Universidad Tecnológica del Valle de Toluca

T.S.U Química Área Tecnología Ambiental

Integradora: Actino Bacterias

QTA-32 Equipo 3

Profesor: Dr. Jonathan Ricardo Rosas Ramírez

Integrantes:
• De Jesús Ramos Mariana
• González Ramírez Mariam
• Madero Bata Edith
• Mireles Rosas Samira
• Rodríguez Pérez Angélica Raquel
• Torres Mercado Emmanuel Isaí
Introducción
Actino bacterias

Las actinobacterias, también conocidas como actinomicetos debido a su

morfología característica, son bacterias Gram positivas. Estas bacterias se
encuentran distribuidas en una variedad de hábitats, principalmente en el suelo,
en el mar y en los sedimentos de lagos y ríos. Dentro de sus principales funciones
en la naturaleza, estos microrganismos participan en el reciclaje de la materia
orgánica, desintegrando aquellos compuestos resistentes que las bacterias
comunes y los hongos filamentosos no pueden descomponer, de esta forma se
encuentran participando activamente en la mineralización del material orgánico
o formación de humus. Otra de sus funciones fundamentales, consiste en regular
la composición de las comunidades microbianas del suelo a través de
mecanismos basados en el antagonismo microbiano, máxime por antibiosis. Las
actinobacterias son grandes productoras de compuestos bioactivos, como los
antibióticos y otros compuestos que se emplean con distintas aplicaciones en las
industrias farmacéutica, alimentaria y ambiental. (Kim,J. [Link] 2009).

Aunque son unicelulares como las bacterias, no tienen una pared celular distinta,
pero producen un micelio que no tiene tabiques y es más delgado. Las
actinobacterias incluyen algunas de las más comunes del suelo, de agua dulce
y marinas, y desempeñan un papel importante en la descomposición de
materiales orgánicos, como la celulosa y la quitina, por lo que desempeñan un
papel vital en la renovación de la materia orgánica y el ciclo del carbono,
reponiendo el suministro de nutrientes en el suelo, y es una parte importante de
la formación del humus. Las colonias de actinobacterias muestran una
consistencia pulverulenta y se adhieren firmemente a la superficie del agar,
produciendo hifas y hongos similares a conidios/esporangios en los
medios de cultivo. (Anandan et al., 2016)
Morfología Colonial
A lo largo del planeta existen una gran variedad de microorganismos todos ellos
poseen características que los hacen únicos; sin embargo, muchos de ellos
poseen ciertas similitudes constantes entre sí por ello una forma muy común de
clasificar a todos estos microorganismos es a través de su Morfología colonial.

La Morfología para colonial hace referencia todas aquellas características

descriptivas usadas en microbiología para caracterizar a los MOOS. (Morfología
colonial, s.f)

Hay que tener cuenta que muchos tipos de bacterias en un medio agarizado
pueden ser fácilmente distinguibles por las características de sus agregados
celulares en forma de colonias. (Morfología colonial, s.f).

Algunos de los parámetros usados son los siguientes:

Algunos de los parámetros usados se muestran en la imagen 1.1

Figura 1.1 Morfología bacteriana

Tinción de Gram
La tinción de Gram es una técnica que nos permite diferenciar entre 2 tipos de
bacterias Gram Positivas y Gram negativas mediante la aplicación de una serie
de colorantes los cuales se adhieren a la pared celular de las bacterias.
(Sauceda D, s.f)

La técnica comienza tomando una muestra bacteriológica la cual se coloca en

un portaobjetos y se seca, acto seguido se aplica Cristal Violeta sobre la muestra
y después Lugol, para fijar el C.V.

Una vez hecho lo anterior se realiza un lavado con agua destilada y se procede
a colocar Alcohol cetona para retirar exceso de C.V, después se aplica Safranina.

Por ultimo se realiza un ultimo lavado y se procede a observar en microscopio.

(Sauceda D, s.f)

Lugar de muestreo

El sitio donde se obtuvieron las muestras se encuentra en la Universidad

Tecnológica del Valle de Toluca (UTVT) ubicada en Carretera del Departamento
del D.F, km 7.5, Ejido de Santa María Atarasquillo, Lerma, Estado de México.

