Genética y Bioinformática Módulo 1

6. Marcadores genéticos: restricción enzimática y PCR

 Los marcadores genéticos (basados en
ADN) pueden depender de:

• Fragmentos/restricción enzimática
• PCR
• Secuenciamiento de ADN
 Dominancia VS Codominancia
en marcadores moleculares

Capacidad de diferenciar múltiples alelos de un mismo locus

Provee información de homocigosis VS heterocigosis
 Dominancia VS Codominancia
en marcadores moleculares

Implicaciones en análisis:

Heterocigocidad (codominantes)
Relaciones directas entre parentales e hijos (codominantes)
Distancias genéticas (ambos)
Diversidad genética (ambos)
RFLPs
CAPS restricción enzimática

AFLPs

RAPD en esta clase

SCARs
más usados actualmente,
Microsatélites próxima clase + PCR

ISSRs
ESTs

SNPs más usados actualmente, más adelante

 Marcadores basados en enzimas de restricción

Qué son las enzimas de restricción?

 Marcadores basados en enzimas de restricción

Enzimas de restricción y DNA fingerprinting

Aunque las enzimas de restricción son ampliamente utilizadas en la clonación

molecular, su uso como herramientas moleculares se extiende a otras aplicaciones
comunes en la biología molecular. Una de las aplicaciones mas importantes es la
huella dactilar del ADN (DNA fingerprinting).
 Marcadores basados en enzimas de restricción

Los marcadores moleculares y el concepto de fingerprinting están muy

relacionados. La idea de “huellas dactilares” o “perfiles” (profiling) de ADN surgió
en la década de 1980 como un medio para identificar genéticamente individuos
basándose en patrones únicos de tamaños de fragmentos de ADN generados a
partir de sus genomas.

En otras palabras, los fragmentos de ADN y sus variaciones de longitud podrían

usarse como marcadores diferenciadores, o "huellas dactilares", para la
identificación genética (es decir, de alelos) en lugar de depender únicamente de
características fenotípicas.
 Marcadores basados en enzimas de restricción

Hoy en día el uso de técnicas de huellas dactilares de ADN es muy común.

Si bien gran parte del público en general es consciente de su importancia en casos

forenses y penales, la toma de huellas dactilares y el mapeo de ADN tienen amplias
aplicaciones en otras áreas, como las pruebas de enfermedades y el
fitomejoramiento.

El uso extensivo del DNA fingerprinting ha llevado al desarrollo de numerosos

métodos basados en marcadores moleculares que usan este principio, y la elección
del marcador molecular o método de profiling dependerá principalmente de los
objetivos experimentales.
 Marcadores basados en enzimas de restricción

DNA fingerprinting con enzimas de restricción

Tres de los métodos más comunes de DNA fingerprinting que utilizan enzimas de restricción
son:
Restriction Fragment Lenght Polymorphism (RFLP) ó polimorfismo de longitud de
fragmentos de restricción

Amplified Fragment Lenght Polymorphisms (AFLP) ó polimorfismos de longitud de

fragmentos amplificados

Cleaved Amplified Polymorphic Sequence (CAPS) ó secuencia polimórfica amplificada

y cortada
Restriction Fragment Lenght Polymorphism
(RFLP)
 Marcadores basados en enzimas de restricción
Restriction Fragment Lenght Polymorphism (RFLP)
 Marcadores basados en enzimas de restricción
Restriction Fragment Lenght Polymorphism (RFLP)
Si bien en los 80s los RFLPs eran los marcadores moleculares más
populares en varias ramas de la ciencia debido a reproducibilidad
y codominancia, su detección era cara, labariosa y consumía
mucho tiempo ya que no era automatizada, lo que lo hizo
eventualmente obsoleto.
 Marcadores basados en enzimas de restricción
Restriction Fragment Lenght Polymorphism (RFLP)

Los pasos básicos en un RFLP son:

1. Extracción del ADN

2. Restricción – Digestión

3. Separación de los fragmentos por electroforesis

4. Blotting de gel a membrana de nitrocelulosa

5. Incubacion con sondas etiquetadas (para la hibridación con los fragmentos)

6. Autoradiografía
 Marcadores basados en enzimas de restricción
Restriction Fragment Lenght Polymorphism (RFLP)

Flujo de trabajo básico para identificar polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción RFLP
 Marcadores basados en enzimas de restricción
Restriction Fragment Lenght Polymorphism (RFLP)

Diferentes marcadores RFLP en ADN genómico digerido con EcoRI y HindIII

 Marcadores basados en enzimas de restricción
Restriction Fragment Lenght Polymorphism (RFLP)

Individuo 1 Individuo 2
 Marcadores basados en enzimas de restricción
Restriction Fragment Lenght Polymorphism (RFLP)

1980 1985
Botstein vs Jeffreys

Variación del ADN que da lugar al RFLP

Simples cambios en las Repeticiones en tandem de

secuencias del ADN secuencias de ADN

In - Dels Variable number of tandem repeats

(VNTR) or minisatellites

Para mapa de ligamiento genético Para identificación de individuos

 Marcadores basados en enzimas de restricción
Restriction Fragment Lenght Polymorphism (RFLP)
 Marcadores basados en PCR

¿Cómo funciona la Reacción en Cadena de la

Polimerasa “PCR” ?
Amplificación exponencial
(poca cantidad de ADN, limitación en
RFLPs)

Especificidad
 Primers inespecíficos también pueden ser útiles

Primers degenerados
Amplifican un mismo locus
a pesar de los posibles
polimorfismos presentes

Primers cortos (≈10pb)

La ocurrencia de
combinaciones de
nucleótidos por azar es
más probable en
secuencias más cortas
Amplified Fragment Lenght Polymorphism
(AFLP)
 Marcadores basados en enzimas de restricción
Amplified Fragment Lenght Polymorphisms (AFLP)

El AFLP es otra técnica de fingerprinting que se basa en el RFLP (por eso es categorizada
dentro técnicas que usan enzimas de restricción) seguida de una PCR selectiva para
generar fragmentos amplificados de ADN genómico de cualquier organismo sin necesidad
previa de saber la secuencia genómica. Adicionalmente.
 Marcadores basados en enzimas de restricción
Amplified Fragment Lenght Polymorphisms (AFLP)

SI bien el AFLP fue desarrollada para estudios en plantas (Vos and Zabeau, 1993), ahora es
usada para una variedad de apicaciones como: creación de mapas genéticos,
determinación de parentezco enrte cultivares, estudio de diversidad genética y estudios
filogenéticos.

Éste método está basado en el principio de amplificar selectivamente un subconjunto de

fragmentos de restricción a partir de una mezcla compleja de fragmentos de ADN
obtenidos después de la digestión del ADN genómico con endonucleasas de restricción.
 Marcadores basados en enzimas de restricción
Amplified Fragment Lenght Polymorphisms (AFLP)

Los pasos básicos en un AFLP son:

1. Extracción del ADN

2. Restricción – Digestión

3. Ligación del adaptador

4. Amplificación (pre selectiva y selectiva

5. Electroforesis en gel de poliacrilamida ó analizadores de

fragmentos
 Marcadores basados en enzimas de restricción
Amplified Fragment Lenght Polymorphisms (AFLP)
Genomic DNA

1 Restriction digestion

2 Adaptor ligation

3 Pre-selective amplification

4 Selective amplification

5 Electrophoresis

Ilustración del flujo de trabajo básico de AFLP

EcoRI adapter Msel adapter

EcoRI pre-selective primer A C Msel pre-selective primer

EcoRI selective primer Axx Cxx Msel selective primer

(labeled)
 Marcadores basados en enzimas de restricción
Amplified Fragment Lenght Polymorphisms (AFLP)
Cleaved Amplified Polymorphic Sequence
(CAPS)
 Marcadores basados en enzimas de restricción
Cleaved Amplified Polymorphic Sequence (CAPS)

En el caso del CAPS, éste marcador combina la amplificación de la PCR y la

digestión con enzimas de restricción de los productos de la PCR.

