RESULTADOS Y DISCUSION Variacién del °Bx Durante el Proceso de Fermentacién Para observar el descenso de la cantidad de azticares fermentables a través de la fermentacion se llev6 a cabo la determinacion de °Bx de las muestras tomadas durante el proceso de fermentacién en cada uno de los tratamientos aplicados a los mostos. En la Figura 6 se observa el comportamiento de esta variable en cada una de las condiciones de tratamiento aplicados de acuerdo al disefio de experimentos, El valor de °Bx observado al inicio de la fermentacién fue 17.0 y el maximo fue de 17.8. Esta variacién se debié al tiempo de cosecha de la uva, es decir, al tiempo de la vendimia, a medida que pasa mas tiempo de maduracién el valor del ° Bx es mayor. Se realizaron ajustes de curvas con los datos obtenidos del °Bx y el tiempo de fermentacién para describir mateméticamente el comportamiento de la variacién de los °Bx durante la fermentacién a las distintas condiciones de temperatura. Para 20°C la regresién que se obtuvo fue: © Be =18.50-0.31F +0,0007 donde °Bx representa los Grados Brix, t el tiempo de fermentacién. El coeficiente de determinacién (R*) tue de 0.9939. Para 30°C la ecuacién que representa la variacién de los °Bx fue * spe = 18,37 -0.571-+ 0.0027 ‘con Ri de 0.9758, Para 35°C la regresién obtenida fue: =" Be= 1743 0.761-+0.008° con R’ de 0.9884 . . isminucién de los °Bx por efecto de la temperatura durante el tiempo de fermentacién. En ella se observan tres curvas.n , las cuales el descenso de los "Bx dependié de la temperatura de fermentacion En la Figura 6 se puede observar laa 20 - A Temperatun 20% — Bert so0.a10.0018 ; 8 4s i 2 = j . Figura 6. Efecto de la temperatum y el tiempo de fermentacién sobre la cantidad de azucares (expresado en °Bx) durante el proceso de fermentacién de mosto de uva Carighiane, y2 uilizada y se observa claramente el efecto que tiene la temperatura on la velocidad de fermentacién. Para 20°C el tiempo de disminucién fue menor debido ‘a que la velocidad a la que los azucares fermentables son convertidos a etanol y CO; es més Ienta. Para 35°C se obtuvo un menor tiempo que para 30°C y esto debido a que a medida que se aumenta la temperatura se aumenta la velocidad de disminucién de los azticares y el tiempo de fermentacién se reduce. Esta Gisminucién se debe a la reproduccién y actividad de la levadura Saccharomyces cerevisiae, es decir esta se ve afectada por la temperatura de fermentacién. Lo anterior concuerda con Mensonides y Col., (2002) en donde reportaron que la temperatura dptima de crecimiento de la levadura Saccharomyces cerevisiae es 37°C y a temperaturas mayores 0 menores la actividad de la levadura se ve afectada, es por eso que para 30 y 35°C observamos que el tiempo de consumo de los azucares fermentables es menor debido a que la actividad de la levadura se ‘modificé aumentando su reproduccién y actividad. Produccién de Alcohol durante el Proceso de Fermentacién Para determinar el porcentaje de alcohol-volumen obtenido durante cada una de las fermentaciones se tomaron las muestras y éstas fueron destiladas. Al destilado se le determiné el %Alc. Vol. El valor maximo de %alcohol-volumen ‘observado fue de 9.3 y el minimo de 8.6, dependiendo del los °Bx iniciales de la uva. El valor de 86 se obtuvo al inicio de la vendimia y el valor de 9.3 al final de ésta, En esta determinacién también se realizé una regresién para describir de ‘manera matematica el comportamiento durante las fermentaciones de acuerdo a las temperaturas utlizadas. Para 20°C la ecuacién se muestra a