UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA CELULAR

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
BC-3181

Factores que afectan la velocidad de la fosfatasa

alcalina
Francisco Márquez, 12-11163; Corina Olivo, 13-11003; David Rodrı́guez, 14-10954
24 de marzo de 2 022

Resumen
Las fosfatasas alcalinas son el nombre a unas isoenzimas presentes en muchos organismos cuya función
es remover grupos fosfatos de diversos sustratos. Se estudió la cinética de la fosfatasa alcalina presente en
suero sanguı́neo humano y se determinó la cantidad óptima de enzima, los parámetros cinéticos de esta y el
pH óptimo de la enzima. Se estimó la cantidad óptima de enzima por método continuo y discontinuo y se
calcularon los parámetros cinéticos por varios métodos de linealización. Se concluye que la determinación
fue satisfactoria pero los errores pueden propagarse muy rápido en los cálculos y volver poco confiables los
resultados.
Palabras clave: fosfatasa alcalina, km , vmax , parámetros cinéticos, condiciones óptimas de una enzima.

Introducción
Las fosfatasas alcalinas son una superfamilia de enzimas presentes en organismos procariotas y euca-
riotas. Son enzimas homodiméricas que catalizan la hidrólisis, a pH alcalino, de grupos fosfatos, con la
liberación de fosfato inorgánico y agua, un alcohol o fenol. En su sitio catalı́tico hay dos iones de cinc (II)
y uno de magnesio (II), necesarios para la actividad enzimática [Gámez Belmonte et al., 2019].
En diferentes partes del cuerpo la fosfatasa alcalina se presenta en diferentes formas; cada una difiere en
su estructura molecular, propiedades fisicoquı́micas, antigénicas y catalı́ticas [] [Panadero, 1986]. Los huma-
nos tenemos 4 isoformas de esta proteı́na: la intestinal, que mantiene la homeostasis en el intestino. Su prin-
cipal función es detoxificar lipopolisacáridos bacterianos mediante la desfosforilación de su fracción lipı́dica
para controlar la inflamación intestinal [Gámez Belmonte et al., 2019]; otras funciones incluyen regular la
absorción de ácidos grasos, la secreción de bicarbonato y el pH superficial [Gámez Belmonte et al., 2019].
La placentaria, cuyas funciones no son muy claras pero se cree que están relacionadas con el transpor-
te y metabolismo placentario [Aular-Garcı́a et al., 2015]. La fosfatasa alcalina de las células germinales,
que también se encuentra en los testı́culos y el timo; sirve como como marcador en la diferenciación de

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células germinales y en el tratamiento de tumores de esas mismas células [Hofmann and Milán, 1993]. Y
por último la fosfatasa alcalina de tejido no especı́fico, ubicada en el hı́gado, el hueso, los riñones y las
células inmunológicas. Tiene varias funciones: previene contra la desmineralización, o sea, desfosforilar los
inhibidores PPi y OPN, en el hı́gado es responsable de degradar la toxina LPS cuando la actividad de las
células de Kupffer está suprimida, es un marcador de diferenciación en células secretoras de anticuerpos
[Gámez Belmonte et al., 2019].
La comprensión de la cinética enzimática es importante para entender cómo los estados fisiológicos
de estrés afectan la homeostasis del cuerpo, e identificar agentes terapéuticos que corrijan el desequilibrio
[Murray et al., 2010]; en el caso de la fosfatasa alcalina para detectar enfermedades hepato-biliares y óseas
[Gámez Belmonte et al., 2019]. En este experimento se hará la caracterización cinética de muestras de
fosfatasa alcalina extraı́das de sangre humana, esto es, determinar la km y la velocidad máxima (vmax )
[Murray et al., 2010].
Para calcular estos parámetros se medirá, en primer lugar, la cantidad óptima de enzima y con ese
resultado, la velocidad inicial de reacción contra la concentración de sustrato y se linealizará por el método
de Lineweaver-Burk, Hanes-Woolf y Eadie-Hofstee. Las ecuaciones, respectivas, de la recta, obteenidas por
cada método se presentan en las siguientes ecuaciones:

1 km 1 1
= + (1)
v vmax [S] vmax
[S] 1 km
= [S] + (2)
v vmax vmax
v
v = −km + vmax (3)
[S]

