DETECTORES

No hay detectores para cromatografía de líquidos tan universalmente aplicables como los
detectores de ionización por llama y de conductividad térmica para cromatografía de gases
que se describieron en la sección 27B.4. Los detectores de cromatografía de gases fueron
específicamente perfeccionados para medir pequeñas concentraciones de analitos en flujos
de gas. Por otro lado, los detectores de cromatografía de líquidos han sido instrumentos
analíticos tradicionales adaptados con celdas de flujo para medir concentraciones bajas de
solutos en flujos de líquidos. El problema principal en el mejoramiento de la cromatografía
de líquidos es la adaptación y perfeccionamiento de dichos dispositivos.4
Características del detector ideal El detector ideal para cromatografía de líquidos debería
poseer todas las características que se mencionan en la sección 27B.4 respecto a los
detectores de cromatografía de gases, con excepción de que un detector de cromatografía de
líquidos no requiere ser sensible en un intervalo tan grande de temperaturas. Además, un
detector de HPLC debe tener un volumen interno mínimo con el fin de reducir el
ensanchamiento de banda (sección 28B.2) y ser compatible con el flujo de líquidos.
Tipos de detectores Los detectores para cromatografía de líquidos son de dos tipos
básicos. Los detectores basados en una propiedad de la solución son sensibles a una
propiedad de la fase móvil, como el índice de refracción, la constante dieléctrica o la
densidad, la cual es modulada por la presencia de solutos. En cambio, los detectores
basados en una propiedad del soluto responden a alguna de las propiedades de este último,
como la absorbancia en el UV, fluorescencia o corriente de difusión, que no son inherentes
a la fase móvil. En la tabla 28.1 se mencionan los detectores de uso más común en
cromatografía de líquidos de alta resolución y algunas de sus propiedades más importantes.
Los detectores más ampliamente usados se apoyan en la absorción de radiación UV o
visible (véase la figura 28.8). Los detectores de fluorescencia, índice de refracción y
electroquímicos también son muy utilizados. Los detectores de espectrometría de masas
tienen gran aceptación en la actualidad. Sistemas como los de cromatografía de líquidos-
espectrometría de masas representan una gran ayuda para identificar los analitos que salen
de una columna HPLC como se estudia más adelante en esta sección
Detectores de absorción UV-visible La figura 28.8 muestra el esquema de una celda de
flujo en forma de Z para las mediciones de absorción de los efluentes de una columna
cromatográfica. A fin de minimizar el ensanchamiento de banda extracolumna, el volumen
de dichas celdas tiene que ser el menor posible. Los volúmenes de la celda representativa
son de 1 a 10 μL y las longitudes de trayectoria de la celda son de 2 a 10 mm.
27.B.4
En algunos casos los cromatógrafos de gases se acoplan a instrumentos espectroscópicos
como los de infrarrojo. En este caso, el dispositivo espectrométrico sirve no sólo para
detectar la aparición de los analitos, sino también para identificarlos. Muchos detectores de
absorción son dispositivos de doble haz, en los que uno de ellos atraviesa la celda del
eluyente y el otro es de referencia. Para comparar las intensidades de los dos haces se
utilizan detectores fotoeléctricos contrastados.
Detectores de absorción con capacidad de barrido. La mayoría de los fabricantes de
instrumentos para cromatografía de líquidos de alta resolución ofrecen detectores que
consisten en un espectrofotómetro de barrido con una red entre sus componentes ópticos.
Algunos se limitan a la radiación ultravioleta y otros abarcan la radiación ultravioleta y la
visible. Se pueden elegir varios modos de operación. Por ejemplo, se puede obtener el
cromatograma completo a una sola longitud de onda o también, cuando los picos del
eluyente están suficientemente separados en el tiempo, se puede elegir distinta longitud de
onda para cada pico. En este caso debe emplearse el control por computadora para
seleccionar la mejor longitud de onda para cada eluyente. Cuando se desean los espectros
completos con fines de identificación, se puede detener el flujo del eluyente durante un
tiempo suficiente que permita el barrido de longitudes de onda de la región de interés. Los
detectores espectrofotométricos de ultravioleta más potentes son los instrumentos de
arreglos de diodos, como se señala en la sección 7E.3 y en la figura 13.25.5 Varios
fabricantes ofrecen este tipo de instrumentos, los cuales permiten recoger los datos de un
espectro completo en aproximadamente un segundo. Por consiguiente, los datos espectrales
de cada pico cromatográfico se pueden recoger y almacenar a medida que aparecen al final
de la columna. Una de las formas de presentación de los datos espectrales, que resulta útil
para la identificación de las especies y para elegir las condiciones de la determinación
cuantitativa, consiste en un gráfico tridimensional tal como el que se muestra en la figura
28.9. En este caso los espectros se obtuvieron a intervalos sucesivos de cinco segundos. Es
evidente la aparición y desaparición de cada uno de los tres esteroides en el eluyente.
