“Año del Bicentenario de la consolidación de nuestra independencia, y de la
conmemoración de las heroicas batallas de Junín y Ayacucho”
UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTÍN DE AREQUIPA FACULTAD
DE INGENIERÍA DE PROCESOS
CURSO: MICROBIOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS HORARIO: LUNES 10:40
- 12:20
PRÁCTICA Nª 1
PRESENTADO POR:
PALOMINO ROJAS SHIRLEY JOSELIN
FLOR DE MARIA YUCA CHAVEZ
GRUPO: “B” AÑO: 2ª
AREQUIPA - PERÚ
PRÁCTICA Nº2 MÉTODO DE REDUCCIÓN DEL AZUL DE METILENO
(LECHE)
I. OBJETIVOS
● Brindar conocimientos sobre las metodologías del control de calidad en leche
entera (fresca).
● Determinar el tiempo de reducción del azul de metileno “TRAM” en leche
fresca. Comprender los fundamentos de la medida del tiempo de reducción del
azul de metileno o prueba de la reductasa bacteriana en una muestra de leche.
● Aplicar el procedimiento experimental de la prueba de la reductasa bacteriana
en el laboratorio.
● Interpretar los resultados obtenidos y relacionarlos con la presencia de
microorganismos y la calidad higiénica de la leche.
II. MARCO TEÓRICO
La calidad de la leche comercial y de sus derivados elaborados en una industria láctea,
depende directamente de la calidad del producto original o materia prima, proveniente
de las zonas de producción y de las condiciones de transporte, conservación y
manipulación en general hasta la planta (García E., 2014). La medida en que se ha
introducido materia extraña en la leche también se refleja en cierto grado por su
contenido bacteriano. La flora bacteriana de cada muestra de leche es muy compleja,
ya que se introducen muchos tipos de organismos de diversas fuentes (Hasting E,
2009). Los microorganismos indicadores pueden emplearse para reflejar la calidad
microbiológica de los alimentos en relación con el almacenamiento del producto o su
seguridad. El uso de recuentos de coliformes como indicador de inocuidad ha sido una
herramienta común en la protección de la salud pública durante muchos años. Los
coliformes son un grupo de bacterias que se encuentran comúnmente en el medio
ambiente, incluidos el suelo, las aguas superficiales, la vegetación y las vías
intestinales de los animales de sangre caliente. Los coliformes típicos incluyen el
género Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Hafnia, Klebsiella y Serratia. Algunos
coliformes, como Escherichia coli, generalmente se consideran indicadores en el caso
del agua y productos lácteos. La detección de coliformes se utiliza como un indicador
general de las condiciones sanitarias en los entornos de producción y procesamiento
de lácteos, por lo tanto, su propagación en la industria alimentaria es un tema
importante. Recuentos elevados de coliformes en la leche y los productos lácteos
sugieren que existen condiciones insalubres durante la producción, el procesamiento o
el envasado (Yuan-Geuy, 2009). La mayoría de los gérmenes de la leche cuando se
multiplican elaboran enzimas reductasas que modifican el potencial de óxido-
reducción de la misma. Para demostrar este fenómeno basta añadir a la leche una
sustancia que se decolore al pasar de la forma oxidada a la forma reducida. La rapidez
con que cambia de color está en función de la población bacteriana y, por ello, puede
ser un índice del grado de contaminación de la leche. El colorante más empleado en la
industria láctea para realizar esta prueba es el azul de metileno (García E.,2014). Por
lo tanto, el tiempo de reducción se toma como una medida de la cantidad de
organismos en la leche, aunque realmente es una medida de las reacciones
metabólicas totales que tienen lugar en la superficie celular de la bacteria. El azul de
metileno es de color azul en estado oxidado y se convierte en incoloro en estado
reducido debido a la actividad metabólica de las bacterias (Yuan-Geuy, 2009).
III. MATERIALES Y EQUIPOS
● Baño María termorregulado o estufa a 37°C
● Pipetas graduadas (estériles) de 1 y 10 mL
● Tubos de ensayo tapa rosca (estériles)
● Gradillas de acero inoxidable Cronómetro
● Solución de azul de metileno al 1% en metanol.
