GMB U7.
MUESTRAS DE SEMEN.
Naïs Palomino
LABORATORIO CLÍNICO Y BIOMÉDICO. 1ºT.
U.7 | MUESTRAS DE SEMEN.
ÍNDICE.
1. Introducción.
2. Características.
3. Recogida y transporte.
4. Recepción de la muestra y procedimiento de analítica.
5. Alteraciones. en seminograma.
6. Estudios de viabilidad espermática.
7. Morfología.
8. Prueba analítica y sustancias.
8.1 Examen macroscópico.
8.2 Estudio de motilidad espermática.
8.3 Aglutinación y agregación.
8.4 Concentración.
8.5 Marcadores bioquímicos.
8.6 Cultivos.
8.7 Vitrocongelación.
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Fracciones→
1. INTRODUCCIÓN.
• Primera fracción formada por secreción epididimaria y
Normozoospermia→1,5ml-2ml, eyaculado 3-4ml.
prostática.
Indicaciones de las muestras de semen: • Segunda fracción formada por vesículas seminales.
• Estudios de infertilidad→ Ante sospecha de
infertilidad. Se realiza evaluación andrológica→ 3. RECOGIDA Y
o Historia clínica.
o Exploración física. TRANSPORTE.
o Seminograma.
o Valoración macrológica. Abstinencia sexual de mínimo 72h y máximo 7 días.
o Pruebas complementarias→
Normalmente 3-4 días.
- Pruebas de funciones perláticas.
- Ecografía escrotal. 1. Lavado genital y secado.
- Ecografía transrectal. 2. Se suele realizar en laboratorio.
- Análisis de la orina post-orgasmo, 3. Tras la masturbación se almacena la eyaculación en
es decir, análisis de la orina frasco de vídrio o plástico, opaco.
después del orgasmo. 4. Si se ha usado preservativo, no debe tener
- Determinaciones hormonales. espermicida.
• Sospecha de delito sexual→ Estudios medicolegales, 5. No se puede realizar después de un coitus
por lo tanto, se piden en medicina legal. interruptus ni muestras incompletas.
• Pruebas de paternidad o pruebas de demanda de 6. Proteger de luz y a temperatura ambiente.
paternidad→ La petición la hace un juez. 7. Contenedor rotulado correctamente.
8. Entregar lo antes posible, no puede sobrepasar 1h.
2. CARACTERÍSTICAS.
El personal debe→
• Eyaculación normal 2-3ml, también es válido 1,5-6ml;
dependiendo del tiempo de la última eyaculación. • Añadir en el frasco datos del paciente
• pH 7,2-9 / 8-9. cumplimentado con el volante.
• Comprobar datos del frasco con formulario de
Composición→
solicitud y hoja de trabajo de laboratorio.
• 10% células. • El que entrega la muestra es el propio paciente, al
• 90% líquido seminal proveniente de: cual se le entrega un cuestionario.
- Vesículas seminales.
En el cuestionario debe figurar→
- Próstata.
- Epidídimo. • Hora de recogida.
- Glándulas anexas. • Días de abstinencia.
• Volumen eyaculado.
Según la procedencia cambian propiedades y volumen.
• Procesos febriles últimos 3 meses.
En general, la composición→ • Motivo del análisis y si se ha realizado otros
anteriormente.
• 30% secreciones prostáticas. Contiene zinc, citrato, • Si ha sufrido algún traumatismo.
fosfatasa ácida y otro tipo de sustancias acidas.
• 5% secreciones del epidídimo, son secreciones
epididimarias. Se segrega carnitina.
• 65% secreciones de vesículas seminales. Secreción
alcalina, principalmente fructosa.
Durante la eyaculación, se van a mezclar todas las fracciones o
la composición del semen.
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Según la forma y número de los espermatozoides las
4. RECEPCIÓN DE LA patologías son:
MUESTRA Y
PROCEDIMIENTO.
1. 0-5min registrar, pesar e identificar muestra.
2. 20-25min comprobar estado de licuefacción y
aspecto.
3. 30min evaluar y valorar viscosidad, aglutinación,
concentración, movilidad, detritus.
Hiperespermia→Volumen > 6ml.
4. 30min pruebas anticuerpos y extensiones con tinción
para evaluación de movilidad y vitalidad espermática. En cámara de Neubauer se visaulizan 6-400 espermatozoides.
