Prueba de la Catalasa
La catalasa es una enzima que cataliza la descomposición del peróxido de hidrógeno
en agua y oxígeno.
La prueba se utiliza para comprobar la presencia de la enzima catalasa que se
encuentra en la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que
contienen el citocromo oxidasa.
La principal excepción son los estreptococos (Streptococcus).
Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes
géneros:
Streptococcus (catalasa -) de Micrococcus (catalasa +) y/o Staphylococcus (catalasa
+). Bacillus (+) de Clostridium (-).
Revelado
Observar la formación inmediata de una efervescencia rápida con desprendimiento de
burbujas (resultado positivo).
Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante. Si se invierte el orden del
método (extender la colonia sobre el agua oxigenada) pueden producirse falsos
positivos.
Prueba coagulasa
La coagulasa reacciona con la protrombina en la sangre. El complejo resultante se
llama estafilotrombina, y permite que la enzima proteasa convierta el fibrinógeno en,
por tanto, si la bacteria es capaz de coagular el plasma, significa que contiene la
enzima coagulasa. Esta prueba se utiliza para diferenciar entre Staphylococcus
aureus de los Staphylococcus coagulasa negativos
Resultado
Formación de un coagulo
Prueba del manitol
Sirve para detectar si los gérmenes son capaces de fermentar el manitol liberando
productos ácidos que serán detectados gracias al indicador rojo de fenol que cambiará
a color amarillo.
Para esta prueba el medio manitol movilidad incluye 7,5 g/l de D-Manita.
Bacterias manitol (-) son, dentro de las enterobacterias, Proteus mirabilis, Proteus
vulgaris y Shigella dysenteriae.
Entre las bacterias de importancia clínica, la prueba del manitol sirve para diferenciar
Staphylococcus aureus (+) de Staphylococcus epidermidis (-)
Resultados
Cambio de color de rojo a amarillo si es positivo
Prueba de bilis esculina
El medio bilis esculina contiene peptonas y extracto de carne, ambos compuestos
proporcionan las sustancias nutritivas necesarias para el crecimiento de los
microorganismos.
También contiene esculina; este compuesto es un glucósido formado por la unión de
un monosacárido simple (glucosa) con un compuesto denominado esculetina, unido
por un enlace glucosídico.
La prueba se basa en demostrar si la bacteria es capaz de hidrolizar a la esculina. Si
esto ocurre la esculina se descompone en esculetina y glucosa.
La esculetina reacciona con el hierro presente en el medio, formando un compuesto
marrón oscuro, casi negro.
El citrato férrico actúa como un revelador de la reacción.
Por su parte, la bilis es un inhibidor que impide el crecimiento de algunos
microorganismos, por tanto, la bacteria antes de desdoblar la esculina tiene que ser
capaz de crecer en presencia de la bilis. Por ello, este medio se considera selectivo.
Las bacterias que pueden desarrollarse en este ambiente son principalmente aquellas
que viven en el ambiente intestinal.
Finalmente, el agar da la consistencia sólida al medio y el agua es el disolvente de los
compuestos.
Reacción positiva: aparición de un color castaño oscuro, casi negro en el pico de
flauta (en caso de la prueba en tubo) o ennegrecimiento del agar alrededor de las
colonias (en caso de la prueba en placas).
Reacción negativa: no se produce ennegrecimiento del medio o existe la aparición
del color negro en menos de la mitad del tubo después de 72 horas de incubación. Por
otra parte, el crecimiento bacteriano en el medio sin la aparición del color negro debe
considerarse una prueba negativa.
Prueba PYR
La prueba de pirrolidonil arilamidasa (PYR) es una prueba rápida que se utiliza para
la identificación presuntiva de estreptococos y enterococos beta-hemolíticos del
grupo A basándose en la actividad de la enzima pirolidonil arilamidasa. La
pirrolidonil arilamidasa (PYR), es una enzima bacteriana que hidroliza ácido L-
piroglutámico-β-naftilamida impregnado en el disco de prueba que sirve como
sustrato para la detección de pirolidonil arilamidasa. La hidrólisis del sustrato produce
beta-naftilamina que se combina con el reactivo PYR (p-dimetilamino-
cinamaldehído) para formar un color rosa brillante a rojo cereza. La prueba se puede
realizar mediante el método de ensayo en caldo o el método rápido de disco de papel.
Prueba positiva: color rojo brillante en 1 minuto
Prueba negativa: Sin cambio de color ni desarrollo de un color naranja o amarillo.