continuacién NF = ~0,003-+0.161 ~0,0007F? donde AV representa el % Alc. Vol y t el tiempo de fermentacién. La R? obtenida fue de 0.9993. Para 30°C y 35°C las ecuaciones siguientes representa el comportamiento del %ANic. Vol. %eAl = ~0.03+0.271- 0.00"4a av 0,07 +0371 -0,002r ‘con R* de 0.9986 y 0.9915 respectivamente. En la Figura 7 se puede observar ol comportamiento del %Alc. Vol. en cada tuna de las temperaturas. A medida que se incrementa la temperatura el tiempo de fermentacién transcurre més répido y la velocidad de generacién del etanol es mayor, por lo tanto tarda menos tiempo en llegar a su maximo, esto de nuevo, debido a la reproduccién de las levaduras en el proceso de fermentacién. La cantidad de etanol no se vié afectada por la temperatura de fermentacién yesto concuerda con el estudio realizadazo por Kourkoutas y Cols, en 2002 donde se realizaron fermentaciones a diferentes temperaturas y la produccién de etanol no se vio afectada por las condiciones de temperatura de fermentacién. Rendimiento de Produecién de Etanol El rendimiento de la produccién de etanol es la cantidad de °Bx necesarios, para incrementar el 1 % Alc. Vol. en la formentacién. Se realizaron los calculos de ésta variable de acuerdo a la temperatura de ferentacién ya que, de acuerdo a Dharmadhikari (1999), a partir de 1 mol de glucosa se producen 2 moles de etanol y 2moles de diéxido de carbono. Tedrcamente, a producion de etanol en la fermntacin debe ser 51.1% on pso dea ghosa presente de aver ai elacén de Gay Luxeac aed y Cols., 1990) pero en la préctica es un poco menor, aproximadamente 47 2 48% en peso del azar femmentada (Dharmadhikari 1999) por las pédidas dura la fermentacién asi como la formacién de otros productos por los azucares ‘ dleponibios Zoockioin y Cols, 1960)10 %Ale-Vol ‘A Tempera 206 AAV Pome 10 cc0n? © Tenpentea soe every © Tongans 0 SAeaereanconnt ° 2 “0 60 EF 100 120 Tiempoih) Figura 7. Efecto de la temperatura y el tiempo de fermentacién en el contenido de ‘tanol (% Ale. Vol.) durante el proceso de fermentacién de mosto [Link] Carightane. eero ‘Se ha reportado que la produccién de etanol por “Bx varia entre las areas y el afo de produccién (Jones y Ough, 1985). Sin embargo el Equipo de Viticultura y Enologia (Viticulture and Enology Team) de la Universidad Estatal de Washington (WSU) (2004) indica que se puede obtener una ecuacién lineal para estimar la cantidad de alcohol que se formaré durante el proceso de fermentacion, Se realizaron los cdlculos de acuerdo a la temperatura y concentracién de enzimas utlizadas para determinar la cantidad de °Bx necesarios para aumentar 1 % Ale. Vol. Los resultados se muestran en la Tabla 8. Se realiz6 un andlisis de comparacién de medias de Tukey y no se encontraron diferencias entre los tratamientos; los datos son similares a los manejados por la industria de aproximadamente 1.9°Brix por cada 1% Alc. Vol. Se obtuvo una sola expresién matematica expresada de la siguiente manera: WAV =-0.0198-+0.52°Bx donde %AV es el % Ale. Vol., con un coeficiente de determinacién de 0.9909 Acotaldehido, Efecto de la Temperatura de Fermentacién y la Concentracién de Enzima Péctica sobre la produccién de Acetaldehido durante a Fermentacién de Mosto de Uva Carigfiane Se realizé un andlisis dé las curvas para observar la produccién: de acetaldehido con respecto a cada una de las temperaturas y cada una de: las concentraciones de enzima pécticaadicionada. En la Figura 8 se observan las tes curvas dependiendo de la temperatura de fermentacién utilizada, también. se observa