Los CAPS se basan en las variaciones que aparecen en la secuencia del sitio de
reconocimiento de la enzima de restricción de los individuos. Estas diferencias se
originan por inserciones o deleciones que causan la introducción o remoción de
los sitios de reconocimiento de las enzimas de restricción.
 Marcadores basados en enzimas de restricción
Cleaved Amplified Polymorphic Sequence (CAPS)

Debido a la similaridad entre las técnicas de RFLPs y los CAPS, en que combinan
PCR con enzimas de restricción y polimorfimsos en la longitud de los fragmentos,
los marcadores CAPS han sido muchas veces referidos cmo PCR-RFLP. Sin
embargo, comparado con la compleja hibridización del Southern blot y los
procedimientos laboriosos de detección de sondas radioactivas, el análisis de los
CAPS es menos laborioso.
 Marcadores basados en enzimas de restricción
Cleaved Amplified Polymorphic Sequence (CAPS)

Los pasos básicos en CAPS son:

1. Extracción del ADN

2. Amplificación de secuencias falqueadas por primers específicos

3. Digestion – Restricción de fragmentos amplificados

4. Electroforesis en geles de agarosa

 Marcadores basados en enzimas de restricción
Cleaved Amplified Polymorphic Sequence (CAPS)
 Marcadores basados en enzimas de restricción
Cleaved Amplified Polymorphic Sequence (CAPS)
 Marcadores basados en enzimas de restricción
Cleaved Amplified Polymorphic Sequence (CAPS)

RsaI FokI
Random Amplified Polymorphic DNA
(RAPD)
 Marcadores basados en PCR
Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)

Los pasos básicos para el uso de RAPDs como

marcadores moleculares son:

1. Extracción del ADN

2. Diseño de pequeños primers (8 a 10 nucleótidos) aleatoriamente

3. Amplificación aleatoria por PCR

4. Electroforesis en geles de agarosa

 Marcadores basados en PCR
Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)
 Marcadores basados en PCR
Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)

Basado en PCR
Diseño arbitrario de primers cortos (8-10bp)
Cobertura del genoma: Alta
Alta cantidad de bandas
Primers pueden ser usados en varias especies
Grado de polimorfismos detectados: medio-alto
Genotipado: Dominante
Cantidad de ADN requerida: baja
Conocimiento previo del genoma: No
Costo: bajo
Tiempo requerido: bajo **Dificultad para saber si la banda
Replicabilidad: Baja observada proviene del mismo locus
Interpretación de bandas puede variar (operador)
Principales aplicaciones
Fingerprinting
Taxonomic identification
Genetic diversity studies
Sequence Characterized Amplified Region
(SCAR)
 Marcadores basados en PCR
Sequence Characterized Amplified Region (SCAR)

Procesamiento de un
marcador RAPD o AFLP

Caracterización de
banda polimórfica
mediante
secuenciamiento

Primers más
específicos que en
RAPD (15-30 bp)
 Marcadores basados en PCR
Sequence Characterized Amplified Region (SCAR)

Más reproducible e informativo que RAPD/AFLP

Generación de un marcador potencialmente codominante

Desarrollo de marcadores específicos

diagnóstico
marcadores de resistencia
 Marcadores basados en PCR
Sequence Characterized Amplified Region (SCAR)
 Marcador Molecular Ventajas Desventajas

- Baja resolución.
- Amplia cobertura del genoma - Requiere una mayor cantidad de ADN.
RFLPs (Polimorfismos de
- Estabilidad y alta reproducibilidad. - Proceso laborioso y consume tiempo.
Longitud de Fragmentos de
- Detectan cambios puntuales. - Limitado a sitios de reconocimiento de enzimas.
Restricción)
- Historia bien establecida en la literatura. - Menos informativo en comparación con otros
marcadores.

- Alta resolución y capacidad para detectar muchos

AFLPs (Polimorfismos de - Proceso técnico y laborioso.
polimorfismos.
Longitud de Fragmentos - Requiere optimización cuidadosa.
- No requiere información de secuencia previa.
Amplificados) - Puede ser costoso.
- Reproducible y consistente.

- Basado en diferencias secuenciales específicas. - Limitado a sitios de reconocimiento de enzimas.

CAPs (Polimorfismos de Análisis - Puede ser más rápido que RFLPs. - Requiere conocimiento de secuencia previa.
de Corte) - Permite analizar polimorfismos de nucleótido - No tan ampliamente informativo como otros
único (SNPs). métodos.

- Baja reproducibilidad en diferentes condiciones o

- No requiere conocimiento de secuencia previa. laboratorios.
RAPDs (Polimorfismos de ADN - Rápido y sencillo. - Puede ser influenciado por variaciones menores
Amplificados al Azar) - Capaz de generar múltiples marcadores en las condiciones de la PCR.
simultáneamente. - No tan específico; puede dar lugar a falsos
polimorfismos.
- Alta reproducibilidad.
- Requiere el desarrollo inicial a partir de RAPDs o
SCARs (Marcadores de - Basados en secuencias de ADN conocidas, lo que
marcadores similares.
Secuencia Caracterizada permite una identificación específica.
- Requiere conocimiento de secuencia previa.
Amplificada) - Menos sensible a variaciones en las condiciones
- Proceso de desarrollo puede ser laborioso.
de la PCR en comparación con RAPDs.
 Genética y Bioinformática Módulo 1

7. microsatélites
STR “Short Tandem Repeats”, SSR “Simple Sequence Repeats” or microsatellites

Next slide
Repeat unit size = 1 to 6 nucleotides

Repeated 8 times Repeated 20 times

VNTR “Variable Number of Tandem Repeats” or

Repeat unit size = hundreds base pairs

Repeated 4 times
 1
(A)11 :AAAAAAAAAAA
Mono nucleotídica
2

(GT)9 : GT GT GT GT GT GT GT GT GT
Di nucleotídica
3

(CTC)12 : CTC CTC CTC CTC CTC CTC CTC CTC CTC CTC CTC CTC
Tri nucleotídica
4

(GATA)8 : GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA

Tetra nucleotídica
5

(ATCGC)5 : ATTGCC ATTGCC ATTGCC ATTGCC ATTGCC

Penta nucleotídica
6

(ATTGCC)4 : ATCGC ATCGC ATCGC ATCGC

Hexa nucleotídica
Clasificación de los microsatélites

Génico o
genómico

TATATATATATATATA
TATATATAGTATATA
TATATAGCACTATATATATA
TATATATATACTCTCTCTCT
 Mecanismos que explican las mutaciones

Importancia de SSR: Alta abundancia genómica y múltiples funciones.

Tasa de mutación: Extremadamente alta (10−2 10−6 eventos por locus por
generación) comparada con mutaciones puntuales en genes.
Factores de variabilidad: Especie, tipo de repetición, locus, alelo, edad y sexo.
Manifestación principal: Cambios en el número de repeticiones SSR.

