PCR: sirve para aumentar el adn in vitro
-Detección y conformación de presencia de patógenos en alimentos, incluso los no cultivables
-Identificación de especies en productos de origen animal. Saber exactamente los
componentes de los alimentos.
-Determinar factores de virulencia
-Detección de alimentos genéticamente modificados
-Cuantificación (PCR en tiempo real)
Pasos:
1) Obtener la muestra: Siempre es muestra de ADN, lo vamos a sacar de distintas
matrices
2) Preparación de la mix de reacción: ACGT. Agrego MgCl2. Buffer que de ph apropiado
para que la ADN polimerasa funcione bien, puede estar incluido MgCl2. Adn molde
(MUESTRA) en concentraciones adecuadas
Por cada mix de reacción Control negativo: no se le agrega ADN molde. Porque la
adn polimerasa no tiene ningún adn para replicarse, si da positivo puede que algo esté
contaminado
Control positivo Siempre positivo. Muestra que contenga el fragmento de interés
3) Ciclado: Los tubos se ponen en un termociclador. 1) Desnaturalización: 94 grados-
30,60 segundos. 2) Anillado: se baja la temperatura 50-70 grados-30 seg 1 min.3)
Extensión
Esto sucede en ciclos (30-35 ciclos)
4) Electroforesis en gel agarosa: Ver que pasó en los tubos. Preparo un tubo de gel de
agarosa, caliento para que se disuelva y se vuelca. Una vez que tengo el gel lo pongo
en un aparto de electroforesis. Si tengo ADN va ir al polo posititvo, porque el adn
tiene carga negativa (por el grupo fosfato) Es importante el agregado de colorante,
siempre que haya doble hebra se intercalan, se pueden agregar a cada tubo individual
o al gel, nos permite visualizar adn en el gel. También se agrega buffer de corrida,
usamos uno que tiene un solo frente de corrida, esto se agrega por si me olvidé de
controlar veo si ya terminé la corrida. También incluir un marcador de peso molecular
(son bandas)
5) Visualización de resultados
Ejercicios
1) ¿En qué consiste la técnica llamada reacción en cadena de la polimerasa(PCR), que le valió al
bioquímico estadounidense Kary B. Mullis el Premio Nobel en 1993?
2) -Elegir el par de primer apropiado para amplificar el siguiente fragmento deADN por PCR
5’ - GACCTGTGG ........................................................... ATACGGGAT - 3’
3’ - CTGGACACC ........................................................... TATGCCCTA – 5
Primers
P: 5’ - GACCTGTGG - 3’ (abajo)
Q: 5’ - CCACAGGTC - 3’
R: 5’ - TAGGGCATA - 3’
S: 5’ - ATCCCGTAT – 3
A) P y R
B) P y S
C) Q y R
D) Q y S
3) Quiero preparar 1 mL de una mix de dNTPs (mezcla de dATP, dGTP, dCTPydTTP) con una
concentración de 2 mM de cada uno ¿Cuánto volumen de cada nucleótido agregaría? ¿Cómo
lo prepararía? Tenga en cuenta que se diluyen con agua
Vf= 1 ml= 1000 ul
Cf= 2 Mm
Ci=
C1. V1= C2.V2
Vinicial= 2Mm x 1000 ul/100 Mm
b)