1.
UN POCO DE HISTORIA
La primera publicación de algo parecido a un HPLC fue a mediados de los años 60s, donde
investigadores de la Universidad de Yale (New Haven, EEUU) publicaron un estudio donde se
utilizó una bomba para acelerar el flujo de la fase móvil a través de la columna.
A principios de los 70s, la empresa Waters Associates, fundada por Jim Waters, empezó a
comercializar las primeras versiones de HPLC. Estos instrumentos tuvieron una gran aceptación,
ya que mejoró los tiempos de análisis de la cromatografía líquida notablemente, debido a la POR
LA incorporación de una bomba de alta presión que hacía que la fase móvil se moviera a una
velocidad mucho más alta a lo que, por aquella época, era habitual.
2. ¿QUÉ ES LA HPLC?
La HPLC o cromatografía líquida de alta resolución es una técnica analítica para identificar y
cuantificar sustancias en una solución. Puede aplicarse para medir la concentración de hidratos de
carbono en alimentos y bebidas, pesticidas en aguas superficiales para análisis medioambientales
o catecolaminas en orina con fines clínicos, por citar algunos ejemplos.
La UHPLC (U significa “ultra”) se basa en el mismo principio, sólo que se aplican columnas
cromatográficas más nuevas y eficaces. Las columnas de UHPLC se rellenan con partículas más
pequeñas con un mejor rendimiento de separación. Debido a la estrechez de los canales entre las
partículas pequeñas, la presión en dicho sistema es mayor. Por eso, a menudo se necesitan
instrumentos especiales.
3. ¿CÓMO FUNCIONA LA HPLC?
Un sistema HPLC consta de una o varias bombas, un automuestreador, un detector y un software
de adquisición de datos. En el corazón del sistema HPLC hay una columna cromatográfica, llena
de partículas de fase estacionaria, donde tiene lugar la separación de las sustancias de una
mezcla. Los instrumentos están conectados mediante tubos, denominados conductos de flujo.
La(s) bomba(s) suministra(n) una solución portadora, o fase móvil, a través de la trayectoria de
flujo del sistema. La muestra que se va a analizar se introduce en la vía de flujo mediante un
automuestreador. Normalmente, el caudal en la mayoría de los HPLC está entre 0,05 – 2 mL/min.
La presión en el sistema depende sobre todo del tamaño de las partículas de la fase estacionaria,
de la longitud de la columna y del caudal. Las presiones típicas en HPLC son de 100 a 400 bares.
El principio de separación en HPLC se basa en la distribución del analito entre la fase estacionaria
(columna llena de partículas) y la fase móvil (disolvente que fluye a través). En un sistema HPLC
que funcione correctamente, el tiempo de permanencia en la columna es único para cada
sustancia de la mezcla. Este “tiempo de retención” identifica la sustancia. En la cromatografía de
fase inversa se utilizan partículas de fase estacionaria no polares. Como resultado, las sustancias
menos polares tienen una interacción más fuerte y pasan más tiempo en la columna que las
sustancias polares.
El detector mide continuamente la fase móvil que fluye a través de la célula de detección. Las
sustancias que eluyen de la columna provocan una desviación de la señal, en forma de pico
gaussiano. La señal se almacena y se analiza en un cromatograma mediante un software de
adquisición de datos en un PC que está conectado al detector.
4. Funcionamiento isocrático y en gradiente del sistema de cromatografía líquida (LC)
En la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) se utilizan dos modos de elución básicos. El
primero se llama elución isocrática. En este modo, la fase móvil (ya sea un eluyente puro o una
mezcla de eluyentes) permanece igual a lo largo de todo el análisis. En la figura J-1 se describe
un sistema típico.
El segundo tipo se denomina elución en gradiente, en el que, como su nombre indica, la
composición de la fase móvil cambia durante la separación. Este modo resulta útil para muestras
que contienen compuestos con un amplio intervalo de polaridades cromatográficas [consultar la
sección sobre los modos de separación por HPLC]. A medida que avanza la separación, se
incrementa la fuerza de elución de la fase móvil para eluir los componentes de la muestra
retenidos con más fuerza.
5. Escala de HPLC [analítica, preparativa y de proceso]
Se ha analizado cómo la HPLC proporciona datos analíticos que se pueden utilizar tanto para
identificar como para cuantificar los compuestos presentes en una muestra. Sin embargo, también
se puede utilizar la HPLC para purificar y recoger las cantidades deseadas de cada compuesto,
utilizando un colector de fracciones situado después de la celda de flujo del detector. Este proceso
se denomina cromatografía preparativa [consultar la figura K].
En la cromatografía preparativa, el científico puede recoger los analitos individuales a medida que
se eluyen de la columna [p. ej., en este ejemplo: amarillo, después rojo y después azul].
El colector de fracciones recoge selectivamente el eluato que ahora contiene un analito purificado
durante un periodo de tiempo especificado. Los recipientes se mueven de forma que cada uno
recoja un solo pico de analito.