● Leche entera (fresca) Vortex
IMAGENES:
IV. PROCEDIMIENTO
- Colocar 10 mL. de muestra a 3 tubos estériles (Tubos A,B y C) con tapa rosca
- Colocar a dos tubos (Tubos A y B) 1 mL. de azul de metileno y al tercero (Tubo C)
1 mL. de agua destilada estéril.
- Mezclar el contenido de los tubos mediante rotación, hasta obtener perfecta
distribución del colorante y la leche
- Colocar un tubo con azul de metileno (Tubo A) y al que contiene agua destilada
(Tubo C) a agua hirviente (baño maría) por 3 minutos Mezclar invirtiendo los tubos 2
veces.
- Colocar los tres tubos a baño maría 37ºC +-1ºC.
- Invertir cada media hora a los tubos que no muestren reducción (decoloración).
Evitar una prolongada exposición de los tubos a la luz solar. El tiempo de reducción
es inversamente proporcional al contenido bacteriano de la muestra, contado desde el
inicio de la reducción
- Contar el tiempo de reducción (decoloración) y observar su color frecuentemente
durante la primera media hora, sin agitarlos. Una muestra se considera reducida
cuando presenta 4/5 decolorada.
- Si la muestra se decolora durante un periodo de incubación de 30 minutos, registrar
el resultado “tiempo de reducción 30 minutos”. Seguidamente pueden observarse el
color de los tubos e intervalos de 1 hora, pero se registran los resultados en horas
enteras: así por ejemplo: si a las 2½ horas se observa la decoloración, el resultado se
registra “tiempo de reducción den 2 horas”.
TABLA DE CALIFICACIÓN DE LA LECHE CRUDA
La evaluación microbiológica está en función a la decoloración
LECHE Tiempo de Microorganismos Tiempo de
decoloración comercialización
muy mala menos de 20’ > 20’000,000 10 – 15 h.
mala 2 h. ó menos 4’000,000 15-20 h.
buena 2 h. – 5 ½ 500,000 -400,000 20 -32 h.
muy buena >5½ - 500,000 más 32 h
V. ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
La presencia de microorganismos en la leche y por su acción reductora, se produce
una modificación del color del azul de metileno, pasando de color azul intenso a azul
claro, pudiendo desaparecer totalmente de acuerdo a la carga microbiana presente.
Una leche con un contenido bajo en microorganismos, no modifica el tinte azul del
colorante o tarda mucho tiempo en modificarlo. Se pueden calcular aproximadamente
los resultados de la prueba del azul de metileno
Compara los resultados obtenidos en laboratorio según: Norma Nacional y Norma
Internacional.
- En el experimento se observo el tiempo en el que cambio de color el cual fue de
4h 30min
- Lo que nos indica con la tabla de clasificación una leche de buena calidad con
500,000 -400,000microorganismosVI
Imagen :
VI. CONCLUSIONES Elabore sus conclusiones de acuerdo a la interpretación de sus
resultados.
- Se observo que el tiempo de duración de cambio de color de la leche fue de 4h con
30m (tiempo en el cual se demostrar en cambiar la decoloración)
- la utilización del TRAM, tiempo de reducción de azul de metileno, es un método
practico de los tantos existentes y que nos facilita para analizar la calidad
microbiologica de nuestra leche
- mediante nuestra practica realizada para lograr una coloración, el colo del metileno
demoro 4h 30m en cambiar del color azul al blanco, lo cual esto nos da a conocer que
nuestro leche analizada esta dentro del rango permitido y lo cual ES APTO para el
consumo humano
VII. RECOMENDACIONES Emita recomendaciones en base a los resultados
obtenidos
-Se recomienda no mojar el costado de la parte inferior de los tubos de ensayo al
llenarlos con la leche.
- Evitar el contacto de la punta de la pipeta de azul de metileno con la muestra.
- En el momento de incubarlos en baño maría el nivel del agua del baño debe
sobrepasar al nivel de la leche del tubo, también se deberá mantener la
temperatura lo más homogénea posible y evite la exposición de los tubos con el
sol.
