Guía Práctica

Código VRA-FR-031

Versión V.3.1

INMUNOLOGÍA CLÍNICA R.D. N°140-2023-FCS-

Documento de Aprobación
UPSJB

Fecha de Aprobación 15-08-2023

GUÍA DE PRÁCTICA Nº Página 1 de 115

GUÍA DE PRÁCTICA
ESCUELA PROFESIONAL DE TECNOLOGÍA MÉDICA ESPECIALIDAD
DE LABORATORIO CLÍNICO Y ANATOMÍA PATOLÓGICA

INMUNOLOGÍA CLÍNICA

PLAN DE ESTUDIOS: 2020-I

SEMESTRE ACADÉMICO: 2024-0

 Código VRA-FR-031

INMUNOLOGÍA CLÍNICA Versión V.3.1

Documento de Aprobación Acta 025-2022
Fecha de Aprobación 15-08-2022
GUÍA DE PRÁCTICA Nº Página 2 de 115

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA SAC

GUÍA PRÁCTICA

Aprobado con R.D. N° 140-2023-FCS-UPSJB

FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD

TECNOLOGÍA MÉDICA EN LA
ESCUELA PROFESIONAL ESPECIALIDAD DE LABORATORIO
CLÍNICO Y ANATOMIA PATOLÓGICA
SEMESTRE ACADÉMICO 2024-0

CICLO VI

NOMBRE DE LA ASIGNATURA INMUNOLOGÍA CLÍNICA

Modalidad de Estudios: PRESENCIAL

Fecha de entrega: 04/08/2023 Fecha de Revisión: 11/08/2023 Fecha de aprobación: 15/08/2023

Por: Equipo de Gestión Curricular Por: Coordinación Académica Por: Facultad de Ciencias de la Salud

Preparando el camino…
DATOS GENERALES

1.1. ASIGNATURA

a. Facultad Ciencias de la Salud

Tecnología Médica con especialidad de Laboratorio
b. Escuela Profesional
Clínico y Anatomía Patológica
c. Semestre académico 2024-0
d. Nombre Inmunología Clínica
e. Ciclo VI
f. Código 20201062629
g. Modalidad Presencial
h. Tipo de curso Obligatorio
i. Pre requisitos Inmunología general
j. Créditos 4
k. Horas semanales Teóricas 2 Prácticas 4 Total 6

l. Duración del semestre Inicio 08/01/2024 Culminación 02/03/24

1.2. DOCENTE
Docente responsable por Programa de Pregrado
Sede Lima - Chorrillos
Correo electrónico institucional
Filial Ica
Correo electrónico institucional
Filial Chincha GIANCARLO JESUS JARA PISCONTI
Correo electrónico institucional [Link]@[Link]

1.3. AMBIENTES ACADÉMICOS

Sede/Filial Teoría
Práctica

Sede Lima - Chorrillos

Filial Ica

Laboratorio de
Filial Chincha Aula de clases teóricas
Enseñanza
1. SUMILLA

La asignatura de Inmunología Clínica es de naturaleza teórico-práctica perteneciente a

estudios de especialidad correspondiente al perfil de egreso de calidad y comprensión
lectora, e Interpretación de pruebas y control de calidad en laboratorio clínico, cuyo
propósito es que el estudiante interprete pruebas inmunológicas basándose en
literatura científica actualizada para el diagnóstico, pronóstico y monitoreo terapéutico
de las enfermedades infecciosas, enfermedades del sistema inmune y otras patologías
humanas. La asignatura se desarrollará iniciando con la primera unidad que trata de
pruebas inmunológicas de interacción primaria y secundaria. En la segunda unidad
estará el diagnóstico inmunológico de patologías de origen bacteriano y viral. En la
tercera unidad se tratará el diagnóstico inmunológico de patologías de origen
parasitario, micótico y del sistema inmune. Y como logro de la asignatura, el estudiante
deberá presentar su portafolio académico digital que almacenará cada uno de los
productos académicos correspondientes a las unidades de la asignatura.

