FBCB-UNL Bioquímica Básica de Macromoléculas Guía de coloquios 2020
Proteínas. Niveles estructurales, funciones, plegamiento y desnaturalización.
1. ¿Qué entiende por aminoácido proteico y no-proteico? De ejemplos e indique qué funciones
biológicas cumplen cada uno. ¿Qué características tienen los aminoácidos que conforman una
proteína? ¿Son importantes la estructura y características comunes de los aminoácidos para las
propiedades de las proteínas? ¿Qué otras funciones biológicas cumplen los aminoácidos además
de ser los sillares de los polipéptidos?
2. ¿Qué son los péptidos? ¿Conoce algún péptido con funciones biológicas? Químicamente, ¿qué
tipo de enlace es el que establece la existencia de un péptido? ¿Qué enlaces covalentes pueden
poseer además del peptídico?
3. ¿Qué son las proteínas? ¿Qué funciones cumplen? ¿Qué enlaces covalentes pueden poseer
además del peptídico? ¿Qué compuestos químicos o grupos orgánicos no peptídicos pueden
formar parte de la estructura funcional en proteínas conjugadas? Dada la estabilidad del enlace
peptídico, ¿cómo se puede romper?
4. ¿Qué grupos químicos le confieren la carga a las proteínas? Asumiendo un pH 7 en el medio
intracelular, ¿cuáles le conferirán carga negativa y cuáles carga positiva? (suponga que los pKa
de los aminoácidos no se alteran por estar insertos en el estructura macromolecular).
5. ¿De qué depende la característica hidrofóbica o hidrofílica de un aminoácido? ¿Cómo se
puede evaluar? ¿Qué es y qué utilidad tiene el diagrama de hidropatía de un polipéptido?
6. Defina estructura primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria; indicando el tipo de
interacciones (y el grado de importancia) que contribuyen a mantener cada una de ellas.
7. ¿Qué tipos de estructuras secundarias conoce? ¿Qué ángulos definen fundamentalmente la
estructura secundaria? ¿Qué representan los gráficos de Ramachandran?
8. ¿Se pueden predecir las estructuras secundaria y terciaria de una proteína?
9. ¿Qué se entiende por dominio, qué por subunidad y qué por cadena polipeptídica?
10. ¿Hay alguna correlación entre los distintos niveles estructurales que tiene una proteína?
Describa brevemente el experimento de Anfinsen.
11. ¿Qué procesos pueden ocurrir durante el plegamiento in vivo de una proteína? ¿Qué
modificaciones post-traduccionales pueden producirse? ¿Qué son las chaperonas? ¿Qué son los
cuerpos de inclusión? ¿Qué son los priones?
12. ¿Qué condiciones pueden conducir a la desnaturalización de una proteína? ¿Qué propiedades
macromoleculares se alteran?
13. ¿Qué se entiende por estado nativo de una proteína? ¿Qué evidencias permiten suponer que el
estado nativo es el termodinámicamente más estable?
14. ¿Qué efectos produce el cambio de pH sobre la estructura proteica? ¿Puede un cambio de pH
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producir pérdida de funcionalidad sin que haya desnaturalización de la proteína? ¿Por qué en
general todas las proteínas se desnaturalizan a valores de pH extremos? Trace una curva típica de
la solubilidad en función del pH y otra en función de la fuerza iónica. Los efectos solubilizantes
y precipitantes, ¿son independientes del tipo de sal utilizada? Cuando se precipita con sulfato de
amonio, ¿se desnaturaliza la proteína? ¿Por qué generalmente se utiliza sulfato de amonio en
lugar de cloruro de amonio o de cloruro de sodio en el fraccionamiento de proteínas por
precipitación salina?
15. Describa los métodos que conoce para cuantificar proteínas en solución, analizando los
fundamentos e interferencias más importantes.