Mecanismo 1: Deslizamiento de DNA durante la replicación.

Mecanismo 2: Recombinación entre cadenas de DNA.

Factores que afectan la tasa de mutación: Motivo repetido, tamaño del alelo,
posición cromosómica, contenido GC, división celular, sexo y genotipo
(especialmente mutaciones en genes involucrados en la reparación Mismach
MMR ).
 Sistema MMR y estabilidad de SSR

Las variaciones en los números de repeticiones SSR a menudo se deben a errores

de desemparejamiento de cadenas durante la replicación del ADN.

Aunque algunos errores se corrigen mediante revisión exonucleolítica y

reparación de desajustes del ADN, muchos se escapan y se convierten en
mutaciones.

La inestabilidad del SSR puede representar un equilibrio entre la generación de

errores de replicación y su corrección.

Mutaciones en genes MMR humanos, como hMLH1, hMSH2, hMSH3 y hMSH6,

están asociadas con inestabilidad SSR. Si se dañan estos genes, aumenta la
inestabilidad de SSR.

La inestabilidad de SSR asociada con un MMR defectuoso está relacionada con

ciertos cánceres humanos.
 Implicaciones y factores que afectan el sistema
MMR

La eficacia del sistema de reparación puede verse influenciada por la ubicación

genómica del desajuste, el ADN circundante, las señales de reconocimiento de
hebra y el estado de metilación.

Paradoja: el sistema MMR, que limita las mutaciones en secuencias SSR, es

vulnerable a mutaciones debido a que tiene SSR en sus propias regiones
codificantes.

Se ha documentado variabilidad en el MMR entre individuos de una especie.

La suposición principal es que el deslizamiento de replicación es el mecanismo

clave y que las mutaciones en repeticiones SSR tienden a hacer que la matriz
crezca.

La selección natural tiene un papel crucial al actuar sobre los tamaños de alelos
SSR, potencialmente estableciendo límites superiores e inferiores para la
longitud.
Replication slippage (deslizamiento durante la
replicación)
 Recombinación

La recombinación puede alterar la longitud de las SSR mediante

cruzamientos desiguales o conversión génica.

Análisis revela que la tasa de reordenamiento intra-alelo aumenta con el

tamaño del array.

Fenómenos observados similares a la inestabilidad de repeticiones

trinucleótidas.

Intercambios desiguales impactan en la acumulación de secuencias

repetitivas en el genoma.

Estudios recientes destacan el papel de la recombinación no recíproca en la

desestabilización de repeticiones.
 Interacción Deslizamiento y Recombinación

Durante la reparación del ADN dependiente de la recombinación, puede ocurrir un

deslizamiento de replicación:

Estructura Holliday: Configuración de cuatro cadenas que surge de un intercambio

entre cromosomas homólogos. Crea regiones de ADN heterodúplex desparejadas.
Mecanismo de deslizamiento: Puede funcionar en tractos de recombinación que
involucran matrices SSR.
En levaduras, los eventos de 'reparación-deslizamiento' relacionados con la
conversión génica pueden ocurrir 800 veces más que el 'deslizamiento de replicación’.

La interacción de deslizamiento y recombinación en regiones de ADN heterodúplex

podría afectar la estabilidad de SSR. Algunos SSRs promueven eventos de
recombinación.
Holyday junction
 Detección por PCR – primers de relativo fácil
diseño y amplia aplicabilidad

La transferibilidad de primers entre especies es posible; sin embargo, su éxito

disminuye con un aumento en la divergencia genética.

Existe la posibilidad de la presencia de alelos nulos debido a primers poco

específicos, la preferencia hacia fragmentos de ADN más cortos y la calidad del
ADN.
 Identificación y diseño de primers

Identificación de microsatélites

Bases de datos (Genbank, EMBL)

Secuenciación genómica o transcriptómica

Bibliotecas genómicas (enriched VS shotgun)

ESTs

Diseño de primers
 Detección de los resultados

Electroforesis
agarosa
poliacrilamida (> kb)

Sistema automatizado: primers

marcados con un fluoróforo +
electroforesis capilar
 Detección por laser y sistema de electroforesis capilar

Ejemplo: GeneScan 500 LIZ (tamaño estándar)

35 a 500 bp, color naranja
 Fluoróforos - ejemplos

1 primer marcado en 5’
 Fluoróforos – sistema multiplex
Mismo fluoróforo en diferentes pares de primers
Amplificación múltiple en única reacción de PCR (mxPCR)
Análisis en simultaneo de 5 a 8 marcadores – sistema multiplex

Determina tamaño del alelo

Determina número de
repeticiones

Softwares comerciales, ejemplos:

GeneMapper Applied
Biosystems
CEQ 8000 Beckman Coulter
GeneMarker SoftGenetics
Aplicaciones
Mapeamiento
genético

Testeo de
paternidad

Genética de
poblaciones
En medicina – genética humana

Distrofia miotónica

Las repeticiones CTG normales en la región no codificante del gen DMPK están
entre 5 y 37 repeticiones. La enfermedad puede involucrar repeticiones CTG
de 50 a 1000 repeticiones.

Atrofia muscular bulbar espinal

Una repetición normal de CAG en el primer exón codificante del gen del
receptor de andrógenos está entre 9 y 36, y las personas con 38 a 62
repeticiones desarrollan la enfermedad.
En ciencias forenses SSR preferido sobre RFLP
 Microsatélites, ventajas

Bajas cantidades de ADN necesarias

Abundancia en el genoma
Distribución aleatoria en el genoma
Secuencias cortas
Altos niveles de polimorfismo
Análisis exacto de los loci y # alelos/loci
Tamaños alelos determinados con exactitud
Marcadores codominantes
Alta reproducibilidad
Multiplex
Amplio ango de aplicaciones
Automatización
 Microsatélites, desventajas

Costos iniciales
Conocer secuencias para diseños de primers
Proceso experimental puede ser largo (optimización de
protocolos)
Alelos nulos pueden no permitir identificar heterocigotos
No son las mejores opciones para construcción de arboles
filogenéticos
8. Marcadores ribosomales y
marcadores haploides
 Ribosomas
5’

50S

30S

3’
Large Subunit (LSU)

Small Subunit (LSU)

 Carl Woese George Fox

“The 1977 paper is one of the most

influential in microbiology and arguably,
all of biology. It ranks with the works of
Watson and Crick and Darwin, providing
an evolutionary framework for the
incredible diversity of the microbial world”
Justin Sonnenburg, Standford University microbiologist

Reconstructing the history of life

unidades de transcripción del ADN ribosómico repetidas en tándem
 Los genes ribosomales

Codifican las subunidades y péptidos ribosomales

Comunes para todas las células

Procariotas, eucariotas

• RNAr: Permite la inferencia de relaciones filogenéticas entre taxa muy distantes.

• Amplio rango de aplicaciones: desde el origen de la vida hasta eventos

evolutivos más recientes (Hillis y Dixon, 1991).
 Los genes ribosomales
Codifican las subunidades y péptidos ribosomales

Fuente de múltiples regiones

homólogas
Comunes para todas las células
• conservadas
• polimórficas
Homología y polimorfismos

Regiones homólogas con polimorfismos

Excelentes para filogenética molecular,

identificación de especies
Mutaciones siguen generalmente relojes moleculares

Presentan secuencias de bases altamente conservadas

con tasas de evolución muy lentas y predecibles.
Tasas más bajas que en genes que codifican proteínas
 Homología y polimorfismos

En qué regiones de los genes ribosomales

podemos encontrar polimorfismos?

