TRONCO COMN DIVISIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS Y DE LA SALUD. MDULO: ENERGA Y CONSUMO DE SUSTANCIAS FUNDAMENTALES. PRCTICA No. 2 DETERMINACIN DE PROTENAS.

MTODO DE BIURET

Equipo 2:

FRIAS MORALES JUAN CARLOS MARTINEZ ROMERO DAVID MENDIETA LEDESMA ANA KAREN RAMOS DOMINGUEZ ELVIA ALICIA

GRUPO: BC03A

Determinacin de protenas. Mtodo de Biuret

Objetivo Aprender a manejar el mtodo de Biuret para determinar las protenas, adems de saber determinar el pH sobre las protenas de la leche, y observar las caractersticas de cada procedimiento e identificacin-interpretacin.

Marco terico

COLORIMETRA: Es la ciencia que estudia la medida de los colores y que desarrolla mtodos para
la cuantificacin del color, es decir la obtencin de valores numricos del color.

PUNTO ISOELECTRICO: Todas las macromolculas de la naturaleza adquieren una carga cuando
se dispersan en agua. Una caracterstica de las protenas y otros biopolmeros es que la carga total que adquieren depende del pH del medio.

As, todas las protenas tienen una carga neta dependiendo del pH del medio en el que se encuentren y de los aminocidos que la componen, as como de las cargas de cualquier ligando que se encuentre unido a la protena de forma covalente (irreversible).

Corresponde al valor donde la molcula tiene la misma cantidad de cargas positivas que negativas presentando una carga neta de 0 y la protena presenta su mxima posibilidad para ser precipitada ya que las partculas se agregan. Para calcularlo se deben utilizar los pKa.

(Los pKa a considerar para esta ecuacin, en una tabla de pH, son los que contienen a la especie qumica con carga igual a cero, cuando tienen ms de un pKa). Las molculas complejas, tales como las protenas, se combinan con los iones hidrgeno y con otros iones presentes en la disolucin, dando lugar a la carga neta de la molcula. A la concentracin de iones hidrgeno, o al pH, para el cual la concentracin del ion hbrido de una protena es mxima y el movimiento neto de las molculas de soluto en un campo elctrico es prcticamente nulo, se le denomina punto isoelctrico.

CASEINA: La leche contiene vitaminas (principalmente tiamina, riboflavina, cido pantotico y

vitaminas A, D y K), minerales (calcio, potasio, sodio, fsforo y metales en pequeas cantidades), protenas (incluyendo todos los aminocidos esenciales), carbohidratos (lactosa) y lpidos. Los nicos elementos importantes de los que carece la leche son el hierro y la vitamina C. Las protenas se pueden clasificar de manera general en protenas globulares y fibrosas. Las protenas globulares son aquellas que tienden a agregarse en formas esferoidales y no establecen interacciones intermoleculares como son los puentes de hidrgeno (caractersticos de las protenas fibrosas) siendo solubilizadas en suspensiones coloidales.

En la leche hay tres clases de protenas: casena, lacto albminas y lacto globulinas (todas globulares).La casena es una protena conjugada de la leche del tipo fosfoprotena que se separa de la leche por acidificacin y forma una masa blanca. Las fosfoproteinas son un grupo de protenas que estn qumicamente unidas a una sustancia que contiene cido fosfrico. En la casena la mayora de los grupos fosfato estn unidos por los grupos hidroxilo de los aminocidos serina y treonina. La casena en la leche se encuentra en forma de sal clcica(caseinato clcico). La casena representa cerca del 77% al 82% de las protenas presentes en la leche y el 2,7% en composicin de la leche lquida.

La casena est formada por alpha(s1), alpha(s2)-casena, -casena, y kappa-casena formando una micela o unidad soluble. Ni la alfa ni la beta casena son solubles en la leche, solas o combinadas. Si se aade la kappa casena a las dos anteriores o a cada una de ellas por separado se forma un complejo de casena que es solubilizado en forma de micela. Esta micela est estabilizada por la kappa casena mientras que el alfa y la beta son fosfoprotenas que precipitan en presencia de iones calcio.