Problemas
1. a) Escriba, usando el código de una letra*, cinco pentapéptidos posibles que contengan (uno
de cada uno por vez) los aminoácidos Pro, Ala, Cys, Phe y Leu. b) ¿Cuántos pentapéptidos
totales hay con tales características? c) Utilizando los valores de la tabla encontrada en*,
¿cuántos pI distintos encontraría si determinara los mismos para todos los pentapéptidos
posibles? y ¿cuántos del total de pentapéptidos tienen igual pI? *Puede encontrar los códigos y
los valores de pKa en el sitio: [Link]
center/[Link]
2. La hemoglobina no-simbiótica de plantas es una proteína conjugada de estructura
homodimérica y masa molecular 39,6 kDa. El grupo prostético (grupo hemo) contiene Fe y el
mismo constituye el 0,282% en peso de la holo-proteína ¿Cuántos átomos de Fe contiene la
hemoglobina no-simbiótica de vegetales?
3. Un estudio para determinar si existen diferencias estructurales entre la enzima ADP-glucosa
pirofosforilasa (ADP-GlcPPasa) proveniente de la bacteria Escherichia coli (Eco) y de la especie
vegetal Arabidopsis thaliana (Ath) arrojó los siguientes resultados:
I. Las proteínas eluyeron de una columna de Superdex 200 con Ve de 14,32 ml (EcoADP-
GlcPPasa) y 14,28 ml (AthADP-GlcPPasa). Para la columna de Superdex 200 se determinaron
valores de Vo y Vt de 11,0 ml y 23,0 ml, respectivamente, mientras que el calibrado de la
columna se muestra en la tabla:
Proteína Tiroglobulina Ferritina Aldolasa Conalbúmina Ovalbúmina
MM (kDa) 669 440 158 75 44
Ve (ml) 11,22 11,74 15,33 17,13 18,06
II. Al realizar electroforesis de las proteínas en gel de poliacrilamida en condiciones nativas
(PAGE) y desnaturalizadas con dodecil-sulfato de sodio (SDS-PAGE) se obtuvieron los
resultados mostrados en la figura:
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III. Por isoelectroenfoque (IEF) nativo se determinó que la enzima de E. coli migra como una
única banda de pI de 5,77; mientras que para la enzima de A. thaliana se observó una única
banda con pI de 5,51. Por IEF desnaturalizante con urea, la enzima de origen bacteriano mostró
el mismo pI; mientras que la de origen vegetal mostró dos bandas que enfocaron a pH 5,18 y
6,06, las cuales respectivamente corresponden a la banda más liviana y más pesada observadas
por SDS-PAGE.
En base a estos resultados: a) Describa con el mayor detalle posible la estructura de la ADP-
GlcPPasa de cada origen, indicando las similitudes y diferencias encontradas. b) Construya
figuras que esquematicen qué se obtendría en cada caso si la EcoADP-GlcPPasa y la AthADP-
GlcPPasa fueran analizadas por electroforesis bidimensional de los tipos PAGE/SDS-PAGE,
IEF/PAGE e IEF/SDS-PAGE.
4. La secuencia de una proteína que posee un dominio inserto en la membrana es:
MYGKIIFVLLLSEIVSISASSTTGVAMHTSTSSSVTKSYISSQTNDTHKRDTYAATPRAHEV
SEISVRTVYPPEEETGERVQLAHHFSEPEITLIIFGVMAGVIGTILLISYGIRRLIKKSPSD
VKPLPSPDTDVPLSSVEIENPETSDQ
Luego de ingresar al servidor de identificación y caracterización de proteínas Expasy
([Link] a) Analice el perfil de hidrofobicidad utilizando la herramienta Protscale
([Link] y la escala de Kyte and Doolittle. Identifique las regiones
hidrofóbicas. b) Analice si la misma posee un péptido tránsito con el servidor SignalP
([Link] En caso positivo corte dicho péptido e indique cuál
será la región transmembrana de la secuencia madura utilizando el servidor TMHMM
([Link] c) Calcule aproximadamente el pI del péptido en
negrita, asumiendo que los pKa de los residuos en la proteína son los mismos que para los
aminoácidos libres. Ingrese al servidor Compute pI/Mw ([Link]
y calcule el pI del mismo.