las diferencias en los tiempos de fermentacién de cada una de. las temperaturas que a medida que se aumenta la temperatura la concentraciin de acetaldenido aisminuye46 Tabla 8. Efecto de la temperatura y la concentracién de enzima péctica en la produccién de etanol por “Bx. “Temperatura Concentracién de °Brix para producir_ (°c) enaima (iLiKg de wa) 1% Ale. Vol." 20 0 192007 9 1.910.01° 18 1.920.01° Pr 30 ° 1,920.06" 9 1.80.05" ~ 18 1,920.04" 35 ss o 1,920.03" 9 1,920.02" 18 1.94003" * Comparacién de medias de Tukey Valores con la misma letra en una columna no son diferentes a una pe0.06.S ~ ie. ‘eueuBue9 eAn ap o}soW ap UpioEIUaUNa} ap oBe00Nd |e BIUEINp OpIYepIEIzoe 2p Uoibanposd 8} a1Gos sade eUIZUe ap seLOIDeNUSCUOD se} A sesnjeiodwwe} se] ap eUN epeD ep oHe!a “g EINE (y) odwort oz os (oum ap 1 901 /8u) opyyopreieoy ‘uppenvao.e © s *Z ugpenuavey @ ” Suppenuiow WV ov48 Observando el cambio de concentracién del compuesto con respecto a la temperatura de 20°C tenemos que para C2 la ecuacién resultante fue: Acet = 1.18+0.961 ~ 0.00807 donde Acet representa la concentracién de acetaldehido y t el tiempo de fermentacion. La R? para este ajuste fue de 0.8668. Para la concentracién de enzima C; la ecuacién fue: eet = ~0.03-+ 1.031 ~ 0.00907 con R? de 0.9918. CO también se representa con una ecuacién que a continuacién se presenta Acet =1.18+ 1,061 0.0097? con coeficiente de determinacién de 0.8173. En la Figura 9 se muestra la gratica on la que se indican las curvas para las, tres concentraciones de enzima. Se puede observar cada una de las curvas de concentracién de enzima adicionada a la temperatura de 20°C y se aprecia que la variacién en las curvas es poca, es por eso que se puede decir quevla concentracién de acetaliehido no se ve afectada por esta temperatura ni por la concentracién de la enzima péctica. Para la temperatura de 30°C y concentracién de enzima péctica Cy la ecuacién que resulté fue febr = 0.684245 0.051" con FR? de 0.9299. Para C; el cosficiente de determinacién fue 0.83142con ecuacién » Acer 2.330.0577 eteat tera oG0H 60 $ © Terperasa 2 ] ewe 1 0.60008 © Terpeauea 206 Cy so ewgct T8408. 3 G08 20 10 ‘Tiempo (h) Figura 8. Efecto de la temperatura 20°C y la concentracién de enzima péctica ‘sobre la produccién de acelaldehido durante el proceso de fermentacion ‘de mosto de va Carighane. wathPara la concentracién control la ecuacién resultante fue: Acet = 0.3442.251 -0.051" p. TH ‘con costiciente de determinacién de 0.7621. En la Figura 10 podemos observar el comportamiento para las curvas con temperatura de 20°C y con cada una de las concentraciones de enzima péctica adicionadas. En ella apreciamos como el nivel maximo de acetaldehido es ligeramente menor al maximo nivel obtenido en la grafica a la temperatura de 20°C. Esta ligera disminucién del compuesto se puede deber a la volatildad que éste presenta, ya que su punto de ebullicion es de 21°C y la temperatura ullizada fen este caso fue de 30°C, lo que nos indica que el compuesto va desapareciendo fen el transcurso de la fermentacién Para la temperatura de 35°C tenemos que la ecuacién resultante para la ‘concentracién de pectina C2 tue: Acet = 0.2643.58"-0.121 on un coeficiente de determinacion de 0.9290. Para la concentracién de enzima C, tenemos: 2542.94 0.100" el coeficiente de determinacién fue de 0.8475. La ecuacién para CO se presenta a continuacién para la cual se obtevo una R de 0.8619: . * feet = 0.95+3.101-0.10° En la Figura 11 se observan todas las curvas para cada una de. las cconcentraciones de enzima, En esta