BIURET: El Reactivo de Biuret es aquel que detecta la presencia de protenas, pptidos cortos y
otros compuestos con dos o ms enlaces peptdicos en sustancias de composicin desconocida. Est hecho de hidrxido potsico (KOH) y sulfato cprico (CuSO4), junto con tartrato de sodio y potasio (KNaC4O64H2O). El reactivo, de color azul, cambia a violeta en presencia de protenas, y vira a rosa cuando se combina con polipptidos de cadena corta. El Hidrxido de Potasio no participa en la reaccin, pero proporciona el medio alcalino necesario para que tenga lugar.
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Se usa normalmente en el ensayo de Biuret, un mtodo colorimtrico que permite determinar la concentracin de protenas de una muestra mediante espectroscopa ultravioleta-visible a una longitud de onda de 560 nm (para detectar el in Cu2+).

ACIDO ACTICO: El cido actico, o su forma ionizada, el acetato, es un cido que se encuentra
en el vinagre, siendo el principal responsable de su sabor y olor agrios. Su frmula es CH3-COOH (C2H4O2). De acuerdo con la IUPAC se denomina sistemticamente cido etanoico. Es el segundo de los cidos carboxlicos, despus del cido frmico o metanoico, que slo tiene un carbono, y antes del cido propanoico, que ya tiene una cadena de tres carbonos. El punto de fusin es 16.6 C y el punto de ebullicin es 117.9 C

ACETATO DE SODIO: El acetato de sodio, (tambin llamado, etanoato de sodio) es la sal de

sodio del cido actico. Es un producto qumico econmico producido en cantidades industriales para una amplia gama de uso. Planteamiento del problema

Sabemos que las protenas se pueden cuantificar por medio de los mtodos de Biuret, Bradford y BCA , adems de que la determinacin de concentracin es una muestra biolgica la cual nos sirve para el diagnostico de enfermedades. Suponemos que si se realiza adecuadamente las soluciones, podremos realizar adecuadamente la curva de calibracin as como el punto isoelctrico, por lo tanto nos planteamos el siguiente problema Cmo podemos cuantificar las cantidades de protenas de la muestra sin que se salga del rango?

Material

Cristalera Probeta de 50 ml Gradilla

Reactivos Agua destilada Solucin de cido actico 0.1 N Solucin de acetato de sodio 0.1N Solucin de casena (concentracin 4 mg/ml) Reactivo de Biuret 50 ml.
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2 pipetas de 10 ml 3 pipetas de 5 ml Pipeta de 1 ml 12 Tubos de 15 x 100

vaso de precipitados de 100 ml leche en polvo descremada 12 tubos de 16 x 150 1 balanza granataria Papel para film para 10 tubos centrfuga clnica Plumn permanente 2 espectrofotmetros 4 celdas Escobilln para lavar tubos Masking tape Jabn y franela para limpiar

Estrategia Metodolgica

Nuestra estrategia metodolgica se dividi en 4 fases. En la primera se hizo una preparacin de una serie de tubos con solucin amortiguadora de acetatos, para determinacin del punto isoelctrico. En la segunda se llevo a cabo la preparacin de la leche, para posterior uso. En la tercera se elaboro lo del punto isoelctrico de la leche; y por ltimo, se llevo a cabo la interpretacin de la prueba antes hecha mediante el mtodo de Biuret y se limpio el material.

Para la primera fase se rotularon 6 tubos con nmeros consecutivos, posteriormente se adiciono a cada tubo las soluciones cido actico y acetato de sodio como se relatara a continuacin: en el primer tubo (1) se le aadi 5ml de cido actico, el tubo dos se le aadi 4ml de cido actico y 1ml de acetato de sodio, se continuo con el tubo tres en el cual se aadi 3ml de cido actico y 2ml de acetato de sodio, el tubo cuatro le aadimos 2ml de cido actico y 3ml de acetato de sodio, el penltimo tubo(5) se le agrego 1ml de cido actico y 4ml de acetato de sodio, para finalizar con el tubo 6 al cual se le aadi 5ml como en el tubo uno, pero ahora de acetato de sodio (solucin amortiguadora de acetatos).