2. INTRODUCCIÓN
La Asignatura de Inmunología Clínica brinda las bases teórico-práctico científico para la
aplicación de diversas estrategias de investigación para el diagnóstico, pronostico y control
de diversas enfermedades que tienen como causa trastornos en la respuesta inmune,
aplicando diversas metodologías diagnósticas.
El futuro profesional en Tecnología Médica debe familiarizarse con los mecanismos de
respuesta inmune ocurridos in vivo, su relación con estudios laboratoriales y su aplicación
adecuada y oportuna debiendo tener la capacidad de evaluar críticamente la sensibilidad,
reproducibilidad, linealidad, trazabilidad, etc. y la aplicación de la tecnología que le permite
obtener un máximo beneficio.
3. DESARROLLO DE LAS ACTIVIDADES APRENDIZAJE
(LRPD-Resultados que pueden denominarse: logros, productos, desempeños)

3.1. Producto formativo de la asignatura

Los estudiantes presentarán un portafolio académico digital que almacenará
cada uno de los productos académicos correspondientes a las unidades de la
asignatura. Portafolio digital de aprendizaje que recopila los trabajos
LRPD realizados en el curso, por unidad, en el cual muestran sus habilidades,
progresos y los logros alcanzados. El portafolio es el resultado de resolver
ejercicios, cuestionarios, temas de debate e investigación bibliográfica en
torno a la temática de las sesiones teóricas y prácticas.

3.2. Producto formativo de las unidades

Unidad Producto Formativo

PPT de Pruebas Inmunológicas con animación y elaboración de un DOMINÓ
I.
INMUNOLÓGICO.
PPT de técnicas aplicadas al diagnóstico de enfermedades de etiología
bacteriana y viral (con animación) así como algoritmos diagnósticos de cada
II.
enfermedad.
Recopilación de Normas Técnicas de Salud de cada patología.
PPT de técnicas aplicadas al diagnóstico de enfermedades de etiología
parasitaria y micótica (con animación) así como algoritmos diagnósticos de
cada enfermedad.
III.
Presentación de casos clínicos de enfermedades autoinmunes.
Recopilación de Normas Técnicas de Salud de cada patología.

3.3. Producto formativo de las prácticas de laboratorio

Semana Fecha Práctica Producto Formativo

08/01/2024 Práctica 1: Preparación de soluciones. Ejercicios sobre Soluciones
y diluciones.
1 1 Informe de la práctica y resolución del cuestionario.
09/01/2024 Práctica 2: Pruebas de ELISA y Dot-ELISA.
2 2 Informe de la práctica y resolución del cuestionario.
15/01/2024 Práctica 3: Prueba de Western-blot e inmunoensayo en línea. Uso
de pruebas inmunocromatográficas en diversas situaciones
clínicas.
3 3 Informe de la práctica y resolución del cuestionario.
16/01/2024 Práctica calificada 1 (PC1)
Lectura Crítica N° 1
4 4 PPT de la lectura crítica y conclusiones
22/01/2024 Práctica 4: Pruebas de Inmunodifusión en gel. Doble Difusión e
Inmunodifusión Radial. Curvas de calibración para la prueba de
5 5 Inmunodifusión radial.
 Semana Fecha Práctica Producto Formativo
Informe de la práctica y resolución del cuestionario.
23/01/2024 Práctica 5: Pruebas de aglutinación en lámina, tubo,
hemaglutinación pasiva y aglutinación con partículas de látex
6 6 Informe de la práctica y resolución del cuestionario.
29/01/2024 Práctica 6: Diagnóstico serológico de fiebre tifoidea y de
brucelosis. Pruebas serológicas para el diagnóstico de sífilis y
Mononucleosis infecciosa.
7 7 Informe de la práctica y resolución del cuestionario.
8 30/01/2024 EXAMEN PARCIAL
05/02/2024 Práctica calificada 2 (PC2)
Lectura Crítica N°2
9 8 PPT de la lectura crítica y conclusiones
Práctica 7: Diagnóstico serológico de la infección por VIH.
10 06/02/2024 9 Informe de la práctica y resolución del cuestionario.
12/02/2024 Práctica 8: Diagnóstico serológico de la Hepatitis B.
11 10 Informe de la práctica y resolución del cuestionario.
13/02/2024 Práctica calificada 3 (PC3)
Lectura Crítica No 3
12 11 PPT de la lectura crítica y conclusiones
19/02/2024 Práctica 9: Diagnóstico Inmunológico de Alergias / Determinación
13 12 Cuantitativa de HCG
20/02/2024 Práctica 10: Diagnóstico serológico de Enfermedad de Chagas,
Toxoplasmosis. Taller de discusión de casos clínicos.
14 13 Informe de la práctica y resolución del cuestionario.
26/02/2023 Práctica calificada 4 (PC4)
Lectura crítica N° 4
15 14 PPT de la lectura crítica y conclusiones
16 02/03/2024 EXAMEN FINAL