5. Diluciones para determinaciones de concentración
espermática.
6. Se puede separar para alicuotar y evaluar células
5. ALTERACIONES EN
(alicuotar y coger una alícuota específica para
evaluación de células inflamatorias). SEMINOGRAMA.
7. Se puede realizar extensiones para examen
Objetivo→ Determinación de fertilidad en función de:
citomorfológico.
8. Se puede realizar separación y centrifugación para Viabilidad de los espermatozoides→
estudios bioquímicos.
9. Pasados 30min se pueden realizar→ • Movilidad.
• Contabilizar en cámara de Neubauer mejorada. • Morfología.
• Visualizar células inflamatorias (+106 • Vitalidad.
espermatozoides/ml indica inflamación). • Recuento.
• Determinaciones bioquímicas para contribución
Calidad del líquido seminal→
glandular secretora, (ver % proveniente de la
próstata, vesículas y vesículas seminales). • Composición.
• Tinciones de extensiones para morfología (recuento • Viscosidad.
diferencial). • Volumen.
• Color.
Se pueden recoger 6µL, poner 400 aumentos en cámara de
• pH.
Neubauer mejorada y realizar disolución para mejor
• Filancia.
visualización.
Materiales→
Se pueden ver células:
Detritus (restos celulares). - Baño térmico.
Células epiteliales. - Pipetas pasteur.
Glóbulos rojos. - Varilla de vidrio.
Células redondas (inflamación). - Portaobjetos.
Microorganismos. - Cubetas de espectrofotometría (1cm paso de luz).
- Gradilla para cubetas de espectrofotometría.
En condiciones normales, se encuentran <1M o 10 6M de - Vaso de precipitado.
leucocitos/ml y <5x106 o 5M células redondas/ml. - Cámaras Neubauer.
- Tiras de ph.
Valores seminograma→
- Tubos graduados.
• Mínimo para seminograma 1,5ml; la mayoría a partir - Tarjeta de aglutinación.
de 2ml. - Palillos desechables.
• Normalmente 3-4ml. - Muestra: semen.
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- Reactivos: cámara Neubauer y esperar 2 minutos.
Tinción panóptico rápido: Observar la preparación al microscopio con
o Fijador. el objetivo de 40x. Hacer un recuento de
o Eosina. una de las cuadriculas de las esquinas y el
o Azul de metileno. resultado se introduce en la siguiente
Tinción eosina-nigrosina. ecuación:
Kit determinación inmunología de IgG - N x 21 x 10000 = número total de
(Anticuerpos antiespermatozoides). espermatozoides
Disolución de macomber-saunders. - Morfología (tinción con panóptico rápido).
KIT spermmar-test-IgG. Realizar una extensión de semen
depositando 1 gota (10µL) sobre un
Procedimiento→ portaobjetos atemperado previamente.
- Realizar una tinción con panóptico rápido
1. Examen macroscópico.
introduciendo 5 veces (1 segundo cada
- La muestra debe ser procesada en el menor
inmersión) en las 3 cubetas.
tiempo posible, temperatura constante a 37ºC.
- Observar al microscopio con el objetivo de
- Homogeneizar antes de trabajar.
40x.
- Trasvasar muestra a un tubo para medir volumen
- Examen químico o espectrofotometría.
total.
Consiste en una cuantificación de fructosa y
- Medir tiempo de licuación (de viscoso a líquido),
ácido cítrico.
conociendo la hora de recogida y hora de licuado.
- No lo vamos a realizar, pero deberíamos
15-60min.
hacerlo en un seminograma normalmente.
- Color, entre blanco opalescente y blanco
- Examen químico o espectrofotometría.
amarillento, dependiendo del color pueden indicar
- Consiste en una cuantificación de fructosa y
sangre, infección entre otros.
ácido cítrico. No lo vamos a realizar, pero
- Medir viscosidad con varilla y pipeta pasteur,
deberíamos hacerlo en un seminograma
cayendo gota a gota formando hilos de 2cm
normalmente.
aprox. Si cae formando hilos largos, > viscosidad, si
- Examen inmunológico o espermmar-test-
cae sin apretar pipeta < viscosidad.
IgG.
- pH con tiras reactivas.
- Atemperar los reactivos y las muestras.