Para la segunda se llevo a cabo la preparacin de la leche, la cual consisti en disolver 6 gr de leche en polvo descremada, con 50 ml de agua destilada en un vaso de precipitados de 100 ml, para
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continuar, en un tubo de ensaye de 16 x 150 mm se agrego 2 ml de la leche rehidratada preparada como se indic anteriormente, la cual se tomo con una pipeta, y se aadi 8 ml de agua destilada (medida con la probeta), y se agito por inversin. La leche se encuentra diluida (1:5), la cual posteriormente se utilizara (Fase tres).

En la tercera fase se realizo el punto isoelctrico de la leche diluida en el fase dos, se aadi 1 ml de la leche diluida (1:5) a cada tubo (6) de solucin amortiguadora que se preparo en la fase 1, se mezclo de nuevo por inversin y se dejo reposar por 10 minutos (se observaron como grumos, ese era el punto isoelctrico), se centrifugo los tubos a 2500 r.p.m. durante 10 minutos. Se separo el sobrenadante y se coloco en tubos limpios.

Para la cuarta y ltima fase se llevo a cabo la determinacin de las protenas por medio del mtodo de Biuret, en primer lugar en una gradilla se colocaron 11 tubos de 16 x 150 mm, los cuales se rotularon; uno de ellos como nmero cero, el cual llevaba los reactivos para calibrar el espectrofotmetro (blanco de reactivos o testigo), los tubos siguientes (4) llevaban nmeros consecutivos del 1 al 4 y los restantes (del 1 al 6) se rotularon con el nmero que corresponda a los sobrenadantes obtenidos por centrifugacin como se indic en la fase 3, para continuar se aadi a cada tubo los reactivos para determinar protenas en la curva de calibracin (tubos I a IV) y en los sobrenadantes (tubos 1 a 6) de acuerdo a lo indicado en la siguiente tabla:

CURVA DE CALIBRACIN Tubo Solucin Patrn 4 mg/ml Sobrena dante Sobrena 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.5 0 0 0 0 ml I 0.2 ml II 0.4 ml III 0.6 ml IV 0.8 ml V 1 ml 1 2

TUBOS PROBLEMA 3 4 5 6

0 0

0 0

0 0

0 0
6

0.5

dante Sobrena dante Sobrena dante Sobrena dante Sobrena dante Agua Reactivo de Biuret (ml) 0 0 0 0 0 0 0 0 0.5 0 0 0

0.5

0.5

0 1 ml

0 0.8 ml

0 0.6 ml

0 0.4 ml

0 0.2 ml

0 0 ml

0 0.5 ml

0 0.5 ml

0 0.5 ml

0 0.5 ml

0 0.5 ml

0.5

0.5 ml

4.0 ml a todos los tubos

Hiptesis Si realizo adecuadamente las soluciones de acetatos, para determinacin del punto isoelctrico y adems llevo a cabo bien el procedimiento de la leche, entonces podremos realizar el mtodo de Biuret y llevar a cabo la realizacin de la curva de calibracin bien.

Si no realizo adecuadamente las soluciones de acetatos, para determinacin del punto isoelctrico y adems llevo a cabo bien el procedimiento de la leche, entonces no podremos realizar el mtodo de Biuret y llevar a cabo la realizacin de la curva de calibracin bien.

Resultado Al usar el espectrofotmetro, los valores que se obtuvieron (D.O) estn registrados en la siguiente tabla:

Tubo D.O Mg. De Protena

II

III

IV

6 0.023 0

0.020 0.031 0.8 1.6

0.052 0.063 0.021 0.004 0.006 0.005 0.022 2.4 3.2 0 0 0 0 0

Calcula el contenido proteico de los tubos I al IV de acuerdo al volumen empleado de la solucin en estndar de casena y colcalos en el eje X. Coloca los valores de O.D. obtenidos para cada uno de estos tubos en el eje Y, y traza la curva correspondiente.