PROTOCOLO DE BIOSEGURIDAD EN LABORATORIOS Y TALLERES EN EL MARCO DEL

SERVICIO REMOTO DE EMERGENCIA SANITARIA

1. MEDIDAS PREVIAS DE BIOSEGURIDAD AL INGRESO DE LABORATORIOS Y TALLERES

1.1. De las personas que ingresen:

• Cada persona que ingrese a la institución deberá previamente aceptar a través del
intranet la Declaración jurada de estado de salud3 y adjuntar el certificado del
resultado de prueba rápida COVID-19 negativa, para su envío al Programa de
Estudios correspondiente, al Departamento de Atención Primaria de Salud y a la
Jefatura de Seguridad. Esta declaración jurada es obligatoria para ingresar a los
 locales en los horarios de cada Programa de Estudios previstos para actividades de
laboratorio y talleres que contemplan las asignaturas del presente semestre. El
Departamento de Atención Primaria de Salud es responsable de validar la
Declaración Jurada y el certificado del resultado de prueba rápida COVID-19, si es
conforme quedará habilitado para el ingreso, caso contrario, se deberá reiniciar el
proceso.
• Toda persona que ingrese a la UPSJB SAC debe identificarse con su respectivo
documento de identidad.
• El ingreso de toda persona será obligatoriamente con mascarilla y protector facial.
• El ingreso de los estudiantes de la UPSJB SAC será por horarios establecidos con una
tolerancia de 15 minutos para evitar las aglomeraciones en las puertas de entrada.
• La programación de clases presenciales se realiza de manera escalonada en grupos
de estudiantes evitando tener en un mismo momento al total de estudiantes del
Programa Académico que debe realizar prácticas presenciales, se deben realizar
programaciones de horarios por asignaturas en turnos (turno mañana/ turno tarde),
no existiendo más de una asignatura programada por turno.
• Toda persona que ingrese y permanezca en las instalaciones de la UPSJB SAC debe
respetar las señales de distanciamiento social.
• En caso de detectar a alguna persona que presente la siguiente sintomatología:
malestar general, fiebre, congestión nasal, dificultad para respirar, tos o dolor de
garganta, esta no podrá ingresar a las instalaciones de la UPSJB SAC y será enviado a
su domicilio y/o al servicio de salud o Departamento de Atención Primaria de Salud
de la UPSJB SAC según la gravedad de sus síntomas; de no presentar condiciones de
riesgo se permitirá su ingreso.

1.2. De la toma de temperatura:

• Se realizará la toma de temperatura a todas las personas que ingresen a la

universidad mediante el termómetro infrarrojo, las personas que presentaron previo
al ingreso una temperatura de 37.5 °C se les realizará el seguimiento para verificar
que su temperatura no supere los 38°C, de ser así se tomarán las siguientes medidas:
Identificación de caso sospechoso:
• Derivación a un establecimiento de salud para su manejo, de acuerdo a la Resolución
Ministerial N°193-2020/MINSA
• Evaluación por el responsable de Atención Primaria de Salud para identificar
potenciales contactos.
• Comunicar a la autoridad de salud de su jurisdicción para el seguimiento de casos
correspondientes.
• Brindar material e información sobre la prevención del contagio de la COVID-19,
medidas de higiene y cuidado que debe llevar en casa.
• Se realizará el seguimiento clínico diario a distancia, a los docentes, estudiantes,
personal de limpieza, técnicos de laboratorio y/o taller, identificado como caso
sospechoso, según corresponda.
• Si se confirma el diagnostico de COVID-19, o se constituye contacto de un caso
confirmado, posterior a cumplir los 14 días calendario de aislamiento y antes del
regreso al trabajo, el medico ocupacional realizara la evaluación clínica, para el
retorno a la institución.
• Se deberá otorgar el descanso medico con la firma del médico tratante o a cargo, por
el tiempo de aislamiento y/o cuarentena para proteger y resguardar la salud, así
como de la institución.