Detectores de absorción en el infrarrojo. Se ofrecen comercialmente dos tipos de
detectores en el infrarrojo. El primero es un instrumento con filtro similar en cuanto a
diseño al que se muestra en la figura 16.13. El segundo, mucho más complejo, es un tipo
que se basa en los instrumentos de transformada de Fourier y es similar a los descritos en la
sección 16B.1. Varios fabricantes de instrumentos IR con transformada de Fourier ofrecen
accesorios que permiten usarlos como detectores en HPLC. Las celdas de los detectores del
infrarrojo son semejantes a las de radiación ultravioleta, excepto que las ventanas se
construyen con cloruro de sodio o fluoruro de calcio. Las longitudes de la trayectoria de la
celda oscilan de 0.2 a 1.0 mm y los volúmenes de 1.5 a 10 μL.
La principal limitación del uso de los detectores de infrarrojo radica en la baja transparencia
de muchos de los solventes que se utilizan. Por ejemplo, las anchas bandas de absorción del
infrarrojo del agua y de los alcoholes impiden prácticamente el uso de este detector en
muchas aplicaciones. Asimismo, el uso de fases móviles acuosas ocasiona un deterioro
rápido de los maTeriales de la celda a menos que se utilicen ventanas especiales. Los
deficientes límites de detección de muchos solutos han limitado el uso de los detectores IR.
La introducción de los detectores espectrométricos de masas para cromatografía de
líquidos, que se tratan más adelante, ha ocasionado una declinación espectacular en las
aplicaciones de la detección IR.
Detectores de fluorescencia Los detectores de fluorescencia para HPLC son semejantes en
diseño a los fluorómetros y espectrofluorómetros descritos en la sección 15B.2. En la
mayoría de ellos, la fluorescencia se detecta por medio de un transductor fotoeléctrico
colocado a 90 respecto al haz de excitación. Los detectores más sencillos utilizan una
fuente de excitación de mercurio y uno o más filtros para aislar una banda de la radiación
emitida. Los instrumentos más complejos consisten en una fuente de xenón y emplean un
monocromador de red para aislar la radiación fluorescente. La fluorescencia inducida por
rayo láser también se utiliza debido a su sensibilidad y selectividad. Como se subrayó en el
capítulo 15, una ventaja inherente de los métodos de fluorescencia es su alta sensibilidad,
que resulta ser mayor por más de un orden de magnitud que la de la mayoría de los
procedimientos de absorción. En cromatografía de líquidos se ha aprovechado esta ventaja
para la separación y determinación de los componentes fluorescentes de las muestras. Tal
como se analiza en la sección 15C.2, los compuestos fluorescentes suelen estar
relacionados con el análisis de materiales de interés farmacéutico, productos naturales,
muestras clínicas y productos del petróleo. Muchas veces, la cantidad de especies
fluorescentes aumenta si se tratan antes las muestras con reactivos que originan derivados
fluorescentes. Por ejemplo, el cloruro de dansilo (cloruro de 5-dimetilaminonaftaleno-1-
sulfonilo), que reacciona con las aminas primarias y secundarias, aminoácidos y fenoles
para dar compuestos fluorescentes, se utiliza ampliamente para detectar aminoácidos en
hidrolizados de proteínas.
Detectores de índice de refracción En la figura 28.10 se muestra el esquema de un
detector diferencial de índice de refracción, en el que el solvente, en su camino hacia la
columna, pasa a través de una mitad de la celda y el eluyente de la columna pasa por la otra
mitad. Los dos compartimentos están separados por una placa de vidrio montada a un
ángulo tal que se produce una desviación del haz incidente si las dos soluciones tienen
distintos índices de refracción. El desplazamiento resultante del haz respecto a la superficie
fotosensible de un detector causa una variación en la señal de salida, la cual, una vez
amplificada y registrada, proporciona el cromatograma. La ventaja de los detectores de
índice de refracción es que responden a casi todos los solutos. Es decir, son detectores
universales análogos a los detectores de llama o de conductividad térmica en cromatografía
de gases. Además, son confiables y no dependen de la tasa de flujo. Sin embargo, son muy
sensibles a los cambios de temperatura y tienen que estar a temperatura constante hasta
unas pocas milésimas de grado centígrado. Por otra parte, no son tan sensibles como la
mayoría de los otros detectores y son incompatibles con los métodos de elución con
gradiente. Este tipo de detector se usa para determinar algunos analitos como los azúcares.
