el tubo que contiene la muestra y los reactivos necesarios
para copiar una secuencia de ADN se deposita en el
termociclador esto lo hacemos para amplificar el ADN con la
técnica de PCR, El termociclador se encarga de repetir un
ciclo de temperaturas por un determinado periodo de tiempo ,
al finalizar la reacción en cadena de la polimerasa obtenemos
en un tubo múltiples copia de una única secuencia de ADN
Ahora sí se procede a realizar todos los pasos necesarios para
la electroforesis en gel de agarosa y así comprobar lo que es
el resultado de la PCR
El baffer (tampón) de carga nos ayuda a cargar y visualizar
las muestras en el gel
Se hace la preparación del soporte donde se va a llevar a cabo
la electroforesis , para esto se rellena la cubeta con baffer tris
acético , el baffer en este caso proporciona las condiciones
óptimas de Ph Para el proceso . Además de esto , este baffer
contiene EDTA para evitar que el ADN sea degradado por
nucleasas
Después de añadir el baffer ahora sí se procede a colocar el
gel de agarosa en la cubeta , antes dd colocaf dichas
muestras de debe lavar los posillos del gel con más baffer tris
acético
Cómo hacemos para interpretar los resultados ¿ Para esto se
coloca en el primer pocillo un marcador de peso molecular en
el resto de posillos se cargan las muestras
El glicerol que está presente en el tampón o baffer de carga
aporta densidades a las muestras, de esta manera sera más
fácil cargar las muestras en el fondo de los posillos o en los
pocillos
Cubrimos el soporte con la tapa y le conectamos la corriente
eléctrica para que así empiece la electroforesis
En este caso como el ADN tiene carga negativa , estas
moléculas migran desde el polo negativo hacia el polo
positivo
Gracias al colorante del baffer podemos visualizar el frente de
las muestras su recorrido y de esta manera sabemos cuándo
detener la corriente hasta que las moléculas migran al polo
opuesto
Ya después sacamos el gel y lo llevamos hacia la lámpara de
luz ultra violeta , al preparar el gel de le agrego bromuro de
etidio una sustancia que se intercala entre las bases del ADN ,
gracias a ello al ver el gel con luz ultra violeta podemos
observar la altura a la que han corrido las bandas de ADN
Para poder estimar el tamaño de los fragmentos de ADN
comparamos la migración de las bandas de la muestra con la
migración de las bandas del marcador de peso molecular cuyo
tamaño se conoce
La velocidad de migración de las moléculas de ADN en el gel
es inversamente proporcional s su tamaño
Ya para terminar se coloca el gel en un foto documentador ,
en este además de tener un tras iluminador se encuentrs una
camara para fotografíar el gel
El voltaje típico para correr un gel de agarosa debe ser en un
intervalo de 80-120 voltios si es mayor a este intervalo se
puede dañar el gel o derretir por el tiempo en que trabaje y si
es muy lento los fragmentos correran más lento esto es
conveniente cuando vas a comer y dejas que el proceso se de
sin estar pendiente.
Al agregar bromuro de etidio en el gel de agarosa este de
intercala con las bases o bandas de ADN permitiendo así
visualizar o comparar con el marcador de peso molecular.
Pb ( pares bases ) con esta medida se puede medir el tamaño
de cada banda en comparación con el marcador de peso
molecular que tiene una banda de tamaño estándar con
fragmentos de ADN ya conocidos
Los fragmentos que estén más cerca a los pozos o pocillos son
de tamaño más grande y por ende tienen más pares bases
que los fragmentos que están más alejados de los pozos o
más cerca de los polos positivos
Gracias al marcador de peso molecular se puede comparar el
tamaño de los fragmentos y saber los pares bases de cada
banda de las muestras de ADN evaluadas , entonces la
especialidad de todo esto es separar las moléculas según su
tamaño en cada fragmento
Que es el gel de agarosa ¿
La agarosa es un polímero natural, polisacárido formado por
galactosas alfa y beta que se extrae de las algas de los
géneros Gellidium y Gracillaria. ºC y forma fibras helicoidales
súperenrolladas con radio entre 20-30 nm dependiendo de su
concentración. El gel de agarosa Es una matriz que se
mantiene unida por puentes de hidrógeno , forman pequeños
poros que actúan como malla
Los fragmentos más cortos migran de manera más rápida
hacia los polos y se verán reflejados en la parte inferior del
gel, de esta manera y observando la intensidad de las franjas
se puede estudiar el tamaño de las moléculas evaluadas y la
cantidad de cada una de ellas , las cargas de las moléculas se
ven afectada por el campo eléctrico .