1.3. De la limpieza y desinfección

• Para el ingreso a la UPSJB SAC se deberá realizar el protocolo de lavado o

desinfección de manos, para ello se usará en forma obligatoria los lavaderos
abastecidos con jabón líquido o los dispensadores provistos de alcohol en gel.
• El personal asignado a la puerta de ingreso indicara a los estudiantes donde tienen
que lavarse y/o desinfectarse las manos.
• Se instalarán bandeja metálica y felpudo con hipoclorito de sodio al ingreso, para que
todas las personas se desinfecten las suelas de los zapatos, antes de ingresar a la
universidad.
• Los dispensadores con alcohol en gel estarán debidamente señalizados dentro de las
instalaciones de la UPSJB SAC para su constante uso.

1.4 Del uso de mascarillas

• La mascarilla que porte cada persona al ingresar a las instalaciones de la UPSJB SAC
deberá ser la adecuada de acuerdo a las características y especificaciones dispuestas
por el MINSA. La UPSJB SAC se reserva el derecho de limitar el ingreso y/o acceso de
aquellas personas que no cumplan con el uso correcto de la mascarilla, así como de
retirar a aquellas personas que no lleven puesta la mascarilla dentro de las
instalaciones de la UPSJB SAC, ello por cuanto su uso es permanente.

2. DURANTE LAS ACTIVIDADES DENTRO DE LOS LABORATORIOS Y TALLERES

2.1. Del ambiente de cada laboratorio y taller:

• Todo laboratorio y taller de la UPSJB SAC tiene un aforo del 50% de su capacidad,
teniendo en cuenta el distanciamiento social.
• Cualquier ambiente adicional será modificado para asegurar que se respeten las
medidas de distanciamiento social de entre un (1) a dos (2) metros entre persona a
 persona, reubicando carpetas, escritorios, mesas, sillas o bancas, orientados en la
misma dirección (en lugar de uno frente al otro) para reducir la transmisión causada
por las gotitas respiratorias que contienen el virus al momento de hablar, toser o
estornudar.
• Toda persona que ingrese al laboratorio o taller deberá contar con los equipos de
protección personal (mascarilla adecuada, guantes, mandil, careta facial y cabello
recogido). El mandil podrá ser desechable o de tela, siendo responsabilidad del
estudiante que el mandil de tela utilizado cumpla con las medidas de desinfección y
lavado.
• Los ambientes se mantendrán limpios y desinfectados antes de cualquier uso; se
desinfectarán con frecuencia los pasamanos de las escaleras, escritorios, zona de
recepción, teléfonos IP, intercomunicadores, manijas de las puertas, entre otros,
empleando la solución adecuada.