Análisis dependientes del

conocimiento de secuencias
 Las subunidades

• 5S
• 5S
• 28S
• 16S
• 18S
• 23S
• 5.8S
 Regiones ribosomales polimórficas

Procariotas: 16S

Alto contenido de
polimorfismos

Utilizada en estudios de
taxonomía, identificación
molecular, etc.

Case et al. (2007) – D2L

 Regiones ribosomales no polimórficas

Eucariotas: 28S rRNA

Es altamente conservada en todos los

eucariotas

Número de polimorfismos: 0
 Regiones ribosomales polimórficas
• Secuencias localizadas en tándem (operón)
• Ayudan a la síntesis rápida de rRNA para la formación de las subunidades de los
ribosomas
• Disposición: Algunos cientos de copias repetidas en tandem.
– Cada una de estas copias se compone de la unidad transcrita y de la región de los espaciadores
externos no transcritos.

• En Eucariontes:
– 2 espaciadores internos transcritos (ITS) separan las subunidades 18S, 5.8S y 28S.
– Copias adyacentes de la unidad repetida de nrADN ("nrDNA repeat") son separadas por la región
del espaciador no transcrito (NTS), también llamado espaciador intergénico (IGS). Esta región
contiene elementos que sirven como estimuladores de la transcripción.
 Regiones ribosomales polimórficas

• En los ITS (Inter Transcribed Spacer) se observa:

• Altos niveles de polimorfismo

• Regiones flanqueantes altamente conservadas
 Algunas ventajas

Ventajas:
ü Los ITS se encuentran altamente representados en el
genoma. Se pueden amplificar con cantidades pequeñas
de ADN (Eukariotas).

ü Presentan mayor grado de polimorfismo asociado que

las regiones codificantes para las unidades ribosomales.

ü Las secuencias altamente conservadas son muy útiles en

el diseño de primers universales.

ü Esto facilita la amplificación de los ITS mediante PCR.

 Consideraciones:

Relojes moleculares discutibles para una parte de la

comunidad científica

Heterogeniedad rDNA dentro un mismo organismo

uMúltiples cópias de genes rRNA
 Gen 16s
ARN ribosomal 16S (o 16S rRNA): es el
componente de ARN de la subunidad 30S del
ribosoma procariota (ARNr SSU). Se une a la
secuencia Shine-Dalgarno y proporciona la mayoría
de la estructura del SSU.

Carl Woese: microbiólogo y biofísico

estadounidense: pionero en el uso del 16S rRNA en
filogenética en 1977. Famoso por definir las
Archaea (un nuevo dominio de vida) en 1977
mediante la taxonomía filogenética del ARN
ribosomal 16S, una técnica que él innovó y que
revolucionó la microbiología.

Los genes que codifican para esto se denominan

genes de ARNr 16S y se utilizan en la
reconstrucción de filogenias, debido a las lentas
tasas de evolución de esta región del gen.
 La secuencia Shine-Dalgarno en
procariotas

Secuencia Shine-Dalgarno (SD):

un sitio de unión ribosomal en el

ARN mensajero de bacterias y
arqueas.
Generalmente ubicada alrededor de
8 bases aguas arriba del codón de
inicio AUG.
Ayuda a reclutar el ribosoma al ARN
mensajero para iniciar la síntesis de
proteínas al alinear el ribosoma con
el codón de inicio.
La secuencia consenso de seis
bases es AGGAGG.
• El gen 16S rRNA es utilizado para estudios filogenéticos ya que
está altamente conservado entre diferentes especies de bacterias y
archaea.

• Carl Woese fue pionero en este uso del 16S rRNA en 1977. Se
sugiere que el gen 16S rRNA puede ser utilizado como un reloj
molecular confiable, ya que se ha demostrado que las secuencias
de 16S rRNA de linajes bacterianos distantes tienen funcionalidades
similares.

• El par de cebadores más común fue ideado por Weisburg et al.

(1991) y actualmente se conoce como 27F y 1492R; sin embargo,
para algunas aplicaciones pueden ser necesarios amplicones más
cortos, por ejemplo, para la secuenciación 454 con química de
titanio, se utiliza el par de cebadores 27F-534R que cubre desde V1
hasta V3.
EZ BioCloud
 Estudio de Marcadores Moleculares basados en
Ribosomas
1. Elección del Marcador: Selección de la región del ARNr (e.g., 16S, 18S,
23S, 5.8S).
2. Extracción de ADN: Obtención a partir de muestras biológicas.
3. Amplificación por PCR: Diseño de cebadores y amplificación de la región
seleccionada.
4. Secuenciación: Purificación del producto de PCR y secuenciación (Sanger
o plataformas de nueva generación).
5. Análisis de Secuencias: Uso de herramientas como MEGA, ARB, QIIME
para análisis filogenéticos y más.
6. Interpretación: Evaluación de relaciones evolutivas, diversidad,
taxonomía, etc.
Nota: Los marcadores ribosómicos son conservados pero pueden no distinguir
especies cercanas. Se recomienda revisión de metodologías específicas.
Marcadores haploides
 Marcadores Haploides

Genomas sin recombinación genética

ADN mitocondrial
ADN cloroplastidial
Cromosoma Y
ADN mitocondrial
Gen COX1, motivo por el cuál el mtDNA puede ser
considerado un marcador en estudios taxonómicos.
Conservado en eucariotas pero
con niveles considerables de
polimorfismo

Usado en DNA barcoding

(fragmento estandarizado de 658
bp)

Overview of mtDNA
COX1 con mayor rango de señal
filogenética
 Región control: motivo por el cuál el mtDNA
puede ser considerado un marcador en análisis
forenses y diagnósis molecular médica

Mutational hotspot

La región D-Loop es un “hotspot”

para las alteraciones del mtDNA

La región D-Loop contiene dos

regiones importantes en análisis
forenses y de diagnosis médica

Overview of mtDNA
En 1987 estudió junto a Mark Stoneking y Allan Wilson el ADN mitocondrial, concluyendo
que toda la humanidad desciende de antepasados provenientes del continente africano,
puesto que los genes mitocondriales se transmiten por vía materna. A ese antecedente
común se le ha dado el sobrenombre de Eva mitocondrial o Eva Africana, base de la
teoría de la emigración africana.
Razones por las que el mtDNA es adoptado como
marcador molecular

1. El mtADN es relativamente fácil

de amplificar ya que aparece en
múltiples copias en la célula.