De acuerdo con el Instituto Nacional de Estadística y Geografía (INEGI), la zona

donde se ubica UTVT presenta el tipo de suelo dado como: Vp+Ph/3,
predominantemente Phaeozem (PH). Este es pardo grisáceo, en seco; arcilloso;
estructura migajosa, fina; moderadamente desarrollada, moderadamente friable
en húmedo; escasas raíces,finas;reacción muy fuerte; límite neto y plano.
Se tomó una muestra de suelo de aproximadamente 5 gramos a una
profundidad de 5 cm del suelo y esta muestra se colocó dentro de una caja Petri
estéril para su posterior análisis.

Objetivos

Observar y cuantificar el número de colonias presentes en c/u de los

medios de cultivo e identificar las principales características morfológicas
en colonias de actinobacterias a través de los parámetros indicados para
su caracterización.
Llevar a cabo el proceso de tinción de Gram usando una colonia
bacteriana de cada una de las cajas de Petri .
Aislar una colonia bacteriana de las muestras de suelo en medio Ashby
para hacer un cultivo nuevo de actino bacterias más puro para
posteriormente aplicar en esta tinción de Gram
Materiales y métodos

El material usado para esta práctica se encuentra en la siguiente tabla:

E.P.P Material Reactivos Equipo de

Laboratorio
Guantes de Nitrilo Papel estraza Colorante C.V Autoclave
Mascarilla facial Masking Tape Colorante Lugol Balanza Analítica
Bata de Mechero Fisher Colorante alcohol Parrilla de
laboratorio Gazas cetona calentamiento
Gafas de Algodón Colorante Microscopio
seguridad Hilo Safranina óptico
Pipetas Agua destilada Contador digital
milimétricas de 1 Aceite inmersión de colonias
y 10 mL Alcohol etílico Incubadora
Matraces Medio Ashby
Erlenmeyer de Medio Agar
250 mL Nutritivo
Tubos de ensayo
de 10 mL
Cajas de Petri
Gradilla
Piseta con agua
destilada
Porta objetos
Espátula
Papel encerdo
Bolsas Ziploc
Tollas de papel
absorbente

Metodología

• Se limpio y desinfecto el área de trabajo; con alcohol y se coloco papel de

estraza para cubrir la mesa del laboratorio dónde se trabajó.
• Se reunieron los materiales, para su esterilización (Papel estraza, cinta
masKing, algodón, plumón, material volumétrico)
• Se lavo y seco el material volumétrico
• Se hicieron tapones para las pipetas y los matraces (para confirmar que
son adecuados debían emitir un sonido al retirarse).
• En caso de las cajas Petri se lavaron y se secaron colocándolas con la
tapa abajo (para evitar que se contamine en la autoclave).
• Posterior a ello se pesaron los reactivos para la preparación de los medios
para la siembra, los cuales fueron: Agar nutritivo
• - Agar – agar o Agar bacteriológico
• - Caldo nutritivo
Ingredientes para aislamiento de actino bacterias (Medio Ashby):
• - CaCl2
• - Glucosa
• - NaCl
• - KH2PO4
• - MgSO4
• - FeSO4
• En un plato caliente se colocaron dos matraces con 250 ml de agua
destilada más el reactivo uno de Agar -agar y el otro de medio Ashby, se
le colocó una mosca para que se mezclara y tuviera una consistencia
homogénea, tenían que llegar a ebullición, para que su tonalidad fuera
cristalina.
• Se envolvieron todos los materiales con papel estraza y se asegurarlos
con masking.
• Una vez listos, se metieron en la autoclave durante 15 min
aproximadamente (después de que llegó a la temperatura y presión
adecuada, controlando que no suba o bajé).
• Después de transcurrido el tiempo se detuvo la autoclave, se dejo reposar,
y cuando bajó la presión, se abrió (teniendo las medidas adecuadas para
sacar el material ya que seguía con una temperatura elevada).

• Ya estando esterilizados los materiales y después de adecuar nuestra

mesa de trabajo se colocaron los materiales volumétricos esterilizados,
los matraces con los medios para sembrar cultivos y las cajas Petri para
depositar el cultivo.

• Se colocó un mechero Fisher el cual se encendió para seguir esterilizando

el ambiente.

• En seguida se colocó el medio de cultivo en las cajas Petri para que

cuajará la mezcla y se pudiera empezar a sembrar.