Detector de la dispersión de la luz tras evaporación
Se trata de uno de los tipos más recientes de detectores para HPLC. En este detector, el
efluente de la columna pasa a un nebulizador donde se transforma en una fina niebla
mediante un flujo de nitrógeno o aire. Las finas gotitas se conducen por un tubo a
temperatura controlada donde tiene lugar la evaporación de la fase móvil, lo que origina
unas finas partículas de ana-lito. La nube de partículas de analito pasa a través de un haz
láser. La radiación dispersada se detecta en dirección perpendicular al flujo mediante un
fotodiodo de silicio. Una de las principales ventajas de este tipos de detector es que su
respuesta es casi igual para todos los solutos no volátiles. Además, es notablemente más
sensible que el detector de índice de refracción, ya que se han establecido límites de
detección de 0.2 ng/μL. La desventaja es que las composiciones de la fase móvil están
limitadas sólo a componentes volátiles.
Detectores electroquímicos
En la actualidad los fabricantes de instrumentos ofrecen detectores electroquímicos de
varios tipos.6 Estos dispositivos se basan en la amperometría, la voltametría, la
coulombimetría y la conductimetría. Los tres primeros métodos se estudian en los capítulos
24 y 25. Aunque los procedimientos electroanalíticos no se han explotado todavía tanto
como los detectores ópticos, en muchos casos parecen ofrecer las ventajas de una elevada
sensibilidad, sencillez, conveniencia y una extensa aplicabilidad. Esta última propiedad se
ilustra en la figura 28.11, en la que se muestran los intervalos de potencial en los que puede
tener lugar la oxidación o reducción de 16 grupos funcionales orgánicos. En principio, las
especies que contienen alguno de esos grupos podrían detectarse mediante procedimientos
amperométricos, voltamétricos o coulombimétricos. Sin embargo, la principal limitación de
los detectores electroquímicos es que no son compatibles con la elución con gradiente. En
las publicaciones especializadas se ha descrito una gran variedad de celdas para la
detección electroquímica en HPLC y varias ya están comercializadas. En la figura 28.12 se
ilustra un ejemplo de una celda de flujo del tipo de capa fina para la detección
amperométrica (véase también la figura 25.17). En este caso, la superficie del electrodo
forma parte de la pared de un canal formado al insertar una junta de Teflón de 50 μm entre
dos bloques moldeados de plástico de Kel-F. El electrodo indicador es de platino, oro,
carbón vítreo o pasta de carbono. El electrodo de referencia y, a menudo, el contraelectrodo
se colocan corriente abajo del bloque en el que se encuentra el electrodo indicador. El
volumen de la celda es de 1 a 5 μL. Una modificación útil de esta celda, disponible ya
comercialmente, contiene dos electrodos de trabajo que pueden operar en serie o en
paralelo.7La primera configuración, en la que el eluyente fluye primero por un electrodo y
luego por el segundo, requiere que el analito experimente una oxidación (o una reducción)
reversible en el electrodo que está corriente arriba. A continuación, el segundo electrodo
actúa como cátodo (o como ánodo) para determinar el producto de la oxidación (o de la
reducción). Esta configuración aumenta la selectividad del sistema de detección. Una
aplicación interesante de este sistema es la detección y determinación de los componentes
en mezclas que contienen tanto tioles como disulfuros.
Detectores espectrométricos de masas
La combinación de la cromatografía de líquidos con la espectrometría de masas parecería
ser una fusión ideal de separación y detección.8Como en la cromatografía de gases, un
espectrómetro de masas puede ser de gran ayuda en la identificación de especies a medida
que salen de la columna cromatográfica. Sin embargo, existen problemas mayores en el
acoplamiento de las dos técnicas. En el caso de la espectrometría de masas se requiere una
muestra en fase gaseosa, y la salida de la columna de cromatografía de líquidos es un soluto
disuelto en un solvente. Como primer paso, el solvente se tiene que convertir en vapor.