2.2. Durante las actividades dentro de los laboratorios y talleres:

2.2.1. Lineamientos de bioseguridad

• El ingreso a los laboratorios y talleres estará limitado según los aforos

correspondientes.
• En cada ambiente se cuenta con dispensadores de alcohol; en tal sentido es
obligatoria la desinfección de manos antes del ingreso a los laboratorios y talleres, así
como también durante su permanencia en el mismo.
• Antes de ingresar y durante las actividades en laboratorios y talleres, los docentes y
alumnos deberán usar obligatoriamente los siguientes EPP: mascarillas quirúrgicas
(descartables) o de lo contrario la combinación de mascarillas comunitarias con
caretas o protectores faciales, guantes quirúrgicos, mandil y de acuerdo a las
prácticas a realizarse, así como llevar el cabello recogido.
• Durante las clases los alumnos deberán guardar el distanciamiento social mínimo un
metro (1m) de distancia.
• Está prohibido el saludo físico o contacto directo con las manos.
• En cada ambiente se cuenta con dispensadores de alcohol para la desinfección
constante de las manos.
• Está prohibido el ingreso con alimentos y/o bebidas.
• Se deberá limpiar y desinfectar los materiales antes de ser usarlos.
• Se asegurará suministro adecuado de materiales de práctica, para evitar el
intercambio en la medida de lo posible.
• Se prohibirá el contacto de manos con el rostro, boca, nariz y ojos, salvo que sea
necesario y se haya seguido previamente el procedimiento de limpieza y/o
desinfección respectiva.
• El estudiante no deberá compartir sus materiales de clase y no podrá dejarlos sobre
las mesas, esto con el fin de facilitar la desinfección.
• Se asegurará que los ambientes estén correctamente ventilados, aumentando la
circulación del aire exterior tanto como sea posible, abriendo ventanas y puertas.
• Se restringe el uso de aire acondicionado y ventiladores, teniendo en cuenta que
este podría favorecer la expansión de la enfermedad.
• Está prohibido que se utilice joyas, accesorios, barba y bigotes, celulares y laptop
toda vez que son reservorios del virus y demás microorganismos.
• Se cuenta con entradas y salidas exclusivas del personal docente, alumnos y
administrativos, en caso de tener un solo acceso este se divide por barreras físicas a
fin de contar con espacios específicos para el ingreso y salida del personal.
• Contar con un programa de capacitación y difusión de información que incluya:
hábitos saludables, estilo de vida, familia, apoyo para el control de enfermedades
crónico-degenerativas para evitar complicaciones por COVID19, higiene de manos,
higiene respiratoria, higiene del vestido, sana distancia, no saludar de beso, abrazo o
de mano, etc.
• La limpieza y desinfección de los buses y microbuses que dispone la institución para
el transporte de estudiantes, docentes y personal administrativo si lo hubiera (antes
de cada recorrido) • El alumno debe traer ropa ligera y esta debe cambiarse
diariamente para ingresar a la institución, para prevenir el contagio.
• Todo el personal: docente, estudiante o personal administrativo que se encuentre en
el laboratorio o taller debe identificar y conocer la ubicación de los elementos de
seguridad del laboratorio, tales como extintor, botiquín, salidas de emergencia,
lavaojos, duchas de seguridad, etc. • Culminada la práctica, los docentes y alumnos
están obligados por procedimiento en desechar sus equipos de protección personal
en los tachos rojos de residuos desechos biocontaminados que están rotulados.
• Se darán periodos de receso de 5 min a los estudiantes para que realicen sus pausas
activas con el docente, en el mismo laboratorio y/o taller.
• Si algún alumno o docente presenta algún síntoma, una prueba positiva, o estuvieron
expuestos a alguien con COVID-19 en los últimos 14 días, deberá contactarse con el
departamento atención primaria de salud de la universidad y según evaluación del
médico ocupacional se le derivará al centro de salud según lo requiera.
• Se separará inmediatamente al profesorado, al personal y a los estudiantes con
síntomas de COVID-19 (como fiebre, tos o falta de aire), estos no deberán regresar a
clases en las instalaciones de la universidad, y deberán aislarse en su domicilio hasta
que hayan cumplido con los criterios para descontinuar el aislamiento en el hogar.
• Se cerrarán las áreas que recientemente hayan sido utilizadas por la persona
enferma y no se usarán hasta después de limpiarlas y desinfectarlas.
• Se notificará de acuerdo con la normativa al ministerio de salud, a los profesores,
personal y estudiantes de inmediato sobre cualquier caso de COVID-19, manteniendo
la confidencialidad respectiva.
• Se informará a aquellas personas que hayan tenido contacto cercano con una
persona diagnosticada con COVID-19 para que se queden en sus viviendas, controlen
los síntomas, y sigan los procedimientos respectivos si los síntomas se desarrollan.
• Cada grupo de práctica está programado a desarrollar ocho (8) horas académicas en
el laboratorio y/o taller, por tal motivo cada tres (3) horas el docente realizará pausas
activas con los estudiantes en un tiempo de cinco (5) minutos y las dos (2) últimas
horas finaliza también con estas pausas activas.