La muestra que se desea estudiar se coloca en los pocillos ,
en uno de los pozos debemos colocar un marcador de peso
molecular es un estándar de referencia que contiene
fragmentos de ADN con longitudes conocidas
Luego de esto conectamos los electrodos y comienza a fluir la
corriente a través del gel , si las muestras son de cargas
negativas como las del ADN estas empiezan a migrar hacia el
polo positivo, cuando el sistema está encendido se dice que el
gel esta corriendo, el voltaje usado por lo regular es de 80 a
120 voltios, un voltaje más alto ara que corra mas rapido,
pero se corre el riesgo de quemar el gel , por ende se debe
tener sumo cuidado, asi los fragmentos más pequeños viajan
más rápido y por ende llegarán más lejos que los fragmentos
grandes
Cómo funciona la electroforesis paso a paso
La electroforesis es una técnica de laboratorio que permite separar
moléculas en función de su tamaño y carga eléctrica. Se basa en el
movimiento de estas moléculas a través de un medio poroso, como
un gel o una matriz, bajo la influencia de un campo eléctrico
Separa los fragmentos de ADN únicamente por su tamaño
1) Preparación de la muestra: La muestra que se desea analizar se
mezcla con un colorante y se carga en un pocillo del gel.
2) Aplicación del campo eléctrico: Se aplica un campo eléctrico a
través del gel. Las moléculas cargadas de la muestra
comienzan a moverse hacia el electrodo de carga opuesta.
3) Separación de las moléculas: Las moléculas más pequeñas se
mueven más rápido a través del gel que las moléculas más
grandes. Esto se debe a que las moléculas más pequeñas
tienen una menor resistencia al movimiento debido a la fricción
con el gel.
4) Detección de las moléculas: Una vez que las moléculas se han
separado, se pueden detectar utilizando diferentes métodos,
como tinción con colorantes fluorescentes o radioisótopos.
Los factores que afectan la separación de las moléculas en
electroforesis son:
Tamaño de la molécula: Las moléculas más pequeñas se mueven
más rápido que las moléculas más grandes.
Carga de la molécula: Las moléculas con mayor carga se mueven
más rápido que las moléculas con menor carga.
Tipo de gel o matriz: La porosidad del gel o la matriz afecta la
velocidad de movimiento de las moléculas.
Fuerza del campo eléctrico: La fuerza del campo eléctrico también
afecta la velocidad de movimiento de las moléculas.
Propiedades de la molécula:
Carga: La carga neta de la molécula determina la fuerza con la que es
atraída hacia el electrodo de carga opuesta. Las moléculas con mayor
carga neta migrarán más rápido que las que tienen menor carga.
Tamaño: El tamaño de la molécula también influye en su velocidad de
migración. Las moléculas más pequeñas migran más rápido a través
de los poros del gel que las moléculas más grandes.
Forma: La forma de la molécula también puede afectar su movilidad.
Las moléculas con formas más compactas migran más rápido que las
que tienen formas más alargadas o irregulares.
Interacciones moleculares: Las moléculas pueden interactuar entre sí
o con el gel, lo que puede afectar su movilidad. Por ejemplo, las
proteínas pueden unirse a otras proteínas o al gel, lo que puede
ralentizar su migración.
Propiedades del gel y el sistema de electroforesis:
Tipo de gel: La composición y la porosidad del gel determinan el
tamaño de los poros a través de los cuales deben migrar las
moléculas. Los geles con poros más pequeños separan mejor las
moléculas pequeñas, mientras que los geles con poros más grandes
separan mejor las moléculas grandes.