Interpolacin de datos

Formulas.

y= m x+ b

Y= contenido proteico m = pendiente

xy- xy m= x2 - ( x)2 n n

b = constante x = absorvancia La absorvancia son los valores que muestra el espectrofotmetro.

b= y - x m

xy

xy n

R= x2 ( x)2 y2 (y)2 n

Y 0.020 0.031 0.052 0.063

X 0.8 1.6 2.4 3.2

X*Y 0.016 0.0496 0.1344 0.2016

X2 0.64 2.56 5.76 10.24

Y2 0.0004 0.000961 0.002704 0.003969

9

 0.166

1344.2675

19.2

0.008034

(y)2 = 0.027556

(x)2 = 64

= 0.00665

=2

xym=

xy n

x2 - ( x)2 n

1344.2675 - (0.166) (8) m= 19.2 64 4 4

1344.2675 0.332 m= 19.2 16 y= m x+ b

1343.9355 = 3.2 = 419.9798

y1= (0.0525) (0.020) + (-0.0385) y1= -0.03745

y2 = (0.0525) (0.031) + (-0.0385) y2 = -0.0368725

10

y3 = (0.0525) (0.052) + (-0.0385) y3 = -0.03577

y4 = (0.0525) (0.063) + (-0.0385) y4 = -0.0351925

xy

xy n

R= x2 ( x)2 y2 (y)2 n

1344.2675 (8) (0.166) 4 R= 19.2 (64 / 4) 0.008034 (0.027556/ 4)

1344.2675 0.332 R= 3.2 0.001145

1344.2675 0.332 R= (1.788854382) (0.03383784863)

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1344.2675 0.332 R= 0.0605309838

1343.9355 R= 0.0605309838 Valores de O.D. de los tubos 1-6 , en el cual se calculo la cantidad de protena presente en cada sobrenadante. = 22202.43941

Protena Sobrenadante 1 Sobrenadante 2 Sobrenadante 3 Sobrenadante 4 Sobrenadante 5 Sobrenadante 6

mg/ml (0.021) (5) = 0.105 (0.004) (5) = 0.02 (0.006) (5) = 0.03 (0.005) (5) = 0.025 ( 0.022) (5) = 0.11 (0.023) (5) = 0.115

mg/100ml (0.105) (100) =10.5 (0.004) (100) =2 (0.006) (100) = 3 (0.005) (100) = 2.5 (0.022) (100) = 11 (0.023) (100) = 11.5

Haciendo uso de la ecuacin de Heenderson Haselbach se calcula el pH del tubo donde observaste la mayor precipitacin de casena.

pH = pK + log [A-]/[AH]

Ecuacin de Heenderson Haselbach.

pK de acido actico = 4.76

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log [A-]/[AH]

= log 2ml/5ml = log 0.4 = -0.3979

pH = pK + log [A-]/[AH] = 4.76 +(-0.3979) =

4.3621

Conclusin De acuerdo a los resultados que se observan en dicha prctica, Si realizo adecuadamente las soluciones de acetatos, para determinacin del punto isoelctrico y adems llevo a cabo bien el procedimiento de la leche, entonces podremos realizar el mtodo de Biuret y llevar a cabo la realizacin de la curva de calibracin bien.

Consideramos que esta investigacin nos lleva a proponer que, con el experimento realizado con anterioridad para la elaboracin de dicho reporte, nosotros vamos aprender la separacin de una protena (casena) a partir de una disolucin de leche, esta protena es muy importante, la cual forma el 80% de las protenas en la leche de vaca, y como fue aceptada la hiptesis quiere decir que el trabajo se realizo bien dicha practica, porque los resultados obtenidos en los tubos de concentracin de casena y los sobrenadantes fueron ptimos. En el caso de los tubos con concentracin de casena denominados del I al IV, estos tubos nos sirvieron para determinar la curva demostrada en los resultados.

Las implicaciones para la vida cotidiana de este estudio nos va a servir para nuestro estudio en la carrera elegida, porque nos puede servir para el diagnostico de enfermedades, les sirve a los doctore, qumicos, veterinario, etc.

Bibliografa 1) Miller D.D. 2001. Qumica de Alimentos, Manual de Laboratorio. Limusa Wiley, Mxico. 2) Garritz and Chamizo J. A. Tu y la qumica, cidos y bases, Edicin 1, publicado por: Pearson Prentice hall 2001, 808 pginas. 3) Pea Daz Antonio, Bioquimica, Edicin 3, publicado por: Pearson Educatin, 1998 4) Bradford MM (1976): A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72: 248-254.
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