1000s of copies of mtDNA vs 1 copy of nuclear DNA

Razones por las que el mtDNA es adoptado como
marcador molecular

2. Los genes mitocondriales están fuertemente

conservados en los animales, con muy pocas
duplicaciones, ningún intron y regiones
intergénicas muy cortas.
Razones por las que el mtDNA es adoptado como
marcador molecular

3. Las regiones variables (por ejemplo, la

región de control o D-loop) suelen
estar flanqueadas por regiones
altamnete conservadas (por ejemplo,
D-Loop
el ADN ribosomal), en las que se
pueden diseñar primers para la PCR.
 Razones por las que el mtDNA es adoptado como
marcador molecular
4. El mtDNA tiene una herencia
clonal (maternal), lo que significa
que todo el genoma se comporta
como un locus simple no
recombinante, simplificando la
representación y el análisis de los
datos en estudios dentro especies
(se puede secuenciar el mtDNA).
Por esta razón los genotipos del
mtDNA son referidos como “clones
o haplotipos”.
Razones por las que el mtDNA es adoptado como
marcador molecular

5. El mtDNA evoluciona de forma casi neutral, con

mutaciones raramente deletereas acumulandose
através del tiempo.
 mtDNA: algunas ventajas

ü Estudios diversidad molecular, filogenia, evolución

ü Dependientes de secuencias
ü Primers conservados
ü Bajos costos
ü ADN más robusto que el ADN nuclear (menor
degradación durante manipulación)
ü Tasas de mutación más altas que en el ADN nuclear
ü Mutaciones neutras – relojes moleculares
 mtDNA: algunas desventajas

Herencia clonal (ausencia de recombinación)?

Neutralidad y relojes moleculares?

“…paternal leakage followed by

recombination, finally, was
discovered in a human patient
(Kraytsberg et al. 2004).”
“In flowering plants…the occurrence
of recombination is also debated. In
Silene vulgaris, recent
recombination events within and
among genes, and between
mitochondria and chloroplast, have
been detected.”

“On a larger evolutionary scale,

phylogenetic conflicts involving
mtDNA support
the hypothesis of recurrent
horizontal transfer of
neutralidad mitochondrial genes during the
tasas de sustitución history of angiosperms.”
 Galtier et al (2009)

Aunque su relevancia como marcador casi

neutro ha estado disminuyendo, existe un
creciente interés en procesos funcionales
seleccionados asociados con variaciones del
mtDNA:

Mitogenomics
Respiración – actividad metabólica
Otros procesos celulares: envejecimiento
procesos adaptativos
Enfermedades (humanos)
Y chromosome
Overview of chromosome Y
Y-STR positions along Y chromosomes
DYS19
DYS19*13
Marcador de poblaciones africanas
DYS19*14
Marcador de Europa central
DYS392
Marcador del Norte de Africa,
Medio Este y Europa mediterránea
 Cromosoma Y – ciencias forenses

víctima - mujer

ADN encontrado en
la escena del crimen
Cromosoma Y – ciencias forenses
 Cromosoma Y – nuevos avances

“…several unexpected associations between the Y chromosome, immune system and

complex polygenic traits.”

“Data from association studies have revealed a potential role for the genetic
variation within the Y chromosome in determination of men’s health and
susceptibility to disease.”
 La familia Romanov

* mtDNA (mitocondrial)
* STR autosómicos (short tandem repeat) –
microsatélites ligados a cromosomas
autosómicos
* Y-STR – microsatélites ligados a cromosoma Y
SNPs: Single Nucleotide Polymorphisms
Single Nucleotide Polymorphisms

Variación de un solo
C
nucleótido respecto a la
99%
norma en al menos 1% de
G 1% la población
Single Nucleotide Polymorphisms

Alrededor de 3 milones de
SNPs en humanos
Ocurrencia de 1 SNP en
cada 500 – 1000bp
Single Nucleotide Polymorphisms

AGTAGCCGTGATCA
AGTAGCTGTGATCA
Variante o alelo
 Single Nucleotide Polymorphisms

SNPs son más abundantes en sistemas vegetales.

Como mínimo se estima que en el genoma del maíz
habrían 20.000.000
 Clasificación de los SNPs

Ocurrencia
Regiones Regiones no Regiones Regiones no
codificantes codificantes entre los en proximidad
A) Sinónimos genes del gen
B) No sinónimas BB1)) Sentido erróneo
Sin sentido
2

Mutación
Transición Transversión

Cromosomas homólogos
Homocigoto Heterocigoto
Single Nucleotide Polymorphisms

En función al sitio de su ocurrencia:

SNPs que ocurren en regiones codificantes:

Éstos SNPs pueden tener efectos deletereos en la

codificación de las proteínas (finalmente en la
estructura de la proteína).
Single Nucleotide Polymorphisms

En función al sitio de su ocurrencia:

SNPs que ocurren en regiones codificantes:

Sinónimos No sinónimos
 Single Nucleotide Polymorphisms

En función al sitio de su ocurrencia:

SNPs que ocurren en regiones codificantes:

polimorfismo C1236T cambia un codón
Sinónimos: no cambian la secuencia GGC a GGT (ambos codifican glicina)
del amino ácido en la proteína o no
afectan la función de la proteina; sin polimorfismo C3435T cambia ATC a ATT
embargo, pueden afectar su función de (ambos codifican isoleucina).
otras maneras. Un ejemplo sería una
mutación aparentemente silenciosa en el
gen 1 de resistencia a múltiples fármacos ralentiza la traducción de la cadena
(MDR1). polipeptídica (ARNm), formando pliegues que
ralentizan el proceso de traducción.
 Single Nucleotide Polymorphisms

En función al sitio de su ocurrencia:

SNPs que ocurren en regiones codificantes:

No Sinónimos: Pueden alterar genes

que codificación proteínas, cambiando las Sentido erróneo
estructuras y funciones de sus respectivas
proteínas. A su vez, éstas se pueden
clasificar en: Sin sentido
 Single Nucleotide Polymorphisms
En función al sitio de su ocurrencia:

SNPs que ocurren en regiones codificantes:

Sentido erróneo
Un solo cambio en la base produce un
cambio en el aminoácido de la proteína
y su mal funcionamiento, lo que
conduce a la no funcionalidad de la
proteina o a enfermedades
CGT a CTT
Condición: progería
Argenina Leucina
 Single Nucleotide Polymorphisms

En función al sitio de su ocurrencia:

SNPs que ocurren en regiones codificantes:

Sin sentido
Mutación puntual en una secuencia de ADN
que da como resultado un codón de parada
prematura, o codón sin sentido en el ARNm
transcrito, y en un producto proteico truncado,
incompleto y generalmente no funcional.

Condición: fibrosis quística

Single Nucleotide Polymorphisms

En función al sitio de su ocurrencia:

SNPs que ocurren en regiones no codificantes:

Los SNPs en éstas regiones pueden aumentar el riesgo

de cáncer y pueden afectar la estructura del mRNA y la
susceptibilidad a determinadas enfermedades
Single Nucleotide Polymorphisms

En función al sitio de su ocurrencia:

SNPs que ocurren entre genes (intergen) :

Pueden afectar en cuando y como el gen es
“encendido”, lo que afecta la cantidad de proteína que
es producida. También pueden afectar al gen splicing
(SNPs en los intrones), al transcription binding factor, a
la degradación del RNA mensajero, o simplimente a la
secuencia de una región no codificante del RNA
Single Nucleotide Polymorphisms

En función al sitio de su ocurrencia:

SNPs que no están en la proximidad de un gen:

Éstos pueden ser utilizados como marcadores genéticos

para localizar genes que causan enfermedades.
Single Nucleotide Polymorphisms

En función a los mecanismos de mutación:

SNPs de transición:

Mutación purina a purina

A a G y viceversa
Mutación pirimidina a pirimidina
C a T y viceversa
Single Nucleotide Polymorphisms

En función a los mecanismos de mutación:

SNPs de transversión:

Mutación purina a pirimidina

Mutación pirimidina a purina
A a C, A a T, G a C y G a T y viceversa
Single Nucleotide Polymorphisms

