INSTITUTO TECNOLOGICO
BOLIVIANO CANADIENSE
¨EL PASO¨
TRABAJO DE INVESTIGACION
MÉTODOS PCR
ASIGNATURA:
BROMATOLOGIA Y MICROBIOLOGIA
NIVE :
400 “ A “
DOCENTE:
LIC. FANNY ESCALERA CLAROS
ESTUDIANTES:
-BERRIOS ALVAREZ YAZMIN
- BOLIVAR CARRION WHARA ANDREA
- ENCINAS AGUADA NAJHELY
-QUISPE WENDY
-VERA LAZO SENAIDA
FECHA DE REALIZACION:
7 / 06 / 24
FECHA DE ENTREGA:
10 / 06 / 24
1. INTRODUCCIÓN
El PCR, o la reacción en cadena de la polimerasa, es una reacción química que los
biólogos moleculares utilizan para amplificar (crear copias) fragmentos de ADN.
Esta reacción permite que unos pocos fragmentos de ADN se repliquen en millones
o miles de millones de copias. La técnica de PCR (del inglés Polymerase Chain
Reaction) es un proceso basado en el uso de la enzima Tal ADN polimerasa para
amplificar regiones de ADN. De esta manera se aumenta la cantidad de dichas
regiones en la muestra para su consecuente estudio o uso en una gran variedad de
ensayos.
Para la PCR estándar, todo lo que se necesita es una polimerasa de ADN, magnesio,
nucleótidos (dNTPs), primers, el template de ADN a amplificar y un termociclador.
El mecanismo de PCR es tan simple como su propósito:
La amplificación inespecífica, es decir, la amplificación de regiones del ADN que
no son de interés, es un problema que puede ocurrir durante la PCR.
La mayoría de las polimerasas de ADN que se utilizan para PCR funcionan mejor
entre 68 y 72 ºC. Por lo tanto, la temperatura de elongación elegida debe estar en
este rango. Sin embargo, la enzima también se puede activar a menor temperatura. A
temperaturas muy por debajo de la temperatura de alineamiento/hibridación, los
primers tienden a unirse de forma no específica, lo que puede dar lugar a una
amplificación inespecífica. Esto se puede evitar mediante el uso de las denominadas
Taq polimerasas Hot Start.
Estas polimerasas contienen un inhibidor unido a ellas que previene su activación.
Una vez se alcanza la temperatura óptima para el proceso de elongación este
inhibidor se disocia y así la enzima puede llevar a cabo su función.
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GENERA.
Determinar el concepto básico de PCR y sus aplicaciones
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Comprender la técnica de PCR Identificar los equipos y materiales para
realizar la técnica de reacción en cadena de la polimerasa.
Comprender como realizar el método PCR
Identificar los pasos para realizar un PCR correctamente.
3. MARCO TEORICO .
¿Qué es la PCR?
La reacción en cadena de la polimerasa es una reac-Ción enzimática in vitro que
amplifi ca millones de veces .Una secuencia específi ca de ADN durante varios
ciclos Repetidos en los que la secuencia blanco es copiada Fi elmente. Para ello,
la reacción aprovecha la actividad De la enzima ADN polimerasa que tiene la
capacidad De sintetizar naturalmente el ADN en las células. En La reacción, si
usamos como sustrato ADN genómico, Entonces típicamente hablamos de una
PCR, pero si Usamos ADN complementario (ADNc) proveniente del ARNm
(ácido ribonucleico mensajero) se le conoce conomo RT-PCR (Reverse
Transcription-PCR, por sus siglas en inglés). Esta conversión se logra mediante
una reacción conocida como transcripción reversa y controlada por la enzima
transcriptasa reversa, capaz de convertir el ARNm en una molécula de ADNc.
Este Método fue copiado de los retro virus que usan una Transcriptasa reversa
para convertir su genoma de
ARN en ADN duplicarse en millones de partículas
Virales.2
El ADNc se utiliza cuando analizamos la ex Presión del ARNm de algún gen de
interés. Los elementos importantes en la reacción son el Templado o molde
(ADN o ADNc), la enzima, los oligonucleótidos o primers, los
desoxirribonucleótidos trifosfatados (dNTPs: adenina, timina, citosina y
guanina), El ión magnesio (Mg +), una solución amortiguadora O buffer y H2O.