ultima grifica para acetaldehido se observa como el nivel del compuesto es ligeramente menor a las curvas de la temperatura dde 20°C, haciéndose la misma observacion que se realizé on la temperaturast 70 deen 2 43-008? Tents es 60 elel> 50 Acetaldehido (mg!100 mi de vino) o 10 20 30 40 50 Tiempo (h) Figura 10. Efecto de la temperatura 30°C y la concentracion de enzima péctica sobre la produccién de acetaldehido durante el proceso de fermentacién de mosto de uva Carigfiane.52 ‘Acetaldehido (mg/100 mi de vino) Tiempo (h) Figura 11. Efecto de la temperatura de 35°C y la concentracién de enzima péctica sobre la produccian de acetaldehido dutante el proceso de fermentaci6n de mosto de uva Carighane.. °53 anterior, el compuesto se ve disminuido ya que se presenta pérdida debido a la ‘mayor volatlidad y a la temperatura de fermentacion. Se realizé el analisis para calcular la cantidad real de acetaldehido en todas las muestras, ya que la respuesta del equipo de cromatografia de gases la da en ‘mg/100 mi de alcohol anhidro, para comparar los resultades obtenidos con los ublicados por el trabajo de Lui y Pilone en 2000 donde indican que el nivel maximo permitido del compuesto se encuentra en el rango de 2-212 mg/L, encontrando que ninguna de las muestras se encuentra por arriba de este rango (Tabla 9). Pero de acuerdo a la norma oficial mexicana NMX-V-012-1986, la cual ‘Nos indica que el limite maximo permitido es de 40 mg/100 mi de aleohol anhidro, do 178 datos obtenidos 7 resultaron por arriba de este limite, en donde se observa ‘que 4 son para la temperatura de 20°C, 2 para 30°C y 1 para 38°C, indiedndonos ‘que la concentracion de acetaldehido va disminuyendo de acuerda al aumento de temperatura debido a su volatiidad, Se realizé un analisis de medias de Tukey para observar diferencias entre cada tratamiento en cada una de las temperaturas y de acuerdo a los resultados ‘obtenides no se obtuviaron diferencias significativas entre los tratamientes. > Carbamato de Etilo Validacién del Método Se prepararon esténdares de carbamato de etlo con el propésito de realizar 'a curva do calibracién para a identticacién del tiempo de retoncion y l limite de deteccién del equipo. Los niveles analizados fueron de 30, 50 y 100 ngim! (Fig: 12) yy se doterminé el tiempo de retencién del carbamato de atl a los 10.512 min, El ir de deteccién tue de 20 ng/ml. es decir, fue ol nivel en el cual si se observé * pico, sin embargo, no se pudo cuantifcar. El limite de cuantificacién fue de 308s 16065 140s 12005, 100s, puesta (Vols) 0.4 e004 40004 20 “0 ey 80 100 120 Concentracin (gil Figura 12. Curva de calibracién para la técnica de determinacién de carbamate de eto.56 ngimi. que es el limite maximo recomendado para vinos de uva segin la Asociacion de Bienestar y Salud de Canada (Lau y Cols.. 1987). Se realiz6 la curva de calibracién y se obtuvo un ajuste a una linea recta con una R? de 0.980388, En la Figura 18 podemos observar el cromatograma que muestra el tiempo de retencién del carbamato de etilo y en la Figura 14 se presenta el cromatograma de cerca en donde se observan los picos para cada uno de los niveles utilizados en la curva de calibracién También se realizaron pruebas para determinar la aficiencia de la reaccién de derivatizacién. Se contaminaron muestras con carbamato de ello en las cuales inicialmente estaba ausente el compuesto, a concentraciones conocidas y se ‘obtuvo un porcentaje de recuperacién de 101% lo que concuerda con estudios realizados por Herbert y Cols. (2002). Presencia del Carbamato de Etilo