Se puede ver que el método de Lineweaver-Burk permite hallar km como la pendiente entre el intercpeto
y vmax como el inverso del intercepto. La desventaja de este método es que requiere de dobles inversos,
los pequeños errores experimentales pueden volverse grandes errores; además, se pueden producir cálculos
erróneos por el hecho de que en altas concentraciones los puntos se aglutinen al comienzo de la gráfica
[López Nicolás and Garcı́a Carmona, 2015].
La representación de Hanes-Woolf permite halla km como el intercepto entre la pendiente y vmax como
el inverso de la pendiente. Es el más preciso de los tres métodos. Pero, tiene el inconveniente de que ni
las ordenadas ni las abscisas presentan valores independientes, sino que dependen de la concentración de
sustrato [Marasović et al., 2017]. Por su parte la representación Eadie-Hofstee, obtiene directamente km y
vmax del valor absoluto de la pendiente y el intercepto directamente por lo que está menos afectado por el
margen de error que el diagrama de Lineweaver-Burk, pero aun puede presentar errores por la dependencia
de sus variables a la velocidad de reacción [] [González, R].
Finalmente se ensayará el efecto que tiene el pH sobre la velocidad de reacción que cataliza la enzima.
También se determinará la actividad catalı́tica de la fosfatasa alcalina en unidades de actividad enzimática
(U), definida como la cantidad de enzima que induce la transformación de un micromol de sustrato (o la
liberación de un micromol de producto) por minuto. El Sistema Internacional define su unidad, el katal
que equivale a 60 × 106 U y es equivalente a U pero con el tiempo en segundos.

Objetivos
Medir la actividad enzimática de de la fosfatasa alcalina en suero sanguı́neo por método continuo y
discontinuo.
Determinar los parámetros cinéticos de la fosfatasa alcalina.
Estudiar el efecto del pH sobre la catálisis de la fosfatasa alcalina.

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Metodologı́a
Se siguió el protocolo descrito en la literatura [Biologı́a Celular USB, 2019] con las siguientes modifi-
caciones:

1. La preparación de la enzima fue realizada por el equipo profesoral y fue suministrado el suero san-
guı́neo listo.

2. Se prepararon las muestras directamente en la placa ELISA.

3. Fueron proporcionados datos experimentales del método continuo para su análisis.

Resultados y discusión
Se determinó el volumen óptimo de la fosfatasa alcalina graficando la velocidad de reacción contra el
volumen de enzima (ver imagen 1). De la pendiente de la recta (ver imagen 2) se obtuvo la actividad
enzimática de la fosfatasa alcalina.

Imagen 1: Curva para determinar el intervalo lineal

En esta curva se observa que el máximo del intervalo lineal está a un volumen de enzima de 10 µL pero
para prevenir cualquier posible interferencia se decidió que el volumen óptimo de enzima fuese 8 µL

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 Imagen 2: Intervalo lineal para la cantidad de enzima

Se determinó la pendiente y el intercepto del intervalo lineal de la enzima por interpolación se determinó
que la actividad catalı́tica de la enzima es 6,21 × 103 U (104 µkat).
Asimismo, fueron proporcionados datons de la determinación, por método continuo, de la cantidad
óptima de enzima. Se determinaron las pendientes de las curvas mostradas en la imagen 3 y las mismas se
presentan con el r2 respectivo en la tabla 1.

Imagen 3: Curvas del método continuo

Se graficaron las curvas de absorbancia contra el tiempo a diferentes cantidades de enzima y se tomaron
las pendientes de la región lineal de cada curva. Solo de las curvas con 0 y 2 µL de enzima hubo que separar
los puntos de la región lineal, las demás curvas dieron un ajuste lineal aceptable, tal y como se muesra en
la tabla 1.

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 Tabla 1: Pendientes de curvas del método continuo

V (µL) 103 × Pendiente r2

0 6,6 ± 0,7 0,974 0
2 9,8 ± 0,7 0,972 6
5 16,9 ± 0,7 0,986 4
10 28,1 ± 0,8 0,993 4
15 39,4 ± 0,6 0,997 6
20 50,7 ± 0,7 0,998 4

Cada pendiente representa la velocidad inicial de reacción pero en términos de absorbancia por tiempo.
Se puede observar que entre 5 y 10 µL de enzima se tiene una velocidad de reacción ni tan alta, ni tan
baja. Por lo que, en concordancia con el método discontinuo se puede decir que con 8 µL de enzima se
tiene una cantidad óptima de fosfatasa alcalina para determinar su vmax y su km . En cuanto a la actividad
enzimática, por este medio, se interpoló y se obtuvo que para 8 µL de enzima se obtuvo una actividad
enzimática de 2,48 × 105 U (4,14 × 103 µkat). La diferencia en los valores encontrados puede deberse a que
los datos del método continuo no fueron realizados con el mismo extracto sanguı́neo.
En la tabla 2 se muestran los parametros cinéticos determinados por los métodos de Lineweaver-Burk,
Hanes-Woolf y Eadie-Hofstee. En las imágenes 4, 5 y 6 se observan los ajustes de donde se realizaron los
cálculos de km y vmax .