Concentración del gel: La concentración del gel también afecta la
separación de las moléculas. Los geles más concentrados tienen
poros más pequeños y separan mejor las moléculas pequeñas,
mientras que los geles menos concentrados tienen poros más
grandes y separan mejor las moléculas grandes.
Fuerza del campo eléctrico: La fuerza del campo eléctrico aplicado
determina la velocidad a la que las moléculas migran a través del gel.
Una fuerza de campo más fuerte hará que las moléculas migren más
rápido, pero también puede hacer que las bandas se difuminen.
Composición del tampón: La composición del tampón de
electroforesis afecta la carga neta de las moléculas y la conductividad
del gel. La elección del tampón adecuado es importante para una
separación óptima de las moléculas.
Temperatura: La temperatura también puede afectar la separación de
las moléculas. Una temperatura más alta puede aumentar la
movilidad de las moléculas, pero también puede hacer que las bandas
se difuminen.
ELEMENTOS DE LOS EQUIPOS
Los equipos para electroforesis se componen de varios elementos
esenciales que trabajan en conjunto para separar moléculas cargadas
en función de su tamaño y carga. A continuación, se describe un
desglose de los componentes principales:
1. Fuente de alimentación:
Proporciona la corriente eléctrica necesaria para generar el campo
eléctrico que impulsa la migración de las moléculas a través del gel.
Puede ser de voltaje constante o de corriente constante, dependiendo
del tipo de electroforesis que se realice.
2. Recipiente o cuba:
Contiene el gel y la solución tampón durante la electroforesis.
Está hecho de material transparente, como vidrio o plástico, para
permitir la observación de las bandas separadas.
Cuenta con electrodos a cada extremo para aplicar el campo
eléctrico.
3. Peine:
Se utiliza para crear pozos en el gel donde se cargan las muestras.
Los pozos aseguran que las muestras se inicien en una línea recta
uniforme, lo que mejora la resolución de la separación.
4. Gel de electroforesis:
Actúa como matriz porosa que permite la separación de las moléculas
en función de su tamaño y carga.
Está compuesto por un polímero, como agarosa o acrilamida, que
forma una red tridimensional de poros.
El tamaño de los poros del gel determina qué moléculas pueden
separarse efectivamente.
5. Muestras:
Se cargan en los pozos del gel y contienen las moléculas que se
desea separar.
Las muestras se mezclan con un colorante de carga, que les confiere
una carga negativa uniforme.
6. Sistema de detección:
Permite visualizar las bandas separadas de moléculas en el gel.
Existen diferentes métodos de detección, como tinción con azul de
bromuro o tinción con plata, fluorescencia o radioisótopos.
7. Fuente de luz:
Se utiliza para iluminar el gel cuando se utilizan métodos de
detección basados en tinción o fluorescencia.
El tipo de fuente de luz depende del método de detección específico.
8. Cámara digital o escáner:
Se utiliza para capturar una imagen del gel para su análisis posterior.
La imagen digitalizada se puede cuantificar para determinar el
tamaño y la cantidad de cada banda separada.
Componentes adicionales:
Sistema de refrigeración: Algunos equipos de electroforesis incluyen
un sistema de refrigeración para controlar la temperatura durante la
separación. Esto es importante para algunos tipos de geles que
pueden deformarse o degradarse a temperaturas elevadas.
Software de análisis de imágenes: El software de análisis de imágenes
se puede utilizar para cuantificar las bandas separadas en un gel
digitalizado. Esto puede proporcionar información sobre el tamaño y
la cantidad de cada molécula presente en la muestra original.
Tipos de equipos de electroforesis:
Existen diferentes tipos de equipos de electroforesis, cada uno con
sus propias características y aplicaciones. Los dos tipos más comunes
son:
Electroforesis en gel: La electroforesis en gel es la técnica más
utilizada para separar moléculas de ADN, ARN y proteínas.
Electroforesis capilar: La electroforesis capilar se utiliza para separar
moléculas de pequeño tamaño, como oligonucleótidos y péptidos.
Electroforesis con biotecnología verde