• Mientras se dejaba enfriar el Medio se preparó la muestra que se

analizaría, en este caso fue muestra de suelo (de la UTVT) y agua residual
(del río Jilguero).

• La cuál para la muestra de suelo se hicieron disoluciones x10-3, x10-5 y

la última fue x10-

• Y en el casó de la muestra de agua residual no hubo disoluciones se utilizó

la muestra concentrada.
• Una vez estuvo frío el medio de Agar- agar, se sembró la muestra de agua
residual por método masivo y por estría.

• Y en el casó del medio Ashby como es para muestra líquida se sembró

las disoluciones de suelo .

• Después que se terminó de sembrar se llevaron a la incubadora las cajas

previamente ya acomodadas y en una bolsa sellada para que los medios
no se deshidrataran y crecieran adecuadamente.

• Se dejaron en la incubadora durante una semana para que después de

ese lapso de tiempo observáramos que creció en las cajas.

• Ya con el tiempo transcurrido fuimos nuevamente al laboratorio para

observar los cultivos.

• Se limpio y desinfecto el área de trabajo; con alcohol y se colocó papel de

estraza para cubrir la mesa del laboratorio.

• Se encendió un mechero Fisher para esterilizar el ambiente dónde se

trabajó.
• Sacamos de la incubadora las cajas Petri con el medio de cultivo ya con
desarrollo bacteriano y las colocamos en el área estéril.
• Posterior a ello después de adecuar las cajas en el área estéril y sin
alejarlas del mechero, se abrieron cuidadosamente, para que
observáramos su morfología colonial y esto anotando lo en una bitácora.
• Describimos la morfología de cada colonia desarrollada del medio de
cultivo y anotamos en una libreta cada una de sus características.
• Con ayuda de un asa bacteriológica estéril tocamos las colonas para
revisar su consistencia.
• Colocamos una pequeña muestra en un porta objetos para su
observación.
• Para esto utilizamos un método de tinción, para determinar si las muestras
eran gran positivo o gran negativo.
• Colocamos una pequeña muestra en un porta objetos, lo sellamos con el
mechero. Esto con cada una de las muestras (agua y suelo).
• Agregamos cristal violeta hasta saturar la muestra, de esto esperamos 1
minuto y enjuagamos con agua destilada, e igual esperamos 1 min.
• Posteriormente agregamos Lugol (todo) hasta cubrir la muestra y
esperamos 1 min, enjuagamos con agua destilada y esperamos 1 min.
• Agregamos alcohol hasta saturar la muestra, esperamos 1 min, por último,
agregamos safranina, la dejamos por 1 min y enjuagamos con agua
destilada.
• Posteriormente observáramos las muestras preparadas en un
microscopio y agregamos aceite de inmersión, para qué las pudiéramos
apreciar.
• Después a esto tuvimos que decidir en qué bacteria Resembramos, para
la siguiente practica y hacer de nuevo el proceso, pero ya de colonias en
específico.
• Por Último, después de Resembrar, guardamos adecuadamente las cajas
Petri con el cultivo en la incubadora, y regresaríamos después de una
semana para observar si hubo algún crecimiento.
• Se limpio y desinfecto el área de trabajo; con alcohol y se colocó papel de
estraza para cubrir la mesa del laboratorio.
• Se encendió un mechero Fisher para esterilizar el ambiente.
• Se sacaron de la incubadora las muestras que se Resembraron
• Las cajas se colocaron adecuadamente en la mesa con el mechero y se
tomaron cuidadosamente para abrirlas y observar que creció en ellas.
• Además de observar se describió su morfología de estás y se anotó en
una bitácora.
• Tomamos una pequeña muestra de las colonias que resembramos con
un asa bacteriológica.
• Después la sellamos con el mechero y posterior a eso la llevamos al
puente de tinción.
• Agregamos a la muestra cristal violeta hasta saturarla, esperamos 1 min,
enjuagamos con agua destilada y esperamos 1 min.
• Repetimos el proceso con Lugol (yodo), esperemos 1 min, enjuagamos y
esperamos 1 min. En seguida pusimos alcohol lo dejamos 1 min.
• Agregamos safranina, la dejamos durante 1 min y la enjuagamos con
agua destilada.
• Esperamos a que se secara para llevarla al microscopio.
• Ya con la muestra en el microscopio tratamos de apreciar los
microorganismos, pero como no vimos nada agregamos aceite de
inmersión.
• Enfocamos en el microscopio con el objetivo de 100x y se visualizó la
muestra.
• Después de enfocar en el microscopio se apreció qué en la muestra había
ACTINOBACTERIAS gran positivo.
• Con el contador de colonias, se contabilizamos cuantas se encontraban
en nuestro cultivo y se hicieron las anotaciones respectivas en nuestra
BITÁCORA.
Resultados y Análisis de resultados