- La mezcla final realizada se recomienda vaciarla al desagüe.
- Cada manipulación en la leche ya sea en el ordeño, transporte,
almacenamiento, o en otro, debe guardar la correcta higiene tanto del animal, medio
ambiente y del personal que interactúa directamente con la leche. Así mismo los
equipos y utensilios que se usarán deberán estar bien limpios y desinfectados.
-Acatar con las normas de higiene en los procesamientos de la leche también,
al igual mantener en buen estado e higiene de las maquinarias aplicables y realizar una
manipulación adecuada.
-Tomar las medidas de la calidad higiénica de la leche para lograr un producto
inocuo y seguro para el consumo humano
VIII.- CUESTIONARIO
1. Describa y especifique los requisitos comerciales de la leche, y su relación que
tienen respecto a las adulteraciones.
Composición química: La leche debe cumplir con estándares específicos de grasa,
proteínas, lactosa y otros componentes, dependiendo del tipo de leche. Esto asegura su
calidad nutricional.
Calidad microbiológica: La leche debe estar libre de microorganismos dañinos como
Salmonella y E. coli, así como mantener recuentos bacterianos dentro de límites
aceptables para garantizar la seguridad alimentaria.
Pureza: No se deben agregar aditivos o contaminantes prohibidos, como pesticidas o
residuos de medicamentos veterinarios, que puedan afectar la salud del consumidor.
Proceso de producción: Se establecen requisitos para garantizar prácticas de higiene y
sanidad durante la producción y procesamiento de la leche, asegurando su calidad desde
la granja hasta el consumidor final.
Etiquetado: El etiquetado debe proporcionar información precisa sobre el contenido,
origen y fecha de vencimiento de la leche, así como cualquier otro detalle relevante para
el consumidor, permitiendo una elección informada.
Las adulteraciones de la leche ocurren cuando se manipula fraudulentamente para cambiar su
composición o calidad, a menudo con el objetivo de obtener ganancias económicas ilícitas.
Esto puede incluir dilución con agua, adición de suero u otros productos para aumentar el
volumen, o incluso la inclusión de sustancias nocivas. Para prevenir esto, se requiere la
implementación de controles de calidad estrictos en todas las etapas de producción y
distribución, junto con sanciones severas para aquellos que infrinjan las regulaciones. La
educación del consumidor sobre cómo identificar la leche de calidad y la implementación de
sistemas de trazabilidad también son fundamentales para garantizar la integridad del producto
en el mercado.
2. Describa las principales fuentes de contaminación de la leche, y que tipos de
microorganismos son incorporados por dichas fuentes.
Las fuentes de contaminación de la leche abarcan varios ámbitos, cada uno con su conjunto
característico de microorganismos involucrados:
Contaminación ambiental:
● Microorganismos asociados: Bacterias como Escherichia coli, Salmonella,
Listeria monocytogenes y Campylobacter, presentes en el entorno como suelo,
agua y aire, pueden contaminar la leche.
Contaminación de equipos y superficies:
● Microorganismos asociados: Bacterias como Staphylococcus aureus,
Pseudomonas spp. y Lactobacillus pueden contaminar los equipos y las
superficies de las instalaciones lácteas si no se limpian y desinfectan
adecuadamente.
Contaminación por manos y personal:
● Microorganismos asociados: Las bacterias y virus presentes en las manos y la
piel del personal, como Staphylococcus aureus, Escherichia coli y norovirus,
pueden contaminar la leche si no se siguen prácticas adecuadas de higiene.
Contaminación de materias primas:
● Microorganismos asociados: La leche cruda puede contaminarse con bacterias
patógenas como Escherichia coli, Salmonella y Listeria monocytogenes si
proviene de animales enfermos o de instalaciones poco higiénicas.
Contaminación cruzada durante el transporte y almacenamiento:
● Microorganismos asociados: Durante el transporte y almacenamiento, la leche
puede entrar en contacto con superficies o materias primas contaminadas,
facilitando la propagación de bacterias como Listeria monocytogenes,
Salmonella y Campylobacter.