En función a su presencia en cromosomas

homólogos:
SNPs homocigótos:

Cuando ambos cromosomas homólogos presentan T-A

en el sitio correspondiente. Otro caso es cuando en en
el sitio de ambos cromosomas homólogos se presenta
C-G.
Single Nucleotide Polymorphisms

En función a su presencia en cromosomas

homólogos:
SNPs heterocigotos:

Cuando en el sitio correspondiente se tiene T-A en un

cromosoma y C-G en el cromosoma homólogo.
 Detección de SNPs

• Secuenciamiento:
– Sanger Sequencing:

– [Link]

– SNPs Arrays (Chips):

– [Link]
10. Secuenciación
Métodos de secuenciación
• Primera Generacion: Dideoxy sequencing
• Sanger
• Segunda Generacion : Cyclic-synthesis
and -ligation sequencing
• Illumina
• Others: Roche454, Ion Torrent,
Complete Genomics
• Tercera Generacion: Single-molecule real-
time sequencing
• PacBio
• Oxford Nanopore
 Costo de
secuenciación
se ha
reducido
drásticamente
¿Cómo funcionan las tecnologías de secuenciación?
Puntos a
considerar
antes de
secuenciar
Pasos a
seguir
Primera generación: Secuenciación Sanger
 Reaccion en
cadena de la
polimerasa
(PCR)
Secuenciamiento
Sanger
Preparación de
librerias para la
secuenciacion
Sanger
Resultados de la secuenciacion Sanger
Segunda generación: Secuencias cortas con Illumina
Construcción
de la librería
Illumina
Secuencia de indexación y
secuenciación múltiplex

• Cada muestra tiene un adaptador

de oligonucleótido
• Los adaptadores tienen códigos de
barras únicos
• Esto permite secuenciar múltiples
muestras al mismo tiempo
Secuenciación
"paired-end"
• [Link]
Características
de los datos
de secuencia
Tecnología
Illumina
 • Variantes estructurales
duplicaciones
Limitaciones inversiones
de • Regiones repetidas largas o complejas
• Ensamblaje de genoma completo de novo
secuenciación se aplica a los sistemas diploides y
con Illumina poliploides
no es un problema para los procariotas
Ventajas de
secuencias
largas
Tercera generación: Secuencias largas con
PacBio SMRT Sequencing
Preparación de
librería para
PacBio

• Single Molecule
Real Time
Sequencing
(SMRT)
 PacBio reads

La secuenciación se produce en nano- La polimerasa puede replicar el mismo

pozos en un microchip llamado zero mode ADN varias veces
waveguide (ZMW)
• [Link]
Tercera generación: Secuencias largas con
Oxford Nanopore

Tercera generación:

Secuencias largas con

Oxford Nanopore
Secuenciación
via Nanopore
• [Link]
 Resumen de las tecnologías de
secuenciación
• Primera generación - Sanger
• Ventajas: altamente preciso, más largo que las secuencias de
Illumina
• Desventajas: extremadamente caro y bajo rendimiento
• Segundo generación - Illumina
• Ventajas: barato; de alto rendimiento; altamente preciso
• Desventajas: secuencias cortas (50-300 bp)
• Tercero generación - PacBio
• Ventajas: secuencias muy largas (> 20 kb)
• Desventajas: Caro; menor precisión (se puede mejorar
secuenciando el modelo con polimerasa varias veces); menor
rendimiento
• Tercero generación – Oxford Nanopore
• Ventajas: secuencias muy largas (¡hasta 100 kb!), Tamaño
pequeño que lo hacen útil para experimentos de campo
• Desventajas: Caro, menor precisión y menor rendimiento
(pero recientemente la precisión ha mejorado
dramáticamente)
Como se analizan los resultados?
Procesamiento de datos Illumina y formato fastq
Análisis para
PacBio
Análisis para
MinION
Ensamblaje del genoma “de novo”
Ensamblaje del genoma con una referencia
Análisis de variantes del genoma
Anotación del genoma
Aplicaciones de
la secuenciación
genómica
Análisis
Metagenómico

Naylor et al, 2017

Análisis
comparativo
genómico en
bacteria

Xu et al, 2017
Anotación de
los genomas

Xu et al, 2017
Genoma del
árbol de oliva

Unver et al,
2017
Biosíntesis del
Aceite
 Software Carpentry Lessons
• [Link]

Data Carpentry Lessons

Recursos • [Link]

R Studio
gratuitos para • [Link]
comenzar con Github
bioinformática • [Link]

Libros gratis
• [Link]
• [Link]
• [Link]
• Bioinformatics Data Skills PDF Download:
• Google search “bioinformatics data skills pdf”
Plataformas de
análisis de
secuenciacion
de ADN
usando
bioinformática
RAD-Seq, ChIPSeq, RNA-Seq
NGS para la identificación de polimorfismos
 NGS, algunas limitaciones
Estudios asociativos a larga escala limitados a organismos
modelo
• No modelo?
• limitado para identificación de polimorfismos (muchos
individuos-costos y tiempo)
• limitado para genética de poblaciones
• limitado para estudios de diversidad/asociaciones genotipo-
fenotipo (linkage groups, genetic mapping)

Después de obtener los contigs, la construcción de novo

del genoma es compleja
• ejemplo, eucariotas: MB de nucleótidos complica el proceso

Softwares limitados
 Necesario: metodologías aplicables a
cualquier organismo (o varios organismos)

En tiempo y costos razonables

 RAD = Restriction site associated DNA

Secuenciamiento RAD (RAD-seq) =

combina marcadores RAD-tag con Illumina

Posibilita un screening de
polimorfismos en genomas
Secuencia partes de genomas

Genética poblaciones: posibilidad de uso en especies

con poca información (no modelo/silvestres)
 Rad-tags y Rad-seq

Concepto similar al RFLP y AFLP:

Reducir la complejidad del genoma, aislando

regiones por cortes con enzimas de restricción
RFLP: Restriction Fragment length Polymorphism

• Restricción de genomas completos

• Electroforesis
• Sondas para identificar las bandas polimórficas (Southern blot)
AFLPs: Amplified Fragment Length Polymorphisms

• Amplificación selectiva de
fragmentos de restricción

• Restricción del ADN genómico

• Adición de adaptadores
• PCR (primer adaptador/secuencia
enzima)
 RAD seq: pasos

1. Colección de Muestras de ADN:

Se recolectan muestras de ADN de los individuos o poblaciones que se están estudiando.

2. Digestión Enzimática:
Una enzima de restricción específica se usa para cortar el ADN en sitios de restricción
específicos, dejando fragmentos que contienen regiones del genoma cercanas a estos sitios.

3. Ligación de Adaptadores:
Adaptadores de secuencias conocidas se ligan a los extremos de los fragmentos de ADN. Estos
adaptadores son cruciales para la amplificación y secuenciación subsecuentes.

4. Fragmentación del ADN (Shearing):

Los fragmentos de ADN con adaptadores ligados se fragmentan ('shear') en tamaños
manejables, optimizando para la secuenciación.

5. Seleccionar Fragmentos de Interés:

Fragmentos de un rango de tamaño específico, que contienen adaptadores y sitios de
restricción, se seleccionan para la secuenciación.
 RAD seq: pasos

6. Amplificación por PCR:

Los fragmentos de interés se amplifican mediante PCR para generar suficiente material para la
secuenciación.