Tabla 2: Parámetros cinéticos de la fosfatasa alcalina

Método km (mM) vmax (µM/min)

Lineweaver-Burk 0,21 ± 0,04 5,3 ± 0,8
Hanes-Woolf 0,06 ± 0,05 4,2 ± 0,9
Eadie-Hofstee 0,24 ± 0,05 5,8 ± 0,7

Se puede observar que el ajuste de Hanes-Woolf da la peor estimación de los parámetros cinéticos a
pesar que la literatura dice que es el método más preciso [] [Marasovic et al, 2017]. Se cree que debido a los
posibles y múltiples errores cometidos durante la experiencia, al momento de la manipulación algebraica
de los datos, los errores se hayan propagado hasta dar la peor estimación. Por el método de Eadie-Hofstee
y Lineweaver-Burk se estimó un valor de 0,225 mM para km y 5,55 µM/min para vmax .

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 Imagen 4: Ajuste de Lineweaver-Burk

Se puede observar en esta imagen que el ajuste por el método de Lineweaver-Burk que el ajuste es
bastante aceptable, tanto por el valor de r2 como visualmente.

Imagen 5: Ajuste de Hanes-Woolf

En esta imagen se observa que el ajuste es mucho peor que el anterior y esto se puede explicar por
propagación de errores durante el experimento.

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 Imagen 6: Ajuste de Eadie-Hofstee

En esta imagen se observa que el ajuste está entre el de Hanes-Woolf y Lineweaver-Burk, lo cual podrı́a
ser explicado por propagación de errores. En la imagen 7 se muestra el cambio en la velocidad de reacción
al variar el pH desde pH = 5 hasta pH = 10.

Imagen 7: Efecto del pH en la velocidad de reacción

Se puede observar que la fosfatasa alcalina encuentra su mayor actividad a pH = 10, tal y como se
espera por su nombre. Asimismo, se observa que a pH no tan ácidos tiene cierta actividad. Destaca que su
menor actividad ocurre a pH neutro aunque tiene sentido porque por la sangre viajan muchas sustancias y
muchas pueden llevar grupos fosfatos por lo que no es viable, biológicamente, la actividad de la enzima al
pH de la sustancia que transporta todo en el cuerpo: la sangre. No se ensayaron pH superiores a 10 debido
a que a pH más alcalinos la fosfatasa alcalina pierde su actividad como se infiere en la metodologı́a cuando
la reacción se detiene por alcalinización del medio con NaOH 2 M (pH ¿10).

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Conclusiones
Se determinó la actividad enzimática de la fosfatasa alcalina presente en el suero sanguı́neo, ası́ como
sus parámetros cinéticos.
Se encontró que a pH neutro la fosfatasa alcalina tiene su menor actividad y que a pH = 10 tiene su
máximo de actividad y mantiene algo de actividad también a pH no fuertemente ácidos.
No se pudo determinar que el ajuste de Hanes-Woolf fuese el más preciso como reza en la literatura,
en su lugar se vio que el método de Lineweaver-Burk fue el más preciso, seguido por el de Eadie-Hofstee.

Referencias
[Aular-Garcı́a et al., 2015] Aular-Garcı́a, J., Reyna-Villasmil, E., Mejia-Montilla, J., Santos-Bolı́var, J.,
Torres-Cepeda, D., and Reyna-Villasmil, N. (2015). Fosfatasa alcalina placentaria para la predicción de
parto pretérmino. Progresos de Obstetricia y Ginecologı́a.

[Biologı́a Celular USB, 2019] Biologı́a Celular USB (2019). Laboratorio de bioquı́mica BC-3181.

[Gámez Belmonte et al., 2019] Gámez Belmonte, M. d. l. R. et al. (2019). Función de la fosfatasa alcalina
no especı́fica de tejido en la pancreatitis aguda experimental y en la activación de macrófagos.

[Hofmann and Milán, 1993] Hofmann, M. and Milán, J. (1993). Developmental expression of alkaline
phosphatase genes; reexpression in germ cell tumours and in vitro immortalized germ cells. European
urology, 23:38–45.

[López Nicolás and Garcı́a Carmona, 2015] López Nicolás, J. M. and Garcı́a Carmona, F. (2015). Los
cuatro mosqueteros de la cinética enzimática. Eubacteria, no 34, 2015.

[Marasović et al., 2017] Marasović, M., Marasović, T., and Miloš, M. (2017). Robust nonlinear regression
in enzyme kinetic parameters estimation. Journal of Chemistry, 2017.

[Murray et al., 2010] Murray, R. K., Bender, D. A., and Botham, K. M. (2010). Harper: bioquı́mica ilus-
trada. McGraw-Hill.