Haciendo uso de la morfología colonial, se observó

que las colonias bacterianas, a pesar de que están
en el mismo cultivó pueden ser y crecer con
características distintas que se pueden apreciar o
identificar visualmente, [como se mencionan en las
tablas 1, 2, 3 y 4 las cuales exponen las cualidades
que pueden presentar, tales como: tamaño, forma,
Figura 3.0. Pequeña muestra de
borde, transparencia, etc.]. bacterias de aire de la resiembra ya
con tinción de Gram y expuesta en
el Microscopio con aceite de
inmersión.

Posterior a realizar la tinción de Gram, se

Figura 4.0. Siembra de actinobacterias
aprecian los colores característicos observada a travez del equipo “Contador de
involucrados a la misma (purpura, rosado y/o colonias”.

rojizo), los cuales visualizamos a través de un

microscopio (Figura 3.0). Distinguiendo en las
Gram (-) tonos rojizos y en las Gram (+) tonos
purpuras.

Por otra parte, haciendo uso del contador de

colonias, fue posible registrar el número total de
colonias aisladas, reconociendo en estas,
algunas de las características expuestas en las
tablas de morfología colonial.

Resultados:

Como se indicó anteriormente hubo crecimiento bacteriano, este se

desarrolló en las cajas Petri con medio Ashby, los resultados fueron
caracterizados dentro de la siguiente tabla:

Medio Ashby (Diluciones)

Características 10-1 10-3 10-5

Tamaño. Muy pequeñas. Muy pequeñas. Muy pequeñas.

Color. Blanco. Blanco. Verde,

transparente.

Forma. Irregular. Puntiforme. Puntiforme.

Figura 2.1. Metodología de la practica 6

 Borde. No distinguible. Filamentoso. Rizado.

Elevación. Efusa. Efusa. Plana.

Superficie. Rugosa. Radial. Radial.
Aspecto. Seco. Húmedo. Húmedo.
Luz reflejada. Mate. Brillante. Brillante.
Luz transmitida. Opaca. Opaca. Opaca.

Producción de No. No. No.

pigmento.
No. De colonias 07 15 19
contadas
Cálculo de (7) (x10-1) =70 (15) (1X10-3) =12,000 19/1X10-5=1.9X106
Unidades 70 UFC 12,000 UFC 1X10-6 UFC
formadoras de
colonias (UFC)

Tabla 1 Características del crecimiento bacteriano en Medio Ashby.

En la siguiente tabla se encuentran las características de las muestras tomadas

en aire:

Agar nutritivo.
Característica. Aire 1. Aire 2. Siembra masiva. Siembra estría.

Tamaño. Pequeñas. Pequeñas. Muy pequeñas. Muy pequeñas.

Color. Amarillo, negro, Amarillo, café, Beige. Blanco, beige, café,

blanco. blanco. rosa.

Forma. Irregular, Rizoide, Irregular. Irregular, Circular.

puntiforme. puntiforme.
Borde. Filamentoso, Filamentoso, Entero. Entera, rizada,
ondulado. rizado, crenado. crenado.

Elevación. Umbonada. Efusa. Efusa. Efusa.

Superficie. Ondulada. Ondulada. Ondulada. Ondulada.
Aspecto. Húmedo. Húmedo. Seco. Seco.
Luz reflejada. Brillante. Mate. Mate Mate.
Luz transmitida. Opaca. Opaca. Opaca. Opaca.

Producción de Amarillo, beige. Beige, verde. Beige. Café, beige,

pigmento. naranja.
Tabla 2 Características de colonias (muestra de aire)

Terminado el proceso anterior se realizó una resiembra de una colonia

bacteriana en específico en medio Ashby (disolución 1x10-5) y la muestra de Aire
1 y 2, la descripción Morfológica se encuentra en la siguiente tabla:

Tabla 3 Características de los medios resembrados

Medios resembrados.
Característica. Agar nutritivo. Ashby. Ashby.
Aire 1. Aire 2.
Tamaño. Pequeñas. Muy pequeñas. Muy pequeñas.
Color. Blanco, beige. Amarillo, blanco, verde. Blanco.