- Depositar en una tarjeta de aglutinación una
2. Examen microscópico.
gota (10µL) de semen fresco sin tratar +
- Antes de depositar gota en portaobjetos,
una gota (10µL) de partículas de látex IgG +
atemperar a 37ªC.
una gota (10µL) de antisuero.
- Movilidad (en fresco). Se deposita una gota
- Mezclar con la ayuda de un palillo
(10µL) sobre portaobjetos atemperado y se
desechable.
cubre con cubreobjetos. Observar al
- Observar bajo el microscopio la presencia
microscopio con objetivo 40x.
de aglutinación tras 2 o 3 minutos.
- Vitalidad o tinción eosina-nigrosina.
- Si aglutina es positivo (si supera el 40%
Depositar en un tubo 50 µL de semen y 50
infertilidad total, entre 10 y 39% posibilidad
µL de eosina al 1% en agua. Esperar 20 o
de infertilidad).
30 segundos.
- Si no aglutina es negativo (hay fertilidad).
- Añadir 100 µL de nigrosina al 10% en agua
con/sin glicerina al 75% y homogeneizamos.
Realizar una extensión sobre un
portaobjetos atemperado y dejar secar.
- Observar al microscopio con objetivo 40x
- Recuento o cámara Neubauer. Diluir el
semen en una disolución con macomber-
saunders al 1/21 (0.05ml semen + 1 ml
macomber-saunders) directamente sobre la
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• Región acrosómica bien definida, supone el 40-60%
6. ESTUDIOS DE de los casos.
• Pieza intermedia ancho <1 micra y entre 1,5 veces la
VIABILIDAD longitud de la cabeza, en su interior hay restos
citoplasmáticos proporción 1:3.
ESPERMÁTICA. • Cola recta, forma uniforme y largo de 45 micras.
La vitalidad espermática afecta a la calidad del semen, se Recomendaciones de la OMS→
realizan estudios cuando más del 40% no se mueven.
- Cuando se visualizan al microscopio se utiliza
Criterios→ binocular con micrómetros.
- Si hay cabezas solas, no se cuentan.
• 400 espermatozoides inmóviles (40-50%), el estudio
- Formas normales <15% indica que el semen para
se realiza cuando la movilidad es menor a 50%.
fertilización in vitro ha disminuido su capacidad. (No
• Se mide membrana plasmática del espermatozoide y
usar).
se usan colorantes supravitales como la eosina.
8. PRUEBAS ANALÍTICAS
Se realizan dos inmersiones con eosina→
1. Los muertos se tiñen de rojo.
Y SUSTANCIAS A
2. Vivos se tiñen de negro, los muertos de amarillo.
ANALIZAR.
Con Nigrosina→
Los vivos de blanco, los muertos de rojo. 8.1 EXAMEN MACROSCÓPICO.
- Además de medir la respuesta que tienen en la Semen recién eyaculado→ Coágulo viscoso, opaco,
membrana plasmática cuando se tiñen, también se mide la blanquecino o grisáceo, olor ácido parecido al moho.
capacidad que tiene la membrana para responder a los
10-20min, el coágulo se empieza a licuar espontáneamente,
cambios osmóticos.
transformándose en un líquido translúcido, turbio y viscoso.
Se considera normal en un seminograma cuando -75%
pH ligeramente alcalino 7,7.
aparecen no teñidos, se considera normal, y cuando más del
60% aparecen hinchados. El semen con mucha secreción prostática el pH disminuye y es
menor a 7.
7. MORFOLOGÍA. Parámetros en examen macroscópico→
Pueden tener -30% formas alteradas.
• Tiempo de licuefacción→ 20-25min a 37ºC, deben
La forma alterada se relaciona con la capacidad de atravesar la aparecer partículas de gel y filamentos mucosos.
pared vaginal, alteraciones en el desarrollo embrionario, • Volumen→ 2-8ml.
indicando que hay muchos radicales libres apareciendo así una • Aspecto→ gris, opalescente o nacarado.
teratospermia. • Viscosidad→ Rapidez con la que sale de la pipeta,
normalmente gota a gota.
Tinciones para estudios morfológicos→ • Filancia→ Longitud o hilo cuando se separa el semen,
determina en el caso de los espermatozoides, si es
• 1Tinción Papanicolau.
normal o no. Debe ser </= 1cm.