4. SISTEMA DE EVALUACION
Durante el desarrollo del ciclo, se considerarán 4 prácticas calificadas, las cuales serán
evaluaciones calificadas tomadas de forma presencial y cada práctica equivale al 15 % del
promedio final, tal como se expresa en la siguiente fórmula:

FÓRMULA

PF = EP(20%)+EF(20%)+PC1(15%)+PC2(15%)+PC3(15%)+PC4(15%).

5. BIBLIOGRAFÍA

6.1. Bibliografía Básica

• Turgeon ML. 2013. Immunology & Serology in Laboratory Medicine. 5ta. ed.
Mosby-Year Book, Inc. St. Louis.
• Abbas AK. Lichtman AH, Pillai S. Inmunología Celular y Molecular. 9na ed.
España: Elsevier España; 2018.

6.2. Bibliografía Complementaria

• Delves PJ, Martin SJ, Burton DR, Roitt IM. 2014. Roitt Inmunología.
Fundamentos. 12a. ed. Edit Médica Panamericana S.A. México D.F.- México.
• Greenfield EA. (ed.) 2013. Antibodies: a laboratory manual. 2da. ed. Cold Spring
Harbor Laboratory Press.
• Rose NR, Hamilton RG, Detrick B. 2002. Manual of Clinical Laboratory
Immunology. 6ta. ed. American Society for Microbiology Press. Washington
D.C.

6.3. Base de Datos

• [Link]
• [Link]
• [Link]
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• [Link]
• [Link]
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• [Link]
• [Link]
• [Link]
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6.4 Publicaciones de la UPSJB

• Bejar V, Villanueva F, Leon SR, Guevara-Granados JM, Uribe A, Vergaray G, et

al. [Molecular identification of Aspergillus fumigatus isolated from patients
with invasive aspergillosis]. Rev Peru Med Exp Salud Publica. 2019;36(1):81-6.
• De la Cruz-Pérez, J. P., & Camacho-Conchucos, H. T. (2022). Dolor, rigidez y
capacidad funcional asociados a la kinesiofobia en pacientes con artrosis de
rodilla, Hospital Nacional Hipólito Unanue (Perú). Revista Ciencias De La Salud,
20(2). [Link]
• Flores JA, Calderón R, Mesman AW, Soto M, Coit J, Aliaga J, et al. Detection of
Mycobacterium tuberculosis DNA in buccal swab samples from children in
Lima, Peru. Pediatric Infectious Disease Journal. 2020: E376-E80.
• Flores JA, Coit J, Mendoza M, Leon SR, Konda K, Lecca L, ¿et al. Is exclusive
breastfeeding for six-months protective against pediatric tuberculosis? Global
Health Action. 2021;14(1).
• Galvez TM, Flores JA, Pérez DG, Gutiérrez C, Huertas M, León-Sandoval S.
Concordance between self-sampling and standar endocervical sample
collection to identify sexual transmission infections in an urban-rural area of
Peru. Revista peruana de medicina experimental y salud pública. 2021;38(1):83-
8.
• Iverson KR, Roa L, Shu S, Wong M, Rubenstein S, Zavala P, et al. Quality
Improvement to Address Surgical Burden of Disease at a Large Tertiary Public
Hospital in Peru. World Journal of Surgery. 2021;45(8):2357-69.
• Kojima N, Siebert JC, Maecker H, Rosenberg-Hasson Y, Leon SR, Vargas SK, et al.
The application of cytokine expression assays to differentiate active from
previously treated syphilis. Journal of Infectious Diseases. 2020;222(4):690-4.
• León SR. A radiolabeled mAb 3BNC117 with copper-64: First round in favor for
studying clearance of HIV reservoirs. EBioMedicine. 2021;66.
• Penn-Nicholson A, Mbandi SK, Thompson E, Mendelsohn SC, Suliman S, Chegou
NN, et al. RISK6, a 6-gene transcriptomic signature of TB disease risk, diagnosis
and treatment response. Sci Rep. 2020;10(1):8629.
• Ramirez Ubilluz G, Neira-Montoya CR, Sedano-Galvet EE, Verona-Cueva JF. New
algorithm to differentiate histochemical types of intestinal metaplasia: G&S2 method. J
Bras Patol Med Lab. 2022; 58:1-6. doi: 10.1900/JBPML.2022.58.413.
• Santos S, Flores JA. Musculoskeletal physiotherapy in physical sequelae of SARS-CoV-2
infection: A case report. Physiother Res Int. 2022;27(2):e1938. doi: 10.1002/pri.1938.
• Soca-Saavedra L, Camacho-Conchucos HT. Depressive symptoms and chronic back pain
in patients who start rehabilitation in Lima, Perú. Revista Habanera de Ciencias
Médicas. 2021;20(2).
• Suliman S, Gela A, Mendelsohn SC, Iwany SK, Tamara KL, Mabwe S, et al. Peripheral
Blood Mucosal-Associated Invariant T Cells in Tuberculosis Patients and Healthy
Mycobacterium tuberculosis-Exposed Controls. J Infect Dis. 2020;222(6):995-1007.
6. GUÍAS PRÁCTICAS