7. Secuenciación:
Se realizan lecturas de los fragmentos amplificados usando tecnologías de secuenciación de
próxima generación.

8. Análisis de Datos:
Las lecturas obtenidas se alinean a un genoma de referencia (si está disponible) o se ensamblan
de novo. Luego, se identifican variantes genéticas y se analizan en el contexto de loci específicos.

9. Interpretación y Aplicaciones:
Los resultados se interpretan para entender la función y distribución de las variantes
identificadas, ofreciendo insights en áreas como genética de poblaciones, evolución, y
mejoramiento genético.
 RAD Seq

Ventajas:
RAD-seq es efectivo en costos y aplicable a una variedad
de organismos, incluyendo aquellos sin genomas de
referencia.

Desventajas:
La elección de la enzima de restricción puede influir en
los resultados, y la interpretación de los datos requiere
herramientas bioinformáticas avanzadas.
 “…even as sequencing technology continues to improve,
Rad-seq RAD marker sequencing will remain a useful and cost-
effective tool for most genetic mapping studies.”
Baird et al (2008)

• Si hay genoma de referencia: comparar polimorfismos

• Si no hay genoma de referencia: construcción de novo de

mapas de polimorfismos
– aislar reads idénticos
– aislar secuencias únicas
– posibilidad de identificar homocigotos y heterocigotos (nivel de
amplificación del alelo)
– estudios asociativos genotipo:fenotipo (GWAS, QTLs)
Variantes de NGS aplicadas a Ómicas
 Ultra-deep bisulphite (BS)-DNA-Seq
– variante de NGS

• Epigenómica

• Residuos C no metilados + bisulfito = uracilo

ChIP-Seq – variante de NGS

• Epigenómica

• Análisis de la cromatina y del

ADN unidos a
FT/histonas/metilo

• asociación expresión
génica/fenotipo/otros estudios
evolutivos

• asociación estructura
cromatina/fenotipo
 RNA-Seq – otra variante de NGS

• Transcriptómica – técnica sucesora de Microarrays

• Análisis cualitativo y cuantitativo del mRNA en:

– Células / linajes celulares

– Ambientes (diferentes)
– Etapas de desarrollo
– Procesos metabólicos
– Estrés biótico / abiótico
– ...
RNA-Seq – preparación de bibliotecas

EST: Expressed
Sequence Tag
 RNA-Seq – flujo de trabajo y análisis

Qué genes/alelos/exones?

Cuánto de cada gen/alelo/exón?

 GWAS: Genome-wide association studies

Asociar loci/alelos específicos/polimorfismos a características

fenotípicas
– Secuenciar pools de individuos de una población con rasgos fenotípicos
extremos, o padres y descendientes en cruces controlados
– ADN o mARN...
 GWAS: Genome-wide association studies

Porqué no necesitamos la secuencia de todo el ADN?

• Recombinación: las regiones de un cromosoma no se

heredan todas al mismo tiempo

• Co-herencia de regiones genéticas (alelos) cercanas

• Estas regiones cercanas tienden a heredar

simultáneamente con mayor frecuencia (no son
asociaciones al azar/segregación independiente)
Análisis de ligamiento
Módulo 2 – GWAS en
genómica humana Visualizar las asociaciones
 QTLs
Los QTLs (Quantitative Trait Loci) son regiones genómicas asociadas con
rasgos cuantitativos, que son influenciados por múltiples genes y factores
ambientales.

Los QTLs son cruciales para entender la base genética de los rasgos complejos
y son fundamentales en programas de mejoramiento genético.

Rasgos Cuantitativos: Incluyen características como la altura, el peso y la

resistencia a enfermedades, que pueden ser medidas y cuantificadas.
Identificación: Los QTLs se identifican utilizando técnicas de mapeo genético
para asociar variaciones genéticas con variaciones fenotípicas observadas.
Poblaciones de Mapeo: Creación de poblaciones segregantes
derivadas de padres con diferencias fenotípicas conocidas.

Genotipificación: Uso de marcadores moleculares para

genotipificar individuos en la población de mapeo.

Análisis Estadístico: Aplicación de métodos estadísticos para

asociar marcadores específicos con variaciones en rasgos
cuantitativos.

Identificación de QTL: Ubicación de regiones del genoma que

contienen genes que contribuyen a la variación en un rasgo
cuantitativo.
 GWAS VS QTL

Los Estudios de Asociación del Genoma Completo (GWAS)

analizan el genoma completo de interés para identificar loci
relacionados con un fenotipo. En contraste, el análisis QTL
define qué marcadores moleculares están vinculados a un
fenotipo.
 Variantes de QTL

1. eQTL (Expression Quantitative Trait Loci):

Estudia la expresión genética. Requiere genotipificación y análisis de RNA-Seq.

2. meQTL (Methylation Quantitative Trait Loci):

Estudia la metilación del ADN. Necesita genotipificación y análisis de metilación del ADN.

3. caQTL (Chromatin Accessibility Quantitative Trait Loci):

Estudia la accesibilidad de la cromatina. Involucra genotipificación y análisis como ATAC-
Seq.

4. bQTL (Binding Quantitative Trait Loci):

Estudia la unión de factores de transcripción. Requiere genotipificación y ChIP-Seq.

5. pQTL (Protein Quantitative Trait Loci):

Estudia proteínas específicas. Necesita estudios de asociación de genoma completo y
secuenciación.
 ChIP-sequencing (ChIP-seq)
Principios
ChIP-seq combina la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) con la
secuenciación de nueva generación (NGS) para identificar las
interacciones entre las proteínas y el ADN en el genoma. La proteína
de interés, como una proteína de unión al ADN o una histona
modificada, se une a un anticuerpo específico. Luego, esta unión
proteína-ADN se purifica y se prepara para la secuenciación.
 Workflow
Fijación de células: Se utilizan agentes de fijación para cruzar las proteínas de unión al ADN
con el ADN.
Lisis de células: Las células se lisan para extraer el complejo proteína-ADN.
Inmunoprecipitación: Se utilizan anticuerpos específicos para precipitar el complejo
proteína-ADN de interés.
Reversión de la fijación: Se elimina la proteína del ADN.
Preparación de la biblioteca: El ADN se prepara en una biblioteca de secuenciación
adaptando los cebadores y marcadores necesarios.
Secuenciación de nueva generación (NGS): Se secuencia el ADN usando plataformas de
NGS.
Análisis de datos: Se utilizan herramientas bioinformáticas para analizar y visualizar los
datos de secuenciación, identificando picos de unión y regiones del genoma de interés.
 Ventajas
Resolución de alta calidad: ChIP-seq proporciona una resolución muy
alta para identificar los sitios de unión de proteínas específicas.
Específico: Permite el análisis específico de proteínas particulares y sus
modificaciones.
Comprehensive: Proporciona un perfil completo de la unión proteína-
ADN a través de todo el genoma.
Integración con otros datos de NGS: Facilita la integración con otros
conjuntos de datos genómicos para un análisis más profundo.
 Desventajas
Complejidad técnica: El protocolo es técnica y experimentalmente
complejo.
Requisitos de anticuerpos: Necesita anticuerpos de alta calidad y
específicos.
Variabilidad: Puede haber variabilidad en los resultados entre
experimentos similares.
Costoso: La combinación de ChIP y NGS puede ser costosa.
• [Link]