Forma. Puntiforme, Puntiforme. Irregular.

filamentoso, irregular.
Borde. Ondulado. Rizado. Rizado.

Elevación. Rizada. Efusa. Efusa.

Superficie. concéntrica, radial. Radial, ondulada. Concéntrica.
Aspecto. Seco. Seco. Húmedo.
Luz reflejada. Mate. Mate. Mate.
Luz Opaca. Opaca. Opaca.
transmitida.
Producción de Amarillo, beige. Blanco, verde. Blanco.
pigmento.

Se obtuvo el crecimiento de las actino-bacterias en un medio de cultivo

resembrado de agar nutritivo con una muestra de suelo en dilución de 1x10 -5.
Además de que fue posible contabilizar un total de 66 colonias en la resiembra.

Estos datos nos dan como resultado un total de 6,600,000 Unidades

Medio Muestra Presencia De No. Total, de colonias.

empleado. resembrada. Actino-bacterias.
Agar nutritivo. Suelo 1x10-5. Si. 0066.

Medio Ashby. Aire 1. No. 0081.

Medio Ashby Aire 2. No. 0072.

Formadoras de Colonias.

UFC= No. Colonias / F. Dilución. UFC= 66 / 1x10-5 =

6,600,000 UFC.
Discuciones

Discusión

El medio Ashby es un medio adecuado para el crecimiento de actinobacterias,

que son un grupo de bacterias Gram-positivas . Este medio contiene una fuente
de nitrógeno orgánico en forma de caseína, que proporciona los aminoácidos
necesarios para el crecimiento de estas bacterias. Además, el medio Ashby
también contiene glucosa, fosfatos y sales minerales que proporcionan los
nutrientes adicionales necesarios para el crecimiento de las actinobacterias.

Al realizar el proceso de Tincion de Gram, las bacterias que fueron escogidas

para este proceso, al terminarlo se tiñeron de color morado, siendo estas
Gram-positivas, al visualizarlas en el microscopio se lograron ver cocos.

La morfologia de las colonias depende del medio empleado para su siembra

(agar nutritivo, medio Ashby) y tambien pueden variar dependiendo del tipo de
muestra que se siembra (agua, suelo o aire).

Conclusión

Podemos afirmar que el lugar de muestreo posee gran cantidad de actino

bacterias pues en los cultivos hubo un crecimiento abundante.

En esta práctica se caracterizaron las colonias de las muestras sembradas en

los cultivos de las cajas Petri, a cada una de las colonias se le determino con la
morfología correspondiente con ayuda de la información dada.

Se presentaron ciertas variaciones morfológicas, entre estas se encontraron que

eran puntiformes, planas, rizadas, filamentosas, irregulares, etc.

En esta práctica se tuvo una alteración debido a la contaminación involuntaria de

un medio de cultivo por lo cual podemos concluir que es de gran relevancia
seguir paso a paso la metodología establecida para poder obtener el resultado
esperado debido a que por un error por parte del personal puede afectar en gran
manera el resultado esperado.

Se pudo comprobar que antes de realizar cualquier cultivo microbiano o procesos

similares es de suma importancia esterilizar todo el material pues esto nos ayuda
a evitar contaminación por microorganismos.

Fue posible comprobar por medio de la resiembra de cultivos y Tinción de Gram

que en el suelo hay presencia de actino bacterias siendo estas del tipo Gram
positivo (+), además de que fue posible comprobar por medio de los
procedimientos anteriores que en el aire predomina la presencia de bacterias
Gram negativa (-).

Podemos concluir que la morfología de las colonias bacterianas depende en gran

medida del medio en el cual fueron tomadas (agua, suelo, aire) y en el cual fueron
sembradas.

Bibliografías

[Link]

[Link]

[Link]
49992021000100133

[Link]

[Link]

[Link]

Anandan, R., Dharumadurai, D., & Manogaran, G. P. (2016). An introduction to

actinobacteria. In Actinobacteria-basics and biotechnological applications.
IntechOpen.