GUIA PRÁCTICA Nº 01 SEMANA 1

PREPARACIÓN DE SOLUCIONES Y DILUCIONES
OBJETIVO Describir y diferenciar los conceptos: disolución, soluto y
disolvente
LOGRO A MEDIR a) Realizar la preparación de soluciones que se utilizarán en las
prácticas del curso.
b) Efectuar correctamente los cálculos numéricos (Molaridad,
Normalidad, Soluciones porcentuales y equivalencias) involucrados
en la preparación de soluciones.
c) Realizar los cálculos numéricos para efectuar diluciones simples y
seriadas de volúmenes constantes y variables.
d) Realizar los diferentes tipos de diluciones seriadas de muestras y
reactivos a usarse en las prácticas del curso.

PREPARACIÓN DE SOLUCIONES Y DILUCIONES

INTRODUCCIÓN

Las soluciones son mezclas homogéneas de dos o más componentes, uno que se conoce como
soluto y otro que se conoce como solvente o disolvente, y que generalmente está en mayor
proporción que el primero. Las soluciones más comunes son las acuosas y tienen como solvente
al agua, el solvente universal.

La cantidad de soluto que se encuentra disuelto en un volumen determinado de solución

constituye su concentración. Existen básicamente dos tipos de expresiones que prevalecen:
aquellas que expresan la concentración de forma porcentual y aquellas que la expresan como
molaridad.

Cuando se prepara una solución generalmente se usan reactivos con un alto grado de pureza
(generalmente de grado químicamente puro q.p., de grado analítico g.a., o de grado estándar
primario) y agua purificada (destilada o desionizada).

Para guardar las soluciones preparadas se prefieren recipientes de vidrio pyrex debido a su gran
resistencia a la acción química. El frasco debe quedar bien tapado, ser del tamaño adecuado,
ser transparente o de color oscuro (cuando la solución es sensible a la luz) y contar con una
etiqueta donde se especifica el nombre de la sustancia, su concentración y la fecha de su
preparación. El uso de envases de plástico hechos de polietileno tiene sus limitaciones debido a
que son permeables a los gases (CO2, O2) presentes en el aire.
Rangos de pH de buffers biológicos seleccionados (25 ºC, 0.1 M)
MATERIALES

a) Cloruro de sodio
b) Azida de sodio 100 mg
c) Agua destilada 500 mL
d) Azul de metileno 5 mL
e) Tampón salino fosfato (PBS) 200 mL
f) Agarosa 5 g
g) Beakers 250 mL
h) Probetas 10 mL
i) Fiola 100 mL
j) Pipetas 5 mL
k) Baguetas
l) Frascos de vidrio con tapa de 200 mL
m) Frascos de vidrio con tapa de 50 mL
n) Etiquetas o cinta adhesiva
o) Cocina eléctrica
p) Tubos de 16 c 150 mm con tapa rosca
q) Tubos de 13 x 100 mm
r) Gradillas para tubos
s) Pipetas de 1 mL
t) Propipetas de goma
u) Micropipetas de 5-20muL
v) Micropipetas de 10-100 ul
w) Micropipetas de 100-1000 uL
x) Tips amarillos
y) Tips azules
z) Bocal con lejía
aa) Plumón marcador
bb) Microplacas de 96 pocillos vacíos
METODOLOGÍA

