AISLAMIENTO DE BATERIÓFAGOS DE FUENTES NATURALES
Objetivo general
Introducir a alumno al trabajo con bacteriófagos y al conocimiento de las características
que permiten su identificación.
Objetivos particulares
Titular las muestras de los bacteriófagos lambda, T4 y M13 proporcionada por los
profesores y describir la morfología de las placas líticas producidas.
Aislar bacteriófagos a partir de aguas negras.
Describir la morfología de placa de los bacteriófagos aislados y determinar el título.
Bacteriófago: Virus que infecta células bacterianas. Consisten fundamentalmente de material
genético y proteínas.
Clasificación de virus por Baltimore
Se pueden clasificar por su…
Forma/ Estructura
Con cola
Poliédricos
Filamentosos
Pleomórficos
Ácido nucleico
DNA ó RNA
El cual puede ser monocatenario (ssDNA ó ssRNA) o bicatenario (dsDNA ó dsRNA)
Este también puede ser circular o lineal.
ss= single strain (una sola cadena)
ds= double strain (doble cadena)
Ciclo de multiplicación
Virulento
Temperado/Lisogénico
En familias
Existen 13 familias y 30 géneros clasificados
Ciclos de multiplicación.
Pueden ser líticos o lisogénicos
Ciclo lítico: El virus se replica y lisa la célula hospedera
Ciclo lisogénico: El genoma del virus pasa a ser parte del genoma bacteriano (profago). No causa
lisis.
Infección por fagos.
1. Unión o adsorción del virión a una célula hospedera susceptible
2. Penetración o inyección de su ácido nucleico a la célula
3. Síntesis del ácido nucleico y proteínas del virus por el metabolismo celular redirigido por el
virus
4. Ensamblaje de las cápsidas y empaquetamiento de genomas víricos en nuevos viriones
5. Liberación de los viriones maduros de la célula.
Transducción
En la transducción, un virus bacteriano (bacteriófago o fago) está íntimamente involucrado
en el proceso de transferencia genética. Las infecciones por fagos comienzan con la adsorción de
partículas de virus a sitios receptores específicos en la superficie de la célula huésped. El ácido
nucleico contenido en el interior de la cubierta proteica viral se transfiere al citoplasma de la célula
bacteriana, donde se vuelve metabólicamente activo y se somete a replicación y transcripción.
Ciclo lítico
Durante una respuesta lítica, el virus produce componentes estructurales de nuevas partículas de
fago, empaqueta su ácido nucleico dentro de ellas y luego hace que la célula lise y libere el fago de
progenie
Ciclo lisogénico
Durante una respuesta templada, el virus establece una relación estable con una célula huésped
en la que se expresan algunas funciones del fago, pero no las que conducen a la replicación
incontrolada del ADN o a la producción y ensamblaje de nuevas partículas. En cambio, el ADN viral
se replica junto con el ADN del huésped, generalmente como una parte integral de la misma
molécula, y se transmite a todas las células de la progenie. Ocasionalmente, los lisógenos (células
portadoras de un fago templado) experimentan un cambio metabólico que reactiva el ADN viral. El
resultado es el mismo que para una respuesta lítica inicial. Algunos fagos pueden dar sólo
respuestas líticas y otros sólo temporales; algunos pueden dar cualquiera de las dos respuestas,
dependiendo de las condiciones de crecimiento.
T4 M13 LAMBDA
Morfología Cabeza icosaédrica con cola Fago filamentoso Cabeza icosaédrica
y espículas con cola larga y
flexible
Genoma dsDNA lineal ssDNA circular de 6.4 dsDNA de 48.5 kb
kb
Receptores LPS (Lipopolisacáridos) y Pilus F LamB (maltoporinas,
purina OmpC son poros hidrofílicos)
Ciclo de Lítico Tipo temperado (Lítico
multiplicació y Lisogénico)
n
Huesped E. coli E. coli F+ [Link]
Métodos experimentales utilizados para estudiar la infección por fagos
Es posible estudiar las células infectadas por fagos de diversas maneras. La presencia de viriones
en una muestra puede demostrarse añadiéndola a un cultivo de bacterias sensibles a los fagos y
luego colocando la mezcla en agar blando (0,6%) superpuesto sobre agar normal. Debido a que T4
es un fago virulento, cada célula bacteriana infectada eventualmente se lisa, liberando viriones que
pueden infectar otras células sensibles. A medida que las bacterias aumentan en número, también
lo hacen los viriones al infectar constantemente nuevas células bacterianas. Las múltiples rondas
de infección dan lugar a un agujero, o placa, en el césped de células bacterianas; De ahí que esta
técnica se denomine ensayo de placa. Se supone que cada placa representa una célula original
infectada con fagos y, por lo tanto, cada placa se considera análoga a una colonia bacteriana para
fines de recuento.
Los experimentadores han desarrollado cuatro técnicas especializadas para obtener información
más precisa sobre los eventos que ocurren durante la infección por fagos: el experimento de
crecimiento en un solo paso; el experimento estallido simple; el experimento de lisis prematura; y el
experimento de observación de microscopía electrónica.
Crecimiento de un solo paso Lisis Artificial Prueba de Amplitud de
gota huesped
Desarrollado por Ellis y El experimento de lisis Detectar la Se define
Delbrück y depende de la prematura fue diseñado por presencia de por los
producción de una infección A.H. Doermann, quien tomó un bacteriofagos géneros,
sincrónica por fagos (todas las experimento de crecimiento infecciosos especies y
células infectadas por fagos en estándar de un solo paso y lo en una cepas
la misma etapa del proceso alteró, utilizando cloroformo o muestra bacterianas
infeccioso al mismo tiempo). detergente para la lisis artificial que un
de las células. En este bacteriófago
experimento, las muestras puede lisar.
extraídas en varios momentos Nos ayuda a
se tratan para lisar todas las saber el
células del cultivo. A número de
continuación, se pueden cepas
analizar los lisados para distintas
detectar la presencia de susceptibles
partículas de fagos libres o sus a ser
componentes. infectadas
por un solo
fago.
