Técnicas de Hibridación y Sondas
Técnicas dehibridación
Las técnicas de hibridación se utilizan para detectar secuencias concretas
bien de ADN o ARN, mediante el uso de sondas marcadas
Hibridación: propiedad de los acs nucleicos que consiste en la unión de 2 cadenas
de ADN o ARN por la complementariedad de sus bases nitrogenadas, dando lugar
a una molécula bicatenaria.
Sonda: muestra de ADN en la que parte de sus nucleótidos han sido modificados
y marcados en el laboratorio que será complementaria a la secuencia que se
quiera identificar. (Secuencia diana)
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Sonda
Secuencia diana
ApLicaciones deLa hibridación
1. Diagnóstico de enfermedades: cuando hay patologías por deleciones,
duplicaciones…etc la hibridación puede detectar este problema ya que
no se producirá correctamente.
2. Identificación de microorganismos: se pueden detectar virus
y bacterias mediante hibridación con sondas que contengan
secuencias del genoma del microorganismo.
3. Cuantificar la cantidad de ARNm de un gen particular para
comprobar si su expresión esta alterada.
4. Comprobar si hay relación evolutiva entre distintas especies.
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Tipos deHibridación
• Hibridación en solución: Se realiza en medio liquido es muy sencilla y
rápida sirve para cuantificar la cantidad de acs nucleicos de la muestra.
(PCR)
• Hibridación en soporte sólido: extracción de ADN y se fija en
una membrana sólida sobre la que se realiza la hibridación. (Southernblot y
Northernblot)
• Hibridación in situ: no es necesario extraer los acs nucleicos si no que se
desnaturalizan e hibridan en la misma muestra.
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Fases de la hibridación
Preparación o extracción de la muestra
Añadir la sonda marcada
Se produce la hibridación por unión de la sonda con las
secuencias complementarias
Lavado de la sonda no unida para eliminar sobrante
Detección de la sonda para comprobar si ha habido
unión
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Condiciones de La hibridación
Según las condiciones que se den para llevar a cabo la hibridación determinarán
que la unión de la sonda sea más o menos específica ya que podrán unirse a su
secuencia diana o bien a secuencias que sean muy parecidas a la diana.
• Condiciones restrictivas: solo se unirán las secuencias totalmente homólogas
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• Condiciones permisivas: se puede producir la unión con secuencias
similares
El conjunto de estas condiciones se denominan→ Condiciones de
exigencia de identidad o astringencia
Condiciones de La hibridación
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Condiciones deLa hibridación
• Temperatura: a más temperatura mayor especificidad.
• Fuerza iónica: a mayor fuerza iónica, menor especificidad.
• Características de la sonda: un mayor tamaño de la sonda
favorece la hibridación.
En la solución de hibridación se pueden añadir otros compuestos como
la formamida que permite bajar la temperatura de hibridación a unos
20º-30ºC o la heparina que incrementa la concentración efectiva de la
sonda
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Tipos desonda ymarcaje
• Sondas marcadas con isótopos radiactivos: Se incorpora el isotopo
radiactivo a los nucleótidos trifosfato en el grupo fosfato y a partir d
ellos se sintetiza la sonda.
• Sondas marcadas con moléculas fluorescentes: Se incorpora una
molécula fluorescente (fluoresceína)a la BN del nucleótido y al
formar la doble hélice se queda en el exterior.
• Sondas marcadas con enzimas: Se incorpora al nucleótido un
enzima que cataliza la reacción que permite la detección se suelen
utiliza la fosfatasa alcalina y la peroxidasa.
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Hibridación FISH
La técnica de laboratorio conocida
como Hibridación Fluorescente In Situ
(FISH) se utiliza para identificar y
localizar secuencias específicas de ADN
dentro de un cromosoma.
En este método, todos los cromosomas
de un individuo se fijan en una lámina
similar a un portaobjetos, y luego se
exponen a una sonda, que es una
pequeña cantidad de ADN purificado
marcado con un colorante fluorescente.
Esta sonda fluorescente busca y se
adhiere a su secuencia complementaria
correspondiente. Sesión 20/01/2022 12
Hibridación FISH
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Sondas FISH
Sondas de hibridación in situ fluorescente en cromosomas, suelen ser
mas grandes ya que nos permiten detectar cromosomas o fragmentos
de ellos o también se pueden utilizar mezclas de sondas mas pequeñas
para marcar una porción grande del cariotipo o incluso marcar
cromosomas enteros y poder observar si presentan anomalías.
