionando las lesiones que causan.
4. Cite ejemplos de virus que puedan ser inoculados por vía cavidad alantoidea, mencionando
las lesiones que causan.
5. ¿Qué otras aplicaciones tienen el huevo fértil además de la propagación de virus?
 BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLAFACULTAD DE
CIENCIAS QUÍMICAS
LICENCIATURA: QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA

Práctica No. 6 (parte 1)

Replicación del virus de la enfermedad de Newcastle en huevo fértil de pollo

Introducción
Existen diversos agentes infecciosos que provocan en el humano y otros mamíferos dañosseveros e
incluso la muerte. En el mejor de los casos lo deseable es que esta interacción induzca una protección
inmunológica al individuo como consecuencia del reconocimiento de antígenos específicos tanto en
forma natural como artificial. En el caso de medidas profilácticas, con el empleo de vacunas se procura
inducir una Inmunidad Adquirida Artificial.

Para obtener resultados satisfactorios, es indispensable evaluar la calidad de la vacuna. Para las vacunas
elaboradas con virus atenuados, la valoración se puede efectuar en sistemas biológicos tales como
huevos fértiles de ave que pueden responder a la infección viral dando lesiones características del virión
inoculado que afecte directamente al embrión y le produce signos tales como músculos distróficos,
enanismo o muerte, o bien, afectan estructuras y líquidos extraembrionarios donde se pueden observar
hemorragias, formación de placas o pústulas así como determinar la presencia de hemaglutininas
virales.

Los virus vacunales o de campo pueden titularse en huevos fértiles de ave cuando producen su muerte
calculando entonces una Dosis Letal al 50% (DLEP50) o en el caso de virus hemaglutinantes calculando
Dosis Infectivas al 50% (DIEP50) empleando la reacción de Hemaglutinación de los fluidos cosechados.
Objetivos
1. El alumno desarrollara la técnica para propagar una cepa vacunal de virus. atenuados de la
enfermedad de newcastle
2. El alumno determinará la DIEP50 para la vacuna del Virus de laenfermedad de newcastle ,
calculando sus concentración por unidad de volumen.

Material
• 20 Huevos fértil de ave de 10 dias de incubación (+/- 1 dia) calidad ALPES por mesa (3 por
alumno).
• Vacuna con viriones atenuados de la enfermedad de Newcastle
• Solución reguladora de fosfatos (srf) de Dulbecco con pH 7.2 o solución salina
• Suspensión de eritrocitos de pollo al 1%
• Lápiz, pegamento blanco y perforadores
• Hisopos estériles, tintura de yodo., alcohol, torundas.
• Estufa a 37°C.
• Ovoscopio.
• Jeringas para aplicación de insulina.
• Mechero.
• Recipiente para desechos.

Desarrollo:
1. Realizar con solución salina de Dulbecco diluciones seriadas de la vacuna viral desde 10-1
hasta 10-8 a partir de una suspensión concentrada.
2. Trasluminar el huevo fértil de ave y seguir la técnica de inoculación para cavidad
alantoidea
3. Junto al mechero, desinfectar el sitio marcado con el punto o cruz de inoculación con
tintura de yodo antesy después de perforar
4. Inocular 0.1 mL de las cuatro últimas diluciones en cada uno de 5 embriones (~20
embriones en total), vía cavidad alantoidea.
5. Desinfectar nuevamente y sellar la perforación con una gota de pegamento blanco
6. Marcar con lápiz sobre cada embrión la dilución y vacuna inoculada
 7. Incubar a 37°C durante 7 días, revisando diariamente la viabilidad de los embriones al
ovoscopio, señalando en el primer día los embriones que resulten muertos por traumatismo

Cuestionario
1. ¿Qué es una vacuna?
2. ¿Qué parámetros deben tomarse en cuenta para evaluar la calidad de una vacuna?
3. ¿Para qué es importante tener una vacuna de calidad?
4. Mencione al menos cinco vacunas que en la actualidad sean producidas en huevo fértil de
ave
5. Mencione vacunas elaboradas con virus atenuados de uso humano.
 BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLAFACULTAD DE
CIENCIAS QUÍMICAS
LICENCIATURA: QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA

Práctica No. 6 (parte 2)

Titulación (DI50) del virus de la enfermedad de Newcastle en huevo fértil depollo

Introducción
Uno de los procedimientos importantes en virología es medir la concentración de un virus enuna muestra,
o el título viral.
Las técnicas de titulación viral son en muchos casos un paso previo y necesario para desarrollar otros
tipos de estudios tales como: ensayos de neutralización, determinación de actividad antiviral de un
extracto dado, ensayos de identificación viral como en el caso de virus influenza (ensayo de inhibición
de la hemaglutinación), etc.