La sincronización se logra (1) Un experimento de lisis
restringiendo la unión de las prematura demuestra que el
partículas de fagos a las ADN puro de los fagos no es
células bacterianas a un corto infeccioso y, por lo tanto, la
período de tiempo o (2) primero duración de la fase de eclipse
tratando el cultivo bacteriano debe representar el tiempo
con un veneno metabólico mínimo requerido para formar
reversible como el cianuro de una nueva capa de proteína
potasio y luego agregando los para el virus. Cuando aparecen
viriones al cultivo. En este partículas de fagos infecciosos,
último caso, los fagos su tasa de producción no es
atraviesan las primeras etapas exponencial, como con la
de su ciclo de vida, pero el liberación de fagos en el
cianuro impide que se experimento de crecimiento de
produzca cualquier síntesis un solo paso, sino aritmética.
macromolecular. En cualquier La tasa de crecimiento
caso, después de un período aritmético durante el resto del
de tiempo adecuado, los fagos período latente indica que las
que no se hayan adherido a las partículas de fagos infecciosos
células huésped se eliminan aparecen individualmente,
diluyendo el cultivo hasta el como si hubieran sido
punto en que las colisiones producidas por un proceso de
entre fagos y bacterias se tipo línea de montaje, en lugar
vuelven improbables o de por algún tipo de fisión
neutralizando la mezcla con el como se observaría en un
antisuero específico de fagos. cultivo bacteriano en el que
Si se usa cianuro, se elimina dos nuevas células surgen de
del cultivo y se permite que una vieja
comience el metabolismo. El
tiempo de lavado o dilución se
convierte en el tiempo cero,
después del cual el
experimentador extrae
muestras del cultivo a
intervalos, las mezcla con
bacterias indicadoras
(sensibles a los fagos) y realiza
ensayos para centros
infecciosos (unidades
formadoras de placa o PFU).
La curva es trifásica, con una En condiciones
fase latente inicial durante la experimentales, no se pudieron
cual el número de centros detectar partículas infecciosas
infecciosos es constante, de fagos T4 hasta unos 12
seguida de una fase de minutos después de la
aumento y luego una fase de infección. Esta fase particular
meseta. La interpretación de del ciclo de crecimiento, un
estos resultados es que período en el que no hay fagos
durante la fase latente un infecciosos detectables en el
centro infeccioso es una célula cultivo, se conoce como fase
infectada por fagos que se lisa de eclipse
algún tiempo después de ser
mezclada con bacterias
indicadoras e inmovilizada en
agar. El agar blando garantiza
que los viriones liberados no se
difundan más que unos pocos
micrómetros, y solo se forma
una sola placa por cada célula
infectada originalmente.
Durante la fase de aumento,
las bacterias infectadas
comienzan a lisarse antes de
que la muestra se retire del
cultivo, de modo que un centro
infeccioso puede ser una célula
infectada o un virión libre.
Durante la fase de meseta, un
centro infecciso es sólo un
virión libre. La relación entre el
número de centros infecciosos
durante la fase de meseta y el
número de centros infecciosos
durante la fase latente
representa el tamaño medio de
la ráfaga (el número medio de
partículas de fagos liberadas
por célula infectada). célula
infectada).
La microscopía electrónica ha demostrado ser una herramienta poderosa para comprender las
interacciones entre los fagos y las células bacterianas. Se pueden utilizar dos tipos generales de
procedimientos. Los fagos libres, o partes de los mismos, pueden examinarse mediante técnicas
de tinción negativa.
Morfologías de Calvas de los fagos
Calvas líticas, transparentes
Placas circulares transparentes con centro turbio
Calvas opacas
CONCEPTOS
MOI: relación o proporción entre el número de partículas virales que infectan una célula específica.
MOI 1 (#Fagos = #Bacterias)
MOI 10 (10 más fagos que bacterias
Tamaño de estallido: número de partículas víricas producidas por la infección de una sola célula
Periodo de latencia: tiempo donde se lleva a cabo la infección y da como resultado el estallido.
Periodo de eclipse: tiempo que tarda en formarse un virón dentro de la célula.
Eficiencia de siembra: Fracción de partículas fágicas que pueden formar una placa.
SISTEMAS DE MODIFICACIÓN Y RESTRICCIÓN
Restricción: Una enzima llamada endonucleasa de restricción corta el ADN del fago en sitios
específicos. Estas enzimas reconocen secuencias de ADN particulares, llamadas sitios de
reconocimiento, y hacen cortes en ambos lados de la doble hélice. Esto incapacita al fago al
fragmentar su material genético.
Modificación: Para proteger su propio ADN de ser cortado por las endonucleasas, la bacteria
emplea una metiltransferasa, que añade grupos metilo a ciertas bases en los sitios de
reconocimiento de su propio ADN. Esto bloquea el acceso de las endonucleasas al ADN
bacteriano, evitando que sea degradado.
Ejemplo:
El sistema EcoRI en Escherichia coli reconoce la secuencia 5'-GAATTC-3'. Si esta
secuencia está metilada, el ADN no se corta. Si no lo está (como en el caso del
ADN del fago), la endonucleasa lo destruye.