PRUEBA DE TSI
El agar TSI contiene tres azúcares: dextrosa, lactosa y sacarosa; rojo de fenol para
detectar la fermentación de estos carbohidratos, y sulfato ferroso para detectar la
producción de ácido sulfhídrico.
La degradación o fermentación del azúcar con formación de ácido se manifiesta por
un cambio de color del indicador Rojo de fenol que vira de anaranjado-rojizo a
amarillo, o por un viraje a rojo intenso en caso de alcalinización.
El tiosulfato es reducido por algunos gérmenes a ácido sulfhídrico, el cual reacciona
con la sal férrica produciendo sulfuro de hierro de color negro.
Interpretación:
• A) Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo es no
fermentador de azúcares.
• B) Anaranjado/anaranjado (control, sin inocular).
• C) Pico alcalino/fondo ácido (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismo
solamente fermenta la glucosa.
• D) Pico ácido/fondo ácido (pico amarillo/fondo amarillo): el microorganismo
fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa.
• E) El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce ácido
sulfhídrico (H2S).
• D) La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el
microorganismo produce gas.
PRUEBA CITRATO
Esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como
única fuente de carbono y compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno
en su metabolismo, provocando una alcalinización del medio. Entre las
enterobacterias estas características se dan en los siguientes géneros: Enterobacter,
Klebsiella, Serratia, Citrobacter y algunas especies de Salmonella. Sin embargo,
Escherichia, Shigella, Salmonella typhi y Salmonella paratyphi son incapaces de
crecer con esos nutrientes. Se cultiva el microorganismo en agar citrato de Simmons.
Este medio contiene citrato de sodio y fosfato de amonio como fuentes de carbono y
de nitrógeno respectivamente, y azul de bromotimol, como indicador de pH. Sólo las
bacterias capaces de metabolizar el citrato podrán multiplicarse en este medio y
liberarán iones amonio lo que, junto con la eliminación del citrato (ácido), generará
una fuerte alcalinización del medio que será aparente por un cambio de color del
indicador de pH, de verde a azul.
Revelado
Las bacterias capaces de usar el citrato provocarán el cambio de color del medio de
verde a azul intenso, por viraje del indicador de pH, azul de bromotimol, a la vez que
se observa crecimiento en la superficie.
FUNDAMENTO DE LIA
El medio LIA contiene lisina un aminoacido que puede ser ocupado por la enzima
lisina descarboxilasa presente en algunos microorganismos
La descarboxilación de la lisina da origen a un producto básico que es la cadaverina
que aumenta el ph del medio
Resultados
• Positivo viraje color purpura en todo el tubo
• Negativo: se observa acidificación con viraje a amarillo en la columna del tubo
Otros microorganismos contienen la enzima de lisina desaminasa que desamina la
lisina formando ácido acetocarbonico que produce cambio de color rojizo en el
tendido
• Positiva presencia de color rojo granate en la superficie inclinada
• Negativo ausencia de color rojo granate
También se observa la capacidad d ellos microrganismos de producir h2s a partir de
tiosulfato de sodio evidenciándose por el oscurecimiento del medio
• Positivo el medio produce una cloracion muy negra
• Negativo sin color
Fundamento de MIO
Peptona, extracto de levadura y tripteína
Estos elementos contribuyen al poder nutritivo de este medio. Sirven como fuente de
nutrientes y aminoácidos esenciales para el desarrollo bacteriano.
Además, la tripteína es una fuente de triptófano para evidenciar la presencia de la
enzima triptofanasa, que degrada el triptófano por una desaminación reductiva
liberando indol, ácido pirúvico, amoníaco y energía.
El indol es incoloro, por tanto su presencia se revela al agregar cinco gotas del
reactivo de Ehrlich o de Kovacs, ambos con p-dimetilaminobenzaldehído.
El grupo aldehído de este compuesto reacciona con el indol, generando un producto
de color rojo fucsia en forma de anillo en la superficie del agar.
Cualquier vestigio de color se debe considerar como una prueba positiva. La prueba
debe leerse inmediatamente, pues pasado el tiempo el color se degrada.
Por otra parte, esta prueba debe revelarse después de haber anotado los resultados de
la motilidad y la descarboxilación de la ornitina.
Interpretación
Prueba positiva: formación de un anillo de color rojo fucsia al agregar las gotas del
reactivo de Kovacs.
Prueba negativa: no hay formación de anillo.
