LABORATORIO DE BIOQUÍMICA 502507

GUIA No 2- Desnaturalización de proteínas

1. EL PROBLEMA.

Identificar los diferentes factores que afectan la estabilidad de las proteínas.

2. FUNDAMENTO TEÓRICO

DESNATURALIZACIÓN DE PROTEÍNAS

La desnaturalización consiste en el desdoblamiento total o parcial de la conformación nativa de una cadena

polipeptídica o una proteína. Consiste en romper las fuerzas que estabilizan la estructura secundaria, es decir, los puentes
de hidrógeno entre enlaces peptídicos y/o terciaria o cuaternaria, como las fuerzas esquematizadas en la figura 1.

Las proteínas tal como se encuentran dentro de las células o en los fluidos corporales, tienen una conformación nativa y
se encuentran solubilizadas en soluciones o suspensiones coloidales, si se producen ciertas alteraciones en las
condiciones del medio acuoso, las proteínas se desdoblan pierden solubilidad y precipitan o coagulan.

Un ejemplo esquemático para representar la desnaturalización de las proteínas es el que se representa en la figura 2.

Figura 2.
a) Desnaturalización de la ribonucleasa: cuando se trata esta enzima con β-mercaptoetanol (agente reductor) en urea 8 M
(sustancia polar), se reducen los puentes disulfuro, se rompen las interacciones débiles, pierde su estructura nativa terciaria
y con ello su actividad enzimática. Aparecen en el mismo color los residuos de cisteína involucrados en los puentes
disulfuro.
b) Renaturalización de la ribonucleasa: cuando se elimina por diálisis la urea y el β-mercaptoetanol, poco a poco se
establecen de nuevo las interacciones débiles y los puentes disulfuro (estos últimos se oxidan por el oxígeno presente en
el aire atmosférico) se recupera la estructura nativa y con ello la actividad catalítica.

La desnaturalización ocasiona cambios profundos en las propiedades fisicoquímicas biológicas de las proteínas, entre los
más frecuentes se encuentra la pérdida de la solubilidad, el aumento de la viscosidad, etc. Este fenómeno también implica
por lo tanto una destrucción en mayor o menos grado de las uniones responsables de la conformación de las proteínas,
así no se lleve a cabo hidrólisis en los enlaces peptídicos.

La desnaturalización es un procedimiento que se aplica frecuentemente en la industria de los alimentos, por ejemplo, la
inactivación térmica de las enzimas para evitar el pardeamiento o la fermentación, la desnaturalización controlada para
modificar la textura y el sabor de algunos alimentos procesados, el ablandamiento de la carne por envejecimiento o
sazonado, la formación de geles en la industria de la confitería y derivados de frutas, la coagulación de la caseína en la
obtención de quesos, entre otros.

3. MATERIALES Y REACTIVOS.

Material por grupo

• Veinte tubos de ensayo

• Dos gradillas para 20 tubos de ensayo
• Tres pipetas graduadas de 5.0 ml
• Pinza para tubo de ensayo
• Propipeta

Material y reactivos generales. (Volúmenes calculados para diez grupos de laboratorio)

• Ácido clorhídrico 1.0 N (50ml)

• Sulfato de amonio al 25% (200ml)
• Etanol 96% (120ml)
• Solución de acetato de plomo 0,1 M (50ml)
• Hidróxido de sodio 20% (50 ml)
• Reactivo de milón (60 mL): disolver 1g de mercurio en 1mL de ácido nítrico concentrado, calentar suavemente, dejar
enfriar, y completar a 60 mL con agua.
• Reactivo de Biuret (100ml)
• Reactivo de Hopkins cole (FRESCO): ácido acético impurificado con trazas de ácido glioxílico (50ml)
• Ácido nítrico concentrado (50ml)
• Hidróxido de sodio 40% (50 ml)
• Solución de tirosina al 0,1% en agua acidulada(120ml).
• Solución de fenilalanina al 0,1% en agua acidulada (120ml).
• Solución de triptófano al 0,1% en agua acidulada (50ml).
• 5 vasos de precipitados de 50ml
• 6 goteros plásticos

Cada reactivo debe tener su gotero debidamente marcado y un vaso de precipitados de 50ml donde colocarlo, para evitar
que el mesón se contamine o se ensucie con los reactivos.
Muestras de análisis.
Su profesora le asignará muestras de entre las siguientes posibles y le informará con la debida anterioridad:

- BSA (albúmina sérica bobina): BSA al 3% en NaCl al 0,9% (200mL)

- Peptona al 3% en NaCl al 0,9% (200mL)