• 1Tinción Deef-quick.
• pH→ Se mide añadiendo 1 gota en una tira reactiva,
debe ser 6,1-10.
Criterios de normalidad→
• Cabeza normal ovalada, no excesivamente.
• 4-5 micras de largo.
• 2,5-3,5 micras de ancho.
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Se utiliza ç técnica de detección llamada panóptico rápido,
8.2 ESTUDIO DE MOTILIDAD
consiste en utilizar un fijador, eosina y azul de metileno.
ESPERMÁTICA.
Motilidad espermática→ Utilizar objetivo seco muy potente, 8.5 MARCADORES BIOQUÍMICOS.
contar como mínimo, un total de 200 espermatozoides por
campo, sirve para medir calidad y capacidad de fecundación. Marcadores bioquímicos→ Localización de trastornos del
tracto genital. Se busca si se encuentra en el epidídimo,
Se busca que el flagelo haga por lo menos 100 batidos. vesículas seminales o próstata.
Se realizan en sentido anteroposterior y permiten la Se busca→
progresión del mismo.
• Epidídimo→ L-carnitina, la carnitina y la alfa
Según la motilidad, se clasifican→ glucosidasa ácida o α-1,4-glucosidasa neutra.
• Vesículas seminales→ Fructosa.
• Tipo A→ Progresiva y rápida.
• Próstata→ Fosfatasa ácida, cinc y citrato.
• Tipo B→ Progresiva y lenta.
• Tipo C→ Se mueve, pero no progresa. [Link]
• Tipo D→ Inmóvil.
Normalmente se encuentran más de 50% de los 8.6 CULTIVOS.
espermatozoides que tienen la suma de movilidad A más B, o Se compara con otros cultivos (orina, secreción prostática y
también es normal si solo se recuentan los espermatozoides frotis uretral).
del tipo A que más del 25% mayor o igual al 25% de los
espermatozoides sean del tipo A. Se considera positivo >1000UFC (unidades formadoras de
colonias) de una sola bacteria.
Si se suma A+B sería mayor o igual al 50%.
Indicado en caso de hipospermia, hemospermia, alteraciones
Si solo se fija en los de tipo A tiene que ser mayor del 25%. en la licuación, leucocitospermia, aglutinaciones espontáneas,
astenoespermia, oligospermia, teratospermia, inmovilidad de
8.3 AGLUTINACIÓN Y los espermatozoides, descenso de los marcadores prostáticos,
epididimarios o seminales. EN caso de baja fosfatasa ácida, baja
AGREGACIÓN ESPERMÁTICA.
fructosa o baja L-carnitina. También en caso de infecciones
Aglutinación→ Adherencia de los espermatozoides entre sí, urogenitales.
no se adhieren con células ni detritus.
A demás de un cultivo, se realiza frotis uretral, en caso de
Agregación→ Los espermatozoides que se van uniendo, no aparecer Chlamydia Trachomatis, está indicado hacer el
tienen movilidad, y se unen con células epiteliales y con cultivo.
detritus o restos celulares.
• Cándida.
• Trichomonas Vaginalis.
8.4 CONCENTRACIÓN • Pseudomonas Aeruginosa.
ESPERMÁTICA. • Haemophilus.
• Estafilococos.
Concentración espermática→ Una vez licuado se concentran
• Estreptococos.
para ver la cantidad.
• Heterobacterias.
Valores normales según la OMS→ • Enterobacterias.
• Gardnerella Vaginalis.
• 20-40 millones.
- Si son 20 millones si se dice por mililitro. Cuando en un frotis uretral aparece Chlamydia Trachomatis
- Si son 40 millones si se refiere al eyaculado total. hay que hacer un cultivo de semen.
Se realizan extensiones para su visualización.
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Video: hth[Link]
8.7 VITROCONGELACIÓN.
vThyhkfcngtps://[Link]/BvThyhkfcng
Vitrificación→ Técnica de congelación ultrarrápida basada en
la utilización de unas sustancias llamadas crioprotectores, que Técnica→
protegen a las células, y una velocidad de enfriamiento muy
elevada. Para llevar a cabo el proceso de vitrificación con éxito, es
necesario que el personal del laboratorio tenga mucha
Con esto, se evita la formación de cristales en el interior de las experiencia, ya que es una técnica complicada que debe
células, los cuales dañarían las estructuras internas y hacerse respetando unos tiempos muy cortos.
provocarían la muerte celular.
