ELECTROFORESIS
INTRODUCCIÓN
● Migración proporcional de las moléculas a través de una matriz porosa (pj gel),
según su peso molecular
● El movimiento es generado por un campo eléctrico
● La carga de las biomoléculas depende del ph del medio
● Las biomoléculas pueden desplazarse si hay un campo eléctrico hacia el polo de su
carga opuesta
● Las proteínas pueden tener carga positiva o negativa
● Los ácidos nucleicos sólo poseen carga negativa por: el esqueleto de fosfato, por
ende, migran siempre al ánodo (polo +)
● El método estándar de separación, identificación y purificación del ADN es la la
electroforesis en gel de agarosa
SECUENCIA EXPERIMENTAL
● Se suelen emplear geles de agarosa (concentración entre 0,3% y 2%)
● La agarosa es un polisacárido lineal (D-galactosa + 3,6-anhidro -L-galactosa) se
extrae de algas marina, se mantiene sólido a temperatura ambiente y se funde a
50°-60° con el buffer adecuado.
● La agarosa fundida se coloca sobre un molde rectangular
● En uno de los extremos se le agrega un aditamento en forma de peineta con la
finalidad de generar pocillos u orificios donde se colocaran las muestras
● Al solidificar se forma una matriz que al ser atravesada por un campo eléctrico
permite el desplazamiento de moléculas según su forma y peso molecular
● Ocasiona una separación proporcional al tamaño
● Los fragmentos de ADN, serán medido en pares de base (pb)
● A mayor concentración de agarosa, la matriz del gel
● Es posible separar fragmentos de ADN desde 200 pb hasta 50 kpb, variando la
concentración
PASO 1: Preparación de la cámara de electroforesis
1. Preparación de la cámara de electroforesis: Debemos procurar reconocer los polos de
este soporte, situando adecuadamente el ADN para su separación. Agregamos una
fuente de poder a la cubeta central. Conectar el circuito eléctrico.
2. Colocar el gel de Agarosa: Que fue polimerizado junto a una peineta utilizando el
buffer de corrida como solvente, una vez solidificado el gel tendrá pocillos en un
extremo que servirán de receptáculos para las muestras de ADN. La bandeja con el gel
de agarosa debe ser situada en posición horizontal en interior de la cámara de
electroforesis.
3. Llenar la cámara con buffer de corrida (tampón tris acético + edta) proporciona el pH
y las condiciones óptimas para la electroforesis.
PASO 2: Electroforesis
4. Agregar el Buffer de carga a cada muestra de ADN: lo que nos ayuda a depositar el
ADN en los pocillos del gel y gracias a los colorantes visualizar el estado de las
muestras durante la electroforesis
5. Agregar una alícuota de un marcador de masa molecular (con adn de tamaños
conocidos)
6. Agregar muestras de ADN: El glicerol presente en el buffer de carga aporta densidad,
permitiendo que estas se depositen con facilidad en el fondo de los pocillos.
7. Iniciar el circuito eléctrico: Cubrimos la cubeta con la tapa y conectamos la corriente
eléctrica
8. Observar el frente de migración: El Adn migrara al polo positivo de la cubeta, el
avance del buffer de carga nos permitirá saber cuándo detener la corriente
PASO 3: Análisis de resultados
10. Detener el circuito eléctrico y retirar el gel: al preparar el gel se añadio un marcador
fluorescente que se intercala en las bases nitrogenadas que permite observar la migración
del ADN
11. Observar con luz ultravioleta
12. Interpretar patrones de migración
El marcador molecular se utiliza para estimar el tamaño del ADN en estudio
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
● Para estimar el tamaño de los fragmentos de ADN se compara la migración de las
bandas de la muestra con la migración de de las bandas de peso molecular conocido
● Los fragmentos de ADN más pequeños avanzan más rápidamente
● La velocidad es inversamente proporcional al tamaño
● El tamaño obtenido en el gel es una aproximación, debe ser informado con números
redondeados