- Solución de lactosuero: se lleva 150 mL de agua a 38°C, se añade 50 mL de leche descremada calentada a la
misma temperatura, luego se añade gota a gota y agitando ácido acético 2M hasta la máxima precipitación (7
mL de ácido aprox.). Se deja enfriar y decantar, separando la fase líquida (lactosuero) y se descarta la fase
sólida (caseína).
- Gelatina sin sabor en NaCl al 0,9% (200ml).
- Clara De Huevo 1: 3 en NaCl al 0,9% (200ml).
- Yema De Huevo 1:1 en NaCl al 0,9% (200ml).
- Leche Cruda de vaca (200ml FRESCA traída el mismo día de la práctica).
- Suplemento dietario: Protizyme banana creme (metabolic nutrition) al 2% en NaCl al 0,9% (200ml)
- Caseína en NaOH al 1% (200ml).

4. BIBLIOGRAFÍA.

- Aspectos teóricos relacionados con el laboratorio de Bioquímica. (1991). Medellín: Politécnico Colombiano Jaime
Isaza Cadavid.
- Cheftel, J. (1989). Proteínas alimentarias. Zaragoza: Editorial Acribia.
- Plummer, D. (1981).Bioquímica Práctica. México: Editorial Mc Graw Hill Latinoamericana.
- Rentina, G. (1974 ).Técnicas de Bioquímica aplicada. México: Editorial interamericana.

PREINFORME Y REQUISITOS DE INGRESO AL LABORATORIO

Nombre: _______________________________________________________ Grupo: _____________________

5. TEMAS DE CONSULTA: (se evaluará en el quiz del laboratorio)

5.1. Diseñe una tabla con el nombre de sus muestras (son dos), teniendo en cuenta la información que se muestra en la
siguiente tabla.
a. Nombre de la muestra.

b. Indique si la muestra está formada por una sola proteína (proteína aislada), o si es una mezcla de proteínas o mezcla
de péptidos.

c. Si está compuesta de varias proteínas realice una lista de las proteínas constituyentes, si es una sola proteína consulte
su clasificación por solubilidad en globulares o fibrosas (si son globulares especifique: albúminas, globulinas, glutelinas,
gliadinas, etc); y si son péptidos consulte la procedencia.

d. Si la muestra está compuesta con otras biomoléculas, indique el porcentaje de cada uno de ellos (% proteína,
%carbohidratos, %lípidos, etc)

e. Coloque la composición de aminoácidos de la muestra (preferiblemente en porcentaje) y resalte o subraye los

aminoácidos esenciales presentes.

*Recuerde escribir la bibliografía en donde saca la información de la tabla*

 A. B. C. D. Aminoácidos presentes
Muestra Tipo de proteína o Lista de proteínas Composición (%)
péptido presentes y/o porcentual
características

5.2. Teniendo en cuenta la composición de aminoácidos y conociendo cuáles son los aminoácidos esenciales, indique y
justifique cuál de las dos muestras es más completa desde el punto de vista nutricional.
5.3. ¿Cuáles son los tipos de cambios físicos que se esperan para evidenciar que hay desnaturalización de una proteína?
5.4. Consulte y explique con figuras qué es solubilización y precipitación por salado.
5.5. Complete la siguiente tabla con información referente a las pruebas de identificación de aminoácidos.

PRUEBA Que identifica, ¿para qué ¿Cómo se observa la Reacción química*

se usa? identificación positiva?
Biuret

Millón

Xantoproteica

Hopkins Cole

* Colocar la reacción, si es muy grande utilice una hoja anexa*

REQUISITO DE INGRESO AL LABORATORIO

6. Fichas técnicas. (Propiedades de los reactivos a usar en el laboratorio)

Nombre Fórmula Aspecto Peligrosidad* Desechos

(metales pesados, orgánicos, ácidos,
básicos)
Ácido
clorhídrico
Etanol

Hidróxido de
sodio
Sulfato de
amonio
Ácido nítrico

Mercurio

Acetato de
plomo
*
Indique la peligrosidad con el símbolo correspondiente: explosivo (E), comburente (O), inflamable (F), extremadamente
inflamable (F+), tóxico (T), muy tóxico (T+), corrosivo (C), nocivo (Xn), irritante (Xi) y/o peligroso para el medio ambiente
(N).
7. PROCEDIMIENTO. (Diagramas de flujo)

Recuerde tomar registro fotográfico, claro, de todos los resultados obtenidos en los tubos, debidamente etiquetados con
su nombre, la muestra y el agente desnaturalizante ó el reactivo de reconocimiento.

7.1. RECONOCIMIENTO DE AMINOACIDOS Y PROTEÍNA

1. Reconocimiento de proteínas.
Numere dos tubos de ensayo y adicione a cada uno 2 mL de las muestras de prueba asignadas por su profesora , luego
agregue a todos los tubos 2 mL de reactivo de Biuret, agite fuertemente, observe lo que sucede y regístrelo en su tabla de
datos.