Un científico determina los objetivos de nivel y la cantidad de pureza. Junto con el conocimiento de
la complejidad de la muestra y la naturaleza y concentración de los analitos deseados en relación
con los componentes de la matriz, estos objetivos, a su vez, determinan la cantidad de muestra
que se debe procesar y la capacidad requerida del sistema HPLC. En general, a medida que
aumenta el tamaño de la muestra, el tamaño de la columna de HPLC será mayor y la bomba
necesitará una mayor capacidad de caudal volumétrico. Determinar la capacidad de un sistema
HPLC se denomina seleccionar la escala de HPLC.
6. Modos de separación por HPLC
En general, se pueden utilizar tres características principales de los compuestos químicos para
crear separaciones por HPLC. Son:
▪ Polaridad
▪ Carga eléctrica
▪ Tamaño molecular
En primer lugar, se supone que la polaridad y los dos modos de separación principales
aprovechan esta característica: la cromatografía de fase normal y de fase reversa.
7. HPLC en fase normal
En sus separaciones de extractos de plantas, Tswett tuvo éxito utilizando una fase polar
estacionaria [creta en una columna de vidrio; ver la figura A] con una fase móvil mucho menos
polar [no polar]. Este modo clásico de cromatografía se conoce como fase normal.
La figura S-1 representa una separación cromatográfica en fase normal de nuestra mezcla de
prueba de tres colorantes. La fase estacionaria es polar y retiene el colorante amarillo polar con
mayor fuerza. El colorante azul, relativamente no polar, es ganado en la competencia de retención
por la fase móvil, un eluyente no polar, y eluye rápidamente. Dado que el colorante azul se parece
más a la fase móvil [ambas son no polares], se mueve más rápido. Para la cromatografía en fase
normal sobre sílice es habitual que la fase móvil sea 100 % orgánica; no se utiliza agua.
8. HPLC de fase reversa
El término fase reversa describe el modo de cromatografía que es justo lo contrario de la fase
normal, es decir, el uso de una fase móvil polar y una fase estacionaria [hidrofóbica] no polar. La
figura S-2 ilustra la separación de la mezcla de tres colorantes negros utilizando dicho protocolo.
Ahora, el compuesto más fuertemente retenido es el colorante azul más no polar, ya que su
atracción hacia la fase estacionaria no polar es mayor. El colorante amarillo polar, que se retiene
débilmente, es ganado en competencia por la fase móvil acuosa polar, se mueve más rápido a
través del lecho y eluye antes lo semejante atrae a lo semejante.
En la actualidad, debido a que es más reproducible y tiene una amplia aplicabilidad, la
cromatografía de fase reversa se utiliza para aproximadamente el 75 % de todos los métodos de
HPLC. La mayoría de estos protocolos utilizan como fase móvil una mezcla acuosa de agua con
un eluyente orgánico polar miscible, como acetonitrilo o metanol. Esto normalmente asegura la
interacción adecuada de los analitos con la superficie de las partículas hidrofóbicas no polares. La
sílice unida con C18 [a veces llamada ODS] es el tipo más utilizado de relleno para HPLC de fase
reversa.
9. Separaciones basadas en el tamaño: Cromatografía por exclusión de tamaño [SEC] -
Cromatografía por permeación de gel [GPC]
En 1950, Porath y Flodin descubrieron que las biomoléculas podían separarse en función de su
tamaño, en lugar de su carga o polaridad, haciéndolas pasar o filtrándolas a través de un polímero
de dextrano hidrofílico de porosidad controlada. Este proceso se denominó filtración en gel.
Posteriormente, se utilizó un esquema análogo para separar oligómeros y polímeros sintéticos
utilizando rellenos de polímeros orgánicos con intervalos de tamaño de poro específicos. Este
proceso se denominó cromatografía por permeación de gel [GPC]. Las separaciones similares
realizadas con rellenos de sílice de porosidad controlada se denominaron cromatografía por
exclusión de tamaño [SEC]. Introducidos en 1963, los primeros instrumentos comerciales de
HPLC se diseñaron para aplicaciones de GPC.
Todas estas técnicas se realizan normalmente en fases estacionarias que se han sintetizado con
una distribución del tamaño de poro en un intervalo que permite que los analitos de interés entren
o se excluyan de más o menos volumen de poro del relleno. Las moléculas más pequeñas
penetran más poros al pasar a través del lecho. Las moléculas más grandes solo pueden penetrar
poros por encima de un cierto tamaño, por lo que pasan menos tiempo en el lecho. Las moléculas
más grandes pueden quedar totalmente excluidas de los poros y pasar solo entre las partículas,
eluyendo muy rápidamente en un volumen pequeño. Las fases móviles se eligen por dos motivos:
en primer lugar, son buenos eluyentes para los analitos; y, en segundo lugar, pueden evitar
cualquier interacción [basada en la polaridad o la carga] entre los analitos y la superficie de la fase
estacionaria. De esta manera, las moléculas más grandes eluyen primero, mientras que las
moléculas más pequeñas viajan más lentamente [porque entran y salen de más poros] y eluyen
más tarde, en orden decreciente de tamaño en la solución. De ahí la sencilla regla: los grandes
salen primero.
Dado que es posible correlacionar el peso molecular de un polímero con su tamaño en solución, la
GPC revolucionó la medición de la distribución del peso molecular de los polímeros que, a su vez,
determina las características físicas que pueden mejorar o restar valor al procesamiento, la calidad
y el rendimiento de los polímeros