Motilidad
La capacidad de la bacteria de moverse se evidenciará si se observa un medio turbio o
si hay una línea gruesa de crecimiento que se expande alrededor de la inoculación
inicial.
Una prueba de motilidad negativa se evidenciará al observar una línea delgada de
crecimiento, y todo alrededor estará sin crecimiento.
Es importante que la motilidad se lea antes de revelar el indol, ya que el agregado del
reactivo enturbia todo el medio.
En bacterias móviles, pero de lento crecimiento es difícil demostrar su motilidad con
este medio. En este caso se recomienda usar otras pruebas o métodos, como el medio
motilidad o del método gota pendiente.
Resultado positivo: presencia de turbidez o crecimiento mas allá de la línea de
siembra.
Resultado negativo: crecimiento solamente en la línea de siembra.
L-Ornitina
En caso de que la bacteria produzca la enzima ornitina descarboxilasa, esta podrá
actuar una vez que el medio haya sido acidificado por la fermentación de la glucosa.
La enzima ornitina descarboxilasa actúa sobre el grupo carboxilo del aminoácido
produciendo una amina llamada putresina que alcaliniza nuevamente el medio.
Esta prueba debe leerse después de 24 horas de incubación, pues si se intenta leer
antes se puede malinterpretar la prueba con un falso negativo.
Hay que recordar que la primera reacción que ocurre es la fermentación de la glucosa,
por lo que el medio se torna de color amarillo en una fase inicial (primeras 10 a 12
horas). Si posteriormente ocurre la descarboxilación de la ornitina, el medio virará a
morado.
Es importante interpretar la prueba de la descarboxilación de la ornitina antes de
revelar el indol, ya que el agregado del reactivo de Kovacs modifica el color del
medio.
Interpretación
Prueba negativa: medio de color amarillo o con fondo amarillo.
Prueba positiva: medio completamente morado.
PRUEBA INDOL
El indol es uno de los productos de degradación del aminoácido triptófano. La presencia de
la enzima triptofanasa en la bacteria provoca la hidrólisis del aminoácido y su
desaminación, produciendo indol, ácido pirúvico y amoníaco.
Resultado positivo: color rojo.
Resultado negativo: el color del reactiPvo revelador permanece incoloro-amarillento
Fundamento de urea
Determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando una molécula
de dióxido de carbono y dos moléculas de amoniaco por acción de la enzima ureasa.
Esta actividad enzimática es característica de todas las especies de Proteus y se usa
sobre todo para diferenciar este género de otras enterobacterias que dan negativo o
positivo retardado.
Se cultiva el microorganismo en slant en agar urea de Christensen.
Este medio se complementa después del autoclavado con 50 ml/l de urea. Ésta será
degradada por aquellos microorganismos capaces de producir la enzima ureasa.
Resultado
Esta degradación produce amoniaco que hará variar el color del indicador de amarillo
a rojo, poniéndose así de manifiesto la actividad ureasa.
Fundamento de oxidasa
Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La reacción de la
oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromo oxidasa.
Los citocromos son enzimas que forman parte de la cadena de transporte de
electrones en la respiración aeróbica, transfiriendo electrones al oxígeno, con la
formación de agua.
Por lo general, el sistema citocromo oxidasa sólo se encuentra en los organismos
aerobios, algunos anaerobios facultativos y, excepcionalmente, en algún
microaerófilo, pero los anaerobios estrictos carecen de actividad oxidasa.
Asimismo, la presencia de oxidasa va ligada a la producción de catalasa, ya que ésta
degrada el peróxido de hidrógeno que se produce como consecuencia de la reducción
del oxígeno y cuya acumulación es tóxica.
La prueba de la oxidasa se usa sobre todo para:
Identificar todas las especies de Neisseria (+), y diferenciar Pseudomonas de los
miembros oxidasa negativos de las enterobacterias.
El reactivo de la oxidasa más recomendado es la solución acuosa al 1% de
diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina (reactivo de Kovacs).
Es menos tóxico y mucho más sensible que el correspondiente compuesto dimetilo
(reactivo de Gordon y McLeod), pero es más caro.
Este reactivo tiñe las colonias oxidasa positivas de color lavanda que vira
gradualmente a púrpura-negruzco intenso.
Revelado
Cambio de color a púrpura y negro en 10-20 segundos, como consecuencia de que el
reactivo se oxida en presencia del citocromo oxidasa formándose azul de Wuster.
En caso negativo no hay cambio de color.