[Link]ón de millón
Numere cuatro tubos, en dos de estos tubos colocar 3 mL de una de las dos muestras diferentes asignadas, en el tercero
adicione 3mL de solución de fenilalainina, y en el cuarto 3mL de solución tirosina, enseguida agregar a todos los tubos 1
mL de reactivo de Millón, calentar en baño de agua a ebullición por 10 minutos( el calentamiento excesivo puede hacer
que se pierda el color), observar lo que sucede y registrarlo en su tabla de datos.

3. Reacción xantoproteíca
En cuatro tubos de ensayo rotulados como: fenilalanina, tirosina y muestras. Agregue a cada tubo en el siguiente orden
3ml de la solución acuosa correspondiente al rótulo, adicione 1 ml de HNO 3 concentrado y caliente al baño maría a
ebulliciòn. Luego enfrié en gradilla y enseguida en un baño con agua –hielo y adicione gota a gota una solución de NaOH
al 40% agitando cuidadosamente y en frío. Observar.
4. Reacción de Hopkins Cole
En tres tubos de ensayo rotulados como: triptófano, y muestras. Agregue a cada tubo en el siguiente orden 2ml de solución
acuosa correspondiente al rótulo y adicione 2 ml del reactivo de Hopkins Cole. Mezcle bien el contenido y adicione a cada
tubo por las paredes lenta y cuidadosamente, sin mezclar, 1 mL de ácido sulfúrico concentrado, observe la formación de
un anillo en la interfase.

7.2. PROCEDIMIENTOS DE DESNATURALIZACIÓN:

1. Desnaturalización térmica:
Tomar dos tubos de ensayo y en cada uno colocar 3 mL de la solución acuosa de una muestra diferente, calentar al baño
maría en ebullición, antes verificar que el agua se observe realmente en ebullición y observar si se presenta algún cambio.

2. Desnaturalización por pH extremo:

Tomar dos tubos de ensayo y en cada uno colocar 3 mL de la solución acuosa de una muestra diferente, luego en cada
uno adicionar 0,5ml de ácido clorhídrico 1.0N y observar.

- Tomar dos tubos de ensayo y en cada uno colocar 3 mL de la solución acuosa de una muestra diferente, luego en cada
uno adicionar 0,5ml de NaOH al 20% y observar.
3. Precipitación por sales:
Tomar dos tubos de ensayo y en cada uno colocar 3 mL de la solución acuosa de una muestra diferente, y en cada uno
adicionar gota a gota, con agitación suave, la solución de sulfato de amonio al 25% hasta observar algún cambio. Si el
cambio se produce continúe agregando la solución de sulfato de amonio hasta lograr una redisolución. Observar y anotar
los resultados.

4. Desnaturalización por presencia de solventes orgánicos:

Tomar dos tubos de ensayo y en cada uno colocar 3 mL de la solución acuosa de una muestra diferente, adicionar 3ml de
etanol al 96%, agitar y dejar en reposo. Observar.

5. Desnaturalización por metales pesados:

Tomar dos tubos de ensayo y en cada uno colocar 3 mL de la solución acuosa de una muestra diferente, adicionar gota a
gota (hasta 10 gotas) la solución de acetato de plomo 0,1 M, agitar y dejar en reposo. Observar.
 INFORME

Nombre___________________________________________________________ Grupo____________

1. Tablas de datos:

Diseñe una tabla con las fotos de cada una de las pruebas o experimentos, recuerde que cada foto debe estar debidamente
identificada en cuanto a prueba y contenido. Si es posible coloque la intensidad de la prueba en comparación entre los
resultados de cada uno, usando la nomenclatura de una (+) para prueba positiva y (-) para prueba negativa. (con intensidad
por +/++/+++).

2. Discusión de resultados.

- Para cada una de las muestras analizadas (por grupo son dos muestras) redacte un párrafo (máximo dos párrafos) en el
que relacione la composición de aminoácidos y las pruebas de identificación de alguno de ellos; incluya la prueba de Biuret
en el análisis.
- Para cada prueba de desnaturalización de proteínas, describa en un párrafo sobre que muestra(s) se evidenció o no la
desnaturalización y cuáles son los enlaces o las interacciones que se afectan, indique si el agente desnaturalizante altera
la estructura secundaria, terciaria y/o cuaternaria. Recuerde explicar tanto las pruebas positivas como las negativas.

3. Bibliografía.

Redacte la bibliografía correspondiente a las citas hechas en normas APA y en orden alfabético (recuerde que no citar es
plagiar).