durante el Proceso de Fermentacién De acuerdo a la metedologia utiizada (Herbert y Cols, 2002) no se detects carbamato de etilo en ninguna de las muesttas analizadas, En la Figura 15 se presenta el cromatograma en donde observamos el tiempo de retenciin del ‘compuesto y en la Figura 16 podemos observar que no hay presencia de pico de carbamato de etio para la muestra en andi, Debido a su importancia toxicolégica, el carbamato de elo se ha analizado en vinos de Estados Unidos de América (VEU) y de importaciin (VI) a ese pets, Bluhm (1998) realizo el estudio en el cual encventra que de 114 muestras analizadas para VEU. no detecta ninguna para un nivel mayor d 30 gi! “(nivel 1) de carbamato de etilo, 2 de ella presentan un valor dentro de 20-30 agiml (nivel 2), y para menos de 20 ngiml (nivel 3) un porcontaje de 1.75% delas Muestras se encuentran en este rango. En el caso de VI de 25 musétias analizadas, 4 de elias estuvieron dentro del nivel 1, 1 en elnvel 2 y 20% de las mmuestras se encont an al nivel 3, Lo anterior nos indica que el carbamato deoe ‘epinb)| eyes80}eWO.9 Us ORs Bp oJeWeqUeD ap SelepUPIse Ue UO/OUAe: ep oduel| “E} EINBI l % % At * s x a ZLS'O4 0183 @p OEWEQIED pee , buco evtendeas j ‘eves38 ‘panty eyesBoyeU0.0 vO sopezyun sorepueise ua ojo ap ojewecuee 9p ood jo seyeso: ered oYeUte ap opeIKdLe BivEIBOIELUOID “pL eng jwy6uoe 64 05, 1/54 cot ep ojeweaies“uploejuauiie; sp oseocid je aqueinp % sepewos seusonu wed one ep oieweques eed uo}ouerai ap odway je eorpur anb eWesBoIeLYO!D “GL eiN6i4 (uu) odwon, L s * oN 4 po oma ap creweweg \60 : -uoroequauie} ap osdooud N= ~ Je e1UBINP sew} seIISENW UD oI} Bp o}EUIEGED ep BIoUEse:d Key OU anb eoIPUI anb BWIEIBOWEWIOID “gL BIN: (nw) odtsony l EI % ch ih 4 Ag rN, [ ZN ona @p oreweqes FP lugiouatas ap oda is6 etilo en vinos se encuentra por debajo del nivel establecido como maximo permitido por Canada, por lo que lo hace libre de ese téxico. Presencia del Carbamato de Etilo en Muestras Adicionadas con Urea Se realizé una fermentacién a 30°C en una incubadora adicionando 0.2 gil. de urea al mosto de uva Carignane, esta cantidad se agregé de acuerdo a lo que indica Kodama en 1994 en donde publica que esta cantidad es la maxima permitida de urea en mosto de uva para que no se presente carbamato de etilo en vinos, es por eso que se adicioné esta cantidad, para evaluar si la adicién de urea promovia la presencia del compuesto en el producto final. Se analizaron las muestras adicionadas con urea en el cromatégrafo de liquidos de acuerdo a la metodologia descrita (Herbert y Cols., 2002) y no se detectd presencia de carbamato de etilo en las muestras (Fig. 17). En la Figura 17 se observa el cromatograma de cerca que indica la sefial que el detector proporcioné para la el andlisis de la muestra de mosto adicionada con urea. En ella se observa el tiempo de retencién y no se detecta el pico del compuesto, Indicando que efectivamente no hay presencia de carbamato de etilo en el vino a las condiciones de urea adicionadas, de donde se deduce que esto se puede deber a que las levaduras se desarrollaron tan répidamente, ya que la temperatura de fermentacién fue de 30°C, que no dieron tiempo a que la arginina fuera degradada por las bacterias para producir citrulina para, posteriommente, producir carbamato de etl, 0 que simplemente la urea no tue sufciente para que la arginina produjera el compuesto. ivon {S_Uoo sepejuauues seysenu Ue OMe ep oJEWeGeD ep PIoUese:d Aey ou anb eoipul anb ewesBoyewoiy “21 esnBi4 { eo ee (ora) odors u 4 Sy aN ty 4 wen eisonds rug