Aunque son sondas mas complejas en su composición su
funcionamiento es el mismo que las sondas sencillas
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Sondas FISH
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Tipos desondas Fish
• Sondas centroméricas o de ADN satélite: hibridan con
secuencias repetitivas de los satélites que se encuentran en los
centrómeros (ADN satélite→ secuencia de ADN altamente
repetitiva que se encuentra en la heterocromatina cerca de los
centrómeros)
• Sondas para cromosomas completos: son complementarias a
cada cromosoma y permiten detectar aberraciones
cromosómicas
• Sondas subteloméricas: hibridan con los telómeros de los
cromosomas
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Tipos desondas Fish
• Sondas de secuencia única: hibridan con secuencias
cromosómicas muy concretas de una banda o un gen. Se usan
para detectar anomalías específicas.
• Sondas de pintado cromosómico: están formadas por
colecciones de secuencias cromosómicas que hacen que cada
cromosoma aparezca marcado de un color.
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SouthernbLot
MoLecuLar
Es una técnica de hibridación que nos
permite identificar fragmentos de
ADN separados en electroforesis en
gel de agarosa, y transferidos a una
membrana de Nylon.
Es necesario la extraccion del ADN
que será digerido mediante enzimas
de restricción
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SouthernBLot
1. Digestion→Se digiere el ADN con enz. de restricción: El objetivo es
trocear el ADN Inicial en fragmentos de distintos tamaños
2. Electroforesis→Se separan los fragmentos mediante una
electroforesis: esto nos permitirá observar el patrón de bandas
obtenido tras la digestión.
3. Transferencia del ADN a la membrana→ paso necesario para
obtener una réplica exacta del patrón de bandas del gel sobre
una membrana de nylon
Pasos: - Desnaturalización del ADN, es necesario separar las
cadenas para que la sonda pueda hibridar.
-Se desnaturaliza con una solución de NaOH
-Se neutraliza con tampón a PH neutro.
- Lavado del gel con solución de lavado (fosfato + EDTA)
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SouthernBLot
- Transferencia, se transfiere el ADN desnaturalizado del gel a la
membrana por capilaridad.
4. El filtro se incuba con una sonda marcada
- Se incuba con una solución de prehibridación con el fin de evitar
uniones inespecíficas
- Se incuba con la solución de hibridación que porta las sondas marcadas
5. Finalmente se lava para eliminar los restos de sonda no unidos
6. La sonda se habrá unido a los fragmentos complementarios y se
detectan por el método conveniente según la sonda
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ApLicaciones deLSouthernbLot
• Detectar mutaciones que afecten a un sitio de restricción.
• Detectar alteraciones cromosómicas estructurales que puedan
alterar el tamaño de un fragmento ya que estas variaciones
pueden ir ligadas a alguna enfermedad o trastorno genético.
• Estudiar la estructura y función de los genes.
• Estudio de la huella genetica.
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NorthernBLot
• Es una técnica casi igual a la anterior solo que en este caso se utiliza
para identificar ARN.
• Se diferencia de la anterior en la que al extraer el ARN no se realiza
digestión de ningún tipo y en que en la electroforesis se utilizan agentes
desnaturalizantes como por ejemplo el formaldehído.
• Hay que cuidar mucho las condiciones en las que se realiza ya
que el ARN es muy volátil y se degrada fácilmente.
• Se utiliza para el estudio de la expresión génica
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Microarrays
Microarrays de ADN o Chips de ADN: son colecciones de distintas sondas
fijados a un soporte solido
Se utilizan para detectar la expresión de miles de genes simultáneamente,
detección de alteraciones genómicas a gran escala (en todo el genoma)
Hay 2 diferencias con las 2 técnicas anteriores:
1. Lo que se une al soporte solido es la sonda y no la muestra.
2. Se marca el ac nucleico de la muestra no hay que extraerlo.
Siempre se va a utilizar un marcaje por fluorescencia, ya que esto nos permite
detectar varias señales al mismo tiempo
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Microarrays
Un array es una cuadricula que esta formada por
puntos y cada uno de ellos tiene una sonda
diferente.
Cada soporte solido puede tener hasta 8 arrays y
cada uno de ellos tiene una colección completa de
sondas de esta forma podemos analizar tantas
muestras diferentes como arrays tenga el soporte.
Se denominan microarrays o macroarrays(en
desuso) segun la
cantidad se sondas que lleve cada array y su
amplitud
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Aplicaciones de losMicroarrays
• Hibridación genómica comparada: permite detectar alteraciones en la
secuencia en poblaciones celulares. Ej células cancerígenas.
• Estudios de expresión génica: se pueden realizar estudios de expresión
de miles de genes a la vez en poblaciones celulares.
• Estudio a gran escala de polimorfismos y mutaciones de gran
repercusión en el diagnóstico y pronóstico de algunas enfermedades.
• Detección de microorganismos contaminantes de muestras biológicas.
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Microarrays
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