El método más habitual de vitrificación es el Cryotop de la
Gracias a ella, se pueden preservar los embriones para su uso marca Kitazato. A continuación, vamos a enumerar los pasos
posterior. Los embriones permanecen congelados a -196 °C generales de la técnica:
en tanques de nitrógeno líquido hasta que la mujer o la pareja
decida utilizarlos. Pueden conservarse durante un tiempo 1. Deshidratar los embriones pasándolos de un medio a
indefinido sin perder las características que tenían en el otro con una concentración creciente de crioprotectores.
momento de la vitrificación. Así, los embriones se pueden 2. Colocar con mucho cuidado los embriones encima del
utilizar meses o años después para buscar un embarazo. sistema de soporte para su congelación que, en el caso
del Cryotop, es una pajuela.
Estos embriones no pueden sobrevivir más de 6 días en 3. Introducir la pajuela con los embriones en una cubeta
cultivo. Por tanto, será necesario criopreservarlos hasta decidir pequeña con nitrógeno líquido.
cuál va a ser su destino. 4. Colocar la tapa o capuchón a la pajuela con la precaución
de no alejarla de los vapores del nitrógeno líquido.
Principales motivos para vitrificación de embriones→ 5. Por último, guardar la pajuela cargada con los embriones
dentro del tanque de nitrógeno líquido para su
• No ha sido posible realizar la transferencia embrionaria
conservación.
en el mismo ciclo de estimulación. Ej: cuando la mujer
tiene riesgo de sufrir el síndrome de la hiperestimulación De manera que los embriones pasan de la temperatura de
ovárica o cuando el endometrio no ha engrosado lo cultivo (37 °C) a la temperatura de congelación en nitrógeno
suficiente y no está receptivo. líquido (-196 °C) en tan solo unos segundos.
• Se ha realizado la transferencia embrionaria en fresco,
pero quedan embriones sobrantes que pueden Los embriones deben tener una calidad mínima para poder
transferirse en próximos intentos, ya sea por haber resistir los procesos de congelación y descongelación. Por
obtenido un negativo o para tener un segundo hijo en el tanto, aquellos embriones que no se desarrollen bien o que
futuro. presenten signos de degeneración no se vitrifican.
• Preservación de la fertilidad. Algunas parejas deciden
Los crioprotectores son unas moléculas que sustituyen el
congelar embriones en lugar de óvulos y semen por
líquido acuoso del interior de las células embrionarias y que
separado.
protegen sus estructuras internas de las bajas temperaturas
• Se ha hecho una biopsia a los embriones para hacer un
DGP, pero hay que esperar varios días a los resultados. [Link]
• Durante una ovodonación si no se ha podido sincronizar embriones/procesode-vitrificacion-de-embriones/
a la donante con la receptora de óvulos. En este caso, es
posible congelar los óvulos donados o los embriones Desvitrificación de embriones→
después de su fecundación.
• Hay embriones sobrantes de un ciclo y la pareja o mujer El proceso de desvitrificación es más rápido y sencillo que el
decide donarlos a otras personas con problemas de anterior. Simplemente, hay que sacar la pajuela con los
infertilidad. embriones del nitrógeno líquido, sacar la tapa e introducirla
directamente en un medio a 37 °C.
Gracias a esto, en los últimos años ha aumentado la tasa de
embarazo acumulada, es decir, la tasa de embarazo por Con la ayuda de la pipeta se despegan los embriones de la
punción con un solo ciclo de estimulación ovárica. pajuela tirándoles medio de cultivo encima. A continuación, se
van pasando los embriones por varios medios con
concentraciones decrecientes de crioprotectores. Así se
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consigue la rehidratación celular, de forma que se van
reemplazando los crioprotectores por agua.
Es muy importante respetar los tiempos del protocolo de
desvitrificación para hacerlo correctamente, ya que de lo
contrario podrían dañarse las estructuras celulares del
embrión y no sobrevivir.
Antes de hacer una transferencia de embriones congelados, es
imprescindible desvitrificarlos unas horas antes y observar si
han logrado sobevivir.
[Link]
vitrificacion/