5. Ud. determina la concentración de proteína en una muestra que está en un medio que contiene
Hepes-NaOH 50 mM pH 7,5; MgCl2 5 mM; EDTA 0,5 mM y glucosa 0,02 mM. Utilizando el
método de Bradford (unión del colorante Coomassie Brilliant Blue) obtuvo un valor de
concentración de 1,2 mg/ml, mientras que por el método de Lowry el valor obtenido fue de 2,8
mg/ml. Para cada uno de los métodos empleados construyó curvas de calibración utilizando
albúmina sérica bovina preparada en un medio conteniendo Hepes-NaOH 50 mM pH 7,5 y 50
mM NaCl. a) ¿A qué atribuye la discrepancia obtenida en los resultados? b) ¿Cuál de las dos
determinaciones considera que es la que indica la verdadera concentración de proteína en la
solución? c) ¿Cómo podría corregir el error para la determinación que dio el valor erróneo de
concentración?
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6. Teniendo en cuenta los datos de solubilidad de sales de la tabla encontrada en el sitio web:
[Link] indique: a) ¿Cuál es el rango de fuerza iónica
que es posible variar cuando se utiliza NaCl o (H4N)2SO4 para separar proteínas a 0 ºC? b) ¿Por
qué no se utiliza Na2SO4 para realizar fraccionamiento salino de proteínas? c) ¿Encuentra algún
inconveniente en utilizar MgS04 para realizar fraccionamiento salino de proteínas?
7. Se desea concentrar por precipitación una proteína que se encuentra en solución y cuyo pI =
5,5. ¿Qué compuesto: sulfato de amonio, cloruro de sodio o urea y qué pH de trabajo: pH 4,0; 5,5
u 8,0 elegiría para ese fin? Justifique.
8. Un residuo carboxilo de un polipéptido puede formar un puente salino (interacción
electrostática atractiva) con un residuo amino de una lisina o guanidinio de una arginina.
¿Cuándo tendrá más posibilidades de producirse la unión: si ambos están expuestos al solvente o
si se encuentran en el interior de la estructura proteica, en una región donde el solvente es
inaccesible?
9. Trabajando con una concentración total de proteína de 2,0 x 10-3 M se evaluaron las
concentraciones de las formas nativa y desnaturalizada de una enzima a distintas temperaturas
como se indica en la tabla.
Temperatura (ºC) [desnaturalizada] (M) [nativa] (M)
50 5,1.10-6 2,0.10-3
100 2,8.10-4 1,7.10-3
Asumiendo que la forma nativa (N) y desnaturalizada (D) están en equilibrio: D N, responda: a)
El proceso de renaturalización, en las condiciones de estado estándar, ¿será espontáneo a 50 ºC?
b) Calcule ∆Hº y ∆Sº para la reacción de plegamiento de la proteína (asumiendo que son
constantes en el rango de temperatura estudiado) y analice sus valores en relación a la
termodinámica del proceso de plegamiento.
10. Los valores de pKa de los aminoácidos se encuentran tabulados, normalmente para los
residuos libres y en determinadas condiciones. Cuando se encuentran formando parte de la
estructura proteica estos valores pueden o no conservarse, dependiendo del entorno en que se
ubiquen. En la T4-lisozima los residuos Asp 70 e His 31 se encuentran próximos en la estructura
tridimensional y forman un puente salino. Se determinaron los valores de los pKa de ambos
residuos alternativamente en la proteína nativa y en la proteína desnaturalizada, obteniéndose los
valores que se muestran en la tabla, junto con los tabulados para los aminoácidos libres.
Estado pKa Asp pKa His
En la proteína (estado1) 0,5 9,0
En la proteína (estado2) 4,0 6,8
Residuos libres 4.25 6,0
a) Compare los valores de los pKa de los residuos cuando forman parte de la proteína con los
tabulados para los aminoácidos libres y explique cuál de los dos estados de la tabla (1 o 2)
supone que corresponderán al del estado nativo o al desnaturalizado. b) Una vez adjudicados los
pKa a cada estado, explique en cuál de los dos estados será más fuerte la interacción iónica entre
estos residuos a pH 5,0. c) En el estado nativo, ¿se formaría este puente salino a pH 10?