Todos estos elementos interactúan en tres etapas principales de las que se
compone la PCR: desnaturalización, hibridación y extensión. Los equipos en
donde se realiza la reacción son llamados termoci-Cladores, los cuales están
diseñados para establecer Un sistema homogéneo en donde las condiciones de
Temperatura y tiempo necesarios no se modifi quen En cada uno de los ciclos.
Al fi nal de la reacción, para Corroborar si se amplifi có la secuencia blanco de
Interés, los productos de la PCR o también llamados Amplicones son analizados
en geles de agarosa para Confi rmar si la reacción fue exitosa. A continuación Se
explicarán cada uno de los puntos mencionados.
¿Qué elementos químicos se necesitan?
El elemento principal en la PCR es el ADN, cuya naturaleza química ofrece
ventajas para su manipulación. Para entrar en contexto, es importante recordar
que la Molécula de ADN está formada por tres componentes: Un azúcar
(desoxirribosa), un grupo fosfato y una base Nitrogenada (adenina, timina,
guanina o citosina) que Es complementaria con la base de otra cadena de tal
forma, que el ADN se estructura en una Doble hélice.
3 La complementariedad entre las bases Está dada por puentes de hidrógeno e
interacciones Hidrofóbicas, generando estabilidad a la doble hélice, La carga
eléctrica del ADN es negativa y está dada por Los grupos fosfatos. En la PCR, el
templado son las Cadenas de ADN que se separan y funcionan como Molde para
que la enzima sintetice las nuevas cadenas que llevan la secuencia blanco de
interés. Por su Parte, la ADN polimerasa se encarga de la catálisis de La
reacción, sintetizando las nuevas cadenas de ADN Que llevan la secuencia
blanco. La enzima más usada Con frecuencia se llama Taq ADN polimerasa,4
Que proviene de una bacteria termófi la llamada Thermus Aquaticus, la cual
vive en condiciones de temperatura Muy altas y por eso su ADN polimerasa es
capaz de soportar ese tipo de temperaturas. El rasgo que distingue A esta enzima
bacteriana de otras ADN polimerasas De otros organismos es su capacidad para
mantener Su funcionalidad a temperaturas altas, por lo que se Le considera una
enzima termoestable. También hay Otras enzimas que se utilizan como la Vent,
obtenida De la bacteria Thermococcus litoralis.
4. Normalmente, Casi todas las enzimas que se venden comercialmente Son
eficientes y generalmente cuando fallan lo hacen Por una manipulación
incorrecta del usuario. Para queLa enzima funcione con alta especificidad y la
reacción transcurra exitosamente, también se necesita de loselementos ya
mencionados como primers, dNTPs, Mg +, buffer y H2gen blanco comparados
con un gen de referencia (gen housekeeping) que no cambia su expresión a pesar
de que los estados fi siológicos se modifiquen por diversas causas. Los datos son
expresados como relativos al gen de referencia y generalmente son referidos
como el número de veces en el que aumentaron o decrementaron los niveles de
ARNm o en su caso, si no hubo cambios. Cualquiera que sea el tipo de
cuantificación que se elija, casi todos los software de los equipos están
posibilitados para llevar a cabo los análisis matemáticos y estadísticos que se
requieren en cada tipo de cuantificación.
Conclusiones
Los retos que se presentan día a día en la investigación biomédica nos abren la
posibilidad de conocer nuevas herramientas tecnológicas para afrontarlos
experimentalmente. Es por eso que la PCR es una de esas herramientas que se ha
desarrollado para ofrecer una alternativa para el estudio de los ácidos nucleicos.
Tal fue su impacto en la comunidad científica que hoy en día es una técnica que
se usa a diario en muchos laboratorios y que se incrementó cuando apareció la
modalidad de PCR en tiempo real, permitiendo el establecimiento y la aplicación
de nuevos protocolos experimentales más precisos que generan resultados
confiables y reproducibles. Por todo ello, difundir los fundamentos de la PCR es
un primer paso para conocer una de varias herramientas tecnológicas con las
que se cuenta para el estudio de los ácidos nucleicos.
Bibliografía
1. Mullis KB. The unusual origin of the polymerase chain
reaction. Sci Am. 1990; 262: 56-61.
2. Herschhorn A, Hizi A. Retroviral reverse transcriptases.
Cell Mol Life Sc. 2010; 67: 2717-2747.
3. Watson JD, Crick FH. A structure for desoxyribose
nucleic acid. Nature. 1953; 421: 397-378.
4. Saiki RK et al. Primer-directed enzymatic amplifi cation
of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science.