• Título viral: Es una medida de la concentración o cantidad de virus presente en una muestra. Se
utiliza para determinar cuán infecciosa es una muestra de virus, midiendo la cantidad de virus capaz de
causar una infección en un hospedador o en células de cultivo. Cuanto mayor es el título viral, mayor es
la cantidad de virus presente en la muestra.

• Dosis infectante (DI): Es la cantidad mínima de un agente infeccioso, como un virus o una bacteria,
necesaria para establecer una infección en un hospedador. La dosis infectante 50% (DI50) se refiere a
la cantidad del agente que es capaz de infectar al 50% de la población expuesta. Esta medida es clave
para entender cuán fácilmente un patógeno puede causar una infección.

• Dosis letal (DL): Es la cantidad de una sustancia, como un veneno o un agente infeccioso, que se
requiere para causar la muerte en un porcentaje determinado de la población expuesta. La dosis letal más
comúnmente referida es la DL50, que es la dosis necesaria para matar al 50% de una población de
prueba. Se utiliza principalmente en toxicología para evaluar la toxicidad de sustancias químicas o
biológicas.

En estos análisis para determinar el título viral, se utiliza el método de Reed y Muench, el cual es
relativamente simple. Se basa en la suposición de que el número de unidades de prueba afectadas varía
proporcionalmente al log10 de la dilución, es decir que a diluciones menores (mayorconcentración de
virus) el porcentaje de efecto será mayor que a diluciones mayores (menor concentración de virus).
Además, considera que en la zona cercana al 50% de efecto éste varía linealmente con la dosis. Es muy
importante no omitir ninguna dilución intermedia.

Objetivo
1. El alumno titulará la vacuna del Virus de la enfermedad de Newcastle, determinando la DI50
(con HA positivos y negativos) y la DL50 (con embriones muertos y vivos) calculando su
concentración por unidad de volumen.

Desarrollo:
1. Al término de la incubación, de los embriones de la práctica anterior, cosechar un poco de
fluido alantoideo de cada uno de los 20 huevos inoculados (vivos y muertos), para efectuar
hemaglutinaciones.
2. Anotar los resultados obtenidos:
DILUCIÓN muertos HA+ vivos HA-
10-5
10-6
10-7
10-8

3. Realizar los cálculos para determinar la DI/0.1 ml y DL / 0.1 ml empleando el método de

Reed & Muench, con base en el siguiente ejemplo
Resultados de las pruebas de hemaglutinación
DILUCION EMBRIONES HA+ o muertos HA- o vivos
INOCULADOS
10-3 5 4 1
10-4 5 3 2
10-5 5 2 3
10-6 5 1 4

Calculos
1) ACUMULADOS 2) ACUMULADOS 3) RADIO DE 4) PORCENTAJE
POSITIVOS NEGATIVOS POSITIVIDAD
10 1 10 / 11 90.9
6 3 6/9 66.6
3 6 3/9 33.3
1 10 1 / 11 9.09

Para una mejor explicación, se desgloza a continuación la realización de los cálculos

para cadacolumna:
Columna 1: Realizar la suma acumulada de pruebas HA+, desde la dilución más alta hasta
la másbaja.
Columna 2: Realizar la suma acumulada de pruebas HA- desde la dilución más baja a la
más alta.
Columna 3: Para cada dilución anotar el cociente dado por los acumulados con HA+
sobre lasuma de acumulados con HA+ y HA-.
Columna 4: Expresar el cociente anterior como
porcentaje
Calcular el valor de interpolación (VI.) con la siguiente
fórmula:

% Positividad  50% - 50% 66.6 – 50.0 16.6

V.I. = =
% Positividad  50% - % Positividad  50% 66.6 – 33.3 33.3

V.I. = 0.49
Multiplicar el logaritmo negativo del factor de dilución por el valor de interpretación
para asícalcular el valor de interpolación corregido.
Para este caso:

V.I.C.= log Neg de 10 X V.I. = -1 x 0.49

Localizar las diluciones entre las que se encuentra el 50% de

positividadEn el ejemplo: 10-6 y 10-7
Estimar la DI50 sumando el V.I.C. al exponente de la dilución que presente mayor del
50% depositividad, en este ejemplo.
DI50 = 10-6 + (-0.49) = 10-6.49
El titulo se obtiene con el inverso del valor de
la [Link], el resultado será:
DI50 = 106.49 /0.1ml.

Cuestionario
1. Además de la titulación viral, ¿qué otras pruebas se deben realizar a un lote
vacunal antesde salir al mercado?
2. Mencione otras dosis al 50% que se pueden calcular para titular una muestra
viral.
3. En esta práctica que nos indica una HA+
4. ¿Porque emplear el método de Reed & Muench?
5. ¿Qué otros métodos se utilizan para titular una muestra viral?