Cuando está vaporizado, el solvente de cromatografía de líquidos produce un volumen de
gas que es de 10 a 1000 veces mayor que el gas portador en cromatografía de gases. Por
consiguiente, la mayor parte del solvente se tiene que eliminar. Se han desarrollado varios
dispositivos para resolver los problemas del retiro del solvente y de la interferencia de la
columna de cromatografía de líquidos. En la actualidad, los procedimientos más comunes
se apoyan en la técnica de ionización a presión atmosférica. En la figura 28.13 se ilustra un
diagrama de bloques de un sistema típico de cromatografía de líquidos-espectrometría de
masas. El sistema de cromatografía de líquidos de alta resolución es a menudo un sistema
capilar a nanoescala con tasas de flujo del orden de μL/min. Por otro lado, algunas
interfases permiten tasas de flu jo de hasta 1 a 2 mL/min, lo cual es característico de las
condiciones ordinarias de la cromatografía de líquidos de alta resolución. Las fuentes de
ionización más comunes son la ionización por electroaspersión y la ionización química a
presión atmosférica (véase sección 20B). La combinación de cromatografía de líquidos de
alta resolución y la espectrometría de masas ocasiona una alta selectividad porque los picos
no resueltos se pueden aislar al supervisar sólo una masa seleccionada. La técnica de LC-
MS tiene la capacidad de proporcionar huellas dactilares de un producto particular
sometido a elución en lugar de confiar en el tiempo de retención como sucede en la HPLC
ordinaria. La combinación también proporciona masa molecular, información estructural y
análisis cuantitativo exacto.9 En el caso de algunas mezclas complejas, la combinación de
cromatografía de líquidos y espectrometría de masas no proporciona resolución suficiente.
En años recientes se volvió posible acoplar dos o más analizadores de masas para formar
espectrómetros de masas en tándem (véase sección 20C.5). Cuando se combinan con
cromatografía de líquidos, los sistemas de espectrometría de masas en tándem reciben el
nombre de instrumento de cromatografía de líquidos-espectrometría de masas-
espectrometría de masas. Por lo general, los espectrómetros de masas en tándem son
sistemas cuadrupolares triples o espectrómetros cuadrupolares de trampa de iones. Con el
fin de lograr una resolución superior a la que se consigue con un cuadrupolo, el analizador
de masas final, en un sistema de espectrometría de masas en tándem, puede ser un
espectrómetro de masas de tiempo de vuelo. Los espectrómetros de masas de sectores
también se pueden combinar para obtener sistemas en tándem. Los espectrómetros de
masas de resonancia iónica de ciclotrón y de trampa de iones pueden trabajar de tal manera
que proporcionen no sólo dos etapas de análisis de masa, sino n etapas. Dichos sistemas de
MSn (véase sección 20C.5) proporcionan de manera sucesiva las etapas de análisis dentro
de un analizador de masas sencillo. Éstos se han combinado con sistemas de cromatografía
de líquidos en instrumentos de LC-MSn . Los sistemas de LC-MS ya son invariablemente
computarizados. Mediante estos instrumentos se pueden obtener tanto cromatogramas de
tiempo real como los reconstruidos mediante computadora y los espectros de los picos
eluidos.
Características del detector ideal
El detector ideal para cromatografía de gases tiene las siguientes características:
1. Sensibilidad adecuada. Justo lo que constituye una adecuada sensibilidad no puede
evaluarse de forma cuantitativa. Por ejemplo, las sensibilidades de los detectores que se
describen en esta sección difieren por un factor de 107 . Aunque todos se utilizan
extensamente y son satisfactorios en ciertos casos, los menos sensibles no son adecuados
para algunas aplicaciones. En general, las sensibilidades de los detectores actuales se
encuentran en el intervalo de 108 a 1015 g de soluto/s.
2. Buena estabilidad y reproductibilidad.
3. Respuesta lineal para los solutos que se extienda a varios órdenes de magnitud. 4.
Intervalo de temperaturas desde la temperatura ambiente hasta al menos 400 C.
5. Tiempo de respuesta corto independiente de la tasa de flujo.
6. Alta confiabilidad y manejo sencillo. El detector debería estar a prueba de la impericia
de operadores inexpertos, si es posible.
7. Respuesta semejante para todos los solutos o, por el contrario, una respuesta selectiva y
altamente predecible para uno o más tipos de solutos.
8. No debe destruir la muestra. Por desgracia, no hay un detector que reúna todas estas
características. Algunos de los detectores más comunes son los que se mencionan en la
tabla 27.1. Enseguida se describen varios de los detectores más usados.
VENTAJAS Y DESVENTAJAS