Es esencial implementar medidas preventivas en todas las etapas de producción y
procesamiento de la leche para reducir la contaminación microbiológica y garantizar su
seguridad alimentaria. Esto incluye prácticas de higiene adecuadas, limpieza y desinfección
efectivas, monitoreo de calidad y control de temperatura durante el almacenamiento y
transporte. Además, la capacitación del personal en prácticas de higiene y seguridad
alimentaria es clave para prevenir la contaminación de la leche.
3. ¿Qué microorganismos de la flora bacteriana de la leche cruda son
termorresistentes?
Los microorganismos termorresistentes son aquellos capaces de resistir altas temperaturas,
como las utilizadas en los procesos de pasteurización estándar. Dentro de la flora bacteriana
de la leche cruda, se encuentran algunos microorganismos termorresistentes comunes:
Bacillus spp.: Algunas especies de Bacillus tienen la capacidad de formar esporas que
resisten el calor, permitiéndoles sobrevivir a las temperaturas de pasteurización.
Clostridium spp.: Algunas especies de Clostridium, como Clostridium botulinum,
producen esporas capaces de sobrevivir a la pasteurización, aunque son más resistentes al
calor extremo utilizado en la esterilización.
Micrococcus spp.: Algunas cepas de Micrococcus, aunque no todas, pueden mostrar
resistencia al calor moderado y sobrevivir a la pasteurización.
Bacillus cereus: Este microorganismo puede formar esporas termorresistentes, lo que le
permite sobrevivir a la pasteurización.
Estos microorganismos termorresistentes pueden representar un riesgo si no se eliminan
durante los procesos de pasteurización adecuados. Por lo tanto, es crucial realizar una
pasteurización correcta y seguir prácticas de higiene estrictas durante el manejo y
procesamiento de la leche.
4. ¿En qué consiste la prueba del alcohol y prueba de antibióticos en la leche?
La prueba del alcohol y la prueba de antibióticos son técnicas utilizadas para detectar
sustancias que pueden ser perjudiciales para la salud en la leche, así como indicar posibles
problemas en su producción.
Prueba del alcohol:
● La prueba del alcohol se emplea para identificar inhibidores presentes en la
leche, como residuos de desinfectantes utilizados en la limpieza de equipos de
ordeño o instalaciones lácteas.
● El procedimiento consiste en agregar una pequeña cantidad de alcohol a una
muestra de leche y observar si se produce coagulación o precipitación. La
formación de grumos indica la presencia de inhibidores que pueden ser
dañinos para la salud o afectar la calidad de la leche.
Prueba de antibióticos:
● La prueba de antibióticos detecta la presencia de residuos de antibióticos en la
leche, los cuales pueden ser nocivos para la salud humana y también interferir
con los cultivos lácticos utilizados en la producción de productos lácteos
fermentados.
● Para realizar la prueba, se aplica una muestra de leche a un disco o placa de
agar que contiene bacterias sensibles a los antibióticos. Si la leche contiene
residuos de antibióticos, estos inhibirán el crecimiento de las bacterias
sensibles, lo que resultará en zonas de inhibición alrededor del disco de leche.
5. Compare e interprete los resultados obtenidos en el siguiente video con la
Norma Nacional e Internacional. Link de acceso:
[Link]
Según las pautas internacionales y lo demostrado en el video, la decoloración a las 7
horas en la leche cruda señala su excelente calidad y una confirmación sólida de su
estado óptimo. En cuanto a la leche UHT, la ausencia de decoloración significativa
después de las mismas 7 horas sugiere una calidad excepcional y una conservación
ejemplar a lo largo del tiempo. Esta observación resalta tanto la calidad inherente del
producto como la efectividad de su almacenamiento y procesamiento.
IX. BIBLIOGRAFÍA
• Boletín Oficial de Estado (BOE). Disponible en: [Link]
• Normas de Higiene para el Sector Lácteo. Control de industrias lácteas y grasas
comestibles. Ed. Instituto de Salud Pública. Dirección General de Salud Pública y
Alimentación. Madrid. 2007.