• [Link]
PXt5VyC2Byq6jhYOG_88YBI7VTs
 Tendencias y mejoras
1. Mejoras en la Resolución Espacial y Temporal
Mejoras en la resolución: Desarrollo de técnicas para obtener una
resolución más fina y detallada de las interacciones proteína-ADN.
ChIP-seq en tiempo real: Estudios que capturan dinámicas de unión en
tiempo real o en un marco temporal específico.
2. Automatización y Miniaturización
Protocolos automatizados: Uso de robots y equipos automatizados
para mejorar la eficiencia y reducir el error humano.
ChIP-seq de célula única: Analizar la heterogeneidad celular en la unión
proteína-ADN en células individuales.
3. Mejora en Anticuerpos y Ensayos
Desarrollo de anticuerpos: Nuevos anticuerpos más específicos y
sensibles para detectar proteínas y modificaciones específicas.
Ensayos mejorados: Protocolos optimizados que requieren menos
material de entrada y ofrecen una mayor sensibilidad.
4. Integración de Datos y Análisis Mejorados
Integración de multi-ómicas: Combina datos de ChIP-seq con otras
fuentes de datos ómicos para una visión más completa.
Algoritmos y software: Desarrollo de nuevas herramientas y algoritmos
para el análisis de datos de ChIP-seq.
5. Aplicaciones Clínicas y Terapéuticas
Aplicaciones clínicas: Uso de ChIP-seq para identificar dianas terapéuticas y
entender enfermedades complejas a nivel molecular.
Droga y desarrollo de terapias: Identificación de interacciones proteína-ADN
que pueden ser dianas para nuevas drogas y terapias.
6. Avances Tecnológicos
Tecnología de secuenciación: A medida que la tecnología de NGS continúa
avanzando, ChIP-seq se beneficia de la lectura más larga, mayor velocidad y
costos reducidos.
Técnicas de modificación: Nuevas estrategias para modificar y enriquecer los
complejos proteína-ADN de interés.
7. Estudios a Gran Escala y Bases de Datos
Proyectos a gran escala: Iniciativas que se enfocan en la generación de
bases de datos a gran escala de interacciones proteína-ADN.
Acceso a datos: Plataformas que facilitan el acceso y análisis de datos
de ChIP-seq de múltiples fuentes y estudios.
 Exome Sequencing (Exome-seq)
Principios

El Exome-seq implica la secuenciación dirigida de la región codificante

del genoma, es decir, el exoma. Estas regiones contienen la mayoría de
las variantes genéticas asociadas con enfermedades conocidas. Exome-
seq utiliza técnicas de enriquecimiento para capturar y secuenciar solo
estos segmentos específicos del ADN.
[Link]
_VA
 Workflow
Extracción de ADN: Se extrae ADN de muestras de tejido o sangre.
Enriquecimiento del exoma: Utiliza sondas específicas para capturar y
enriquecer regiones exónicas del genoma.
Preparación de la biblioteca: Se prepara una biblioteca de ADN para la
secuenciación.
Secuenciación: Se utiliza la secuenciación de nueva generación (NGS)
para secuenciar el exoma enriquecido.
Análisis de datos: Se emplean herramientas bioinformáticas para
analizar variantes genéticas y mutaciones.
Ventajas
Costo-Eficiente: Menos costoso que la secuenciación del genoma
completo porque se enfoca solo en regiones codificantes.
Enfoque dirigido: Identifica variantes funcionales que están
directamente asociadas con fenotipos y enfermedades.
Rapidez: Más rápido que la secuenciación del genoma completo
debido al volumen reducido de datos.
Alta Cobertura: Permite una cobertura más profunda para detectar
variantes raras y poco comunes.
Desventajas
Limitado: Solo se analizan regiones codificantes, omitiendo regiones no
codificantes importantes para la regulación genética.
Variantes no detectadas: No puede identificar variantes en regiones
intrónicas y intergénicas.
Enriquecimiento incompleto: La eficiencia del enriquecimiento puede
variar, llevando a una cobertura inconsistente.
Exome-seq y NGS
Exome-seq, en combinación con NGS, permite una detección rápida y
precisa de variantes genéticas en el exoma. Esta metodología ha sido
fundamental para identificar mutaciones asociadas con una variedad
de trastornos genéticos, cánceres y enfermedades raras. El uso de NGS
asegura una alta resolución y capacidad para detectar incluso variantes
de baja frecuencia, ofreciendo insights detallados sobre la genética de
enfermedades específicas y la variabilidad individual en el exoma.
 Tendencias en Exome-seq
Integración Multi-ómica: Combina datos exómicos con otros datos
ómicos para una visión más holística de la genética y la regulación.
Automatización y Machine Learning: Uso de IA y aprendizaje
automático para analizar grandes conjuntos de datos de exome-seq.
Aplicaciones Clínicas Expandidas: Uso creciente en pruebas clínicas y
personalización del tratamiento basado en el perfil genómico.
Mejoras en la Captura del Exoma: Tecnologías avanzadas para
aumentar la eficiencia y la especificidad de la captura del exoma.
 Exome-Seq RNA-Seq
Secuenciación del exoma (1-2% del Secuenciación del transcriptoma (incluye mRNAs, rRNAs,
Objetivo
genoma humano, regiones codificantes). tRNAs, etc.).

Material de Partida DNA RNA

Identificación de variantes genéticas Análisis de expresión génica, identificación de isoformas,

Aplicaciones asociadas a enfermedades en regiones análisis de splicing alternativo, descubrimiento de nuevos
codificantes. transcritos.

Captura y enriquecimiento de regiones Conversión de RNA a cDNA, no requiere enriquecimiento

Técnica
exónicas. específico.
Más rápido y menos costoso que la Costo y tiempo dependen de la profundidad y complejidad
Costo y Tiempo
secuenciación del genoma completo. requerida.
Información sobre variantes en regiones Vista dinámica de la expresión génica, comprensión de la
Resolución
codificantes. regulación génica.
[Link]
QWAQ
• [Link]
 Skim Sequencing

Secuenciación de baja cobertura para análisis genómicos rápidos y

económicos.

Aplicaciones:
Estudio de la diversidad genética.
Mapeo de rasgos genéticos.
Evaluación de la estructura de la población.
Ventajas:
Costo-eficiente: Menor costo comparado con la secuenciación de alta cobertura.
Rápido: Generación de datos genómicos a gran escala en un tiempo reducido.
Útil para organismos con genomas grandes o complejos.

Desventajas:
Resolución más baja: Menos detallada comparada con la secuenciación de alta cobertura.
No adecuada para detectar variantes raras o de baja frecuencia.

Técnica:
Combina la secuenciación de nueva generación (NGS) con análisis bioinformáticos
especializados para extraer información útil de datos de baja cobertura.
 Secuenciación Genotipado
Determina la secuencia completa de
Método nucleótidos Detecta variantes genéticas específicas

Genómica funcional, descubrimiento de Estudios de asociación, pruebas genéticas

Aplicaciones nuevas variantes directas al consumidor
Nivel de Información Detallada y completa Limitada a variantes conocidas
Costo y Tiempo Más costoso y tardado Más económico y rápido

Kits de prueba de ADN para genealogía o

Ejemplo Secuenciación del genoma completo enfermedades conocidas

Determina la secuencia completa de

Método nucleótidos Detecta variantes genéticas específicas

Genómica funcional, descubrimiento de Estudios de asociación, pruebas genéticas

Aplicaciones nuevas variantes directas al consumidor