1. Pesar 0,85 g de cloruro de sodio y luego depositar esta cantidad en un beaker de 250
mL. Medir 60-80 mL de agua destilada en una probeta y adicionarla al beaker. Con la
ayuda de una bagueta disolver la sal en el agua. Trasvasar el contenido del beaker a
una fiola de 100 mL y enrasar hasta la marca de aforo con la ayuda de una piseta.
Verter la solución preparada en un frasco de vidrio limpio, rotular y guardar a 4 ºC
hasta su uso.
2. Pesar 0,01 g de azida de sodio y disolver la sal en agua destilada empleando un beaker
y una bagueta. Trasvasar el contenido del beaker a una fiola de 50 mL y enrasar hasta
la marca de aforo con la ayuda de una piseta. Verter la solución preparada en un
frasco de vidrio limpio, rotular y guardar a 4 ºC hasta su uso.
3. Pesar 8 g de cloruro de sodio, 0,2 g de cloruro de potasio, fosfato de sodio primario
0,24 g y 1,44 g de fosfato de sodio secundario. Colocar 50 mL de agua destilada en un
beaker y añadir una a una las cuatro sales, cuidando que se disuelva totalmente una
sal para continuar agregando las otras sales. De ser necesario, puede acelerar el
proceso de disolución con la ayuda del calor. Medir pH y ajustarlo a 7,4 con NaOH o
HCl. Trasvasar el contenido del beaker a una fiola de 100 mL y enrasar hasta la marca
de aforo con la ayuda de una piseta. Verter la solución preparada en un frasco de
vidrio limpio, rotular PBS 10X y guardar a 4 ºC hasta su uso.
4. Pesar 1,2 g de agarosa y luego depositar esta cantidad en un beaker de 250 mL. Medir
100 mL de PBS en una probeta y adicionarla al beaker. Colocar el beaker en la hornilla
eléctrica y con la ayuda de una bagueta disolver la agarosa en el PBS. Trasvasar el
contenido del beaker en tubos de 16 x 150 mm con tapa de rosca, cuidando no
exceder la mitad del volumen del tubo, rotular y guardar a 4 ºC hasta su uso.
5. Realizar las diluciones simples y seriadas en microplacas de titulación y en tubos de
ensayo propuestas por el docente.

RESULTADOS

Entregar los frascos rotulados correctamente con las soluciones preparadas y

almacenarlas en las condiciones adecuadas.

CUESTIONARIO

1. ¿Cómo prepararía 50 mL de una solución de PBS 1X, pH 7,4, a partir de una solución de
PBS 10X?
 2. Calcular a qué concentración en M están cada uno de los componentes de la solución
de PBS 1X.
3. ¿Realice los cálculos para preparar 200 mL de una solución 2 N de NaHPO4? Peso
molecular de NaHPO4 = 84.
4. ¿Cómo influye el agua de hidratación de los sólidos en los cálculos que se llevan a cabo
para la preparación de las soluciones?
5. ¿Cuántos gramos de MgCl2 hay en 1 g de MgCl2?3H2O? Peso molecular del MgCl2.3H2O
= 149 g/mol; peso molecular del MgCl2 = 95 g/mol.
6. ¿Qué cantidad de Ba(OH)2.8H2O hay que pesar para preparar 450 mL de Ba(OH)2.0,2
M?
7. ¿Qué consideraciones se deben tener para preparar las soluciones que tienen solutos
líquidos como los ácidos clorhídrico, nítrico y sulfúrico?
8. Realice los cálculos para preparar 100 mL de una solución 0,1 M de ácido clorhídrico
(HCl) a partir de un ácido clorhídrico comercial. Peso molecular del HCl =36,5 g/mol; d =
1,18 g/mL; 35% de contenido.
9. ¿Por qué un buffer se opone a los cambios de pH?
10. ¿Qué habría que hacer para preparar 500 mL de H2SO4 0,2N a partir de H2SO4 6 M?
(A) Añadir 8,3 mL del ácido concentrado a la cantidad suficiente de agua para obtener
0,5 litros de solución.
(B) Tomar 8,3 mL de ácido concentrado y añadirlos a 0,5 litros de agua destilada
(C) Añadir 16,6 mL del ácido concentrado a la cantidad suficiente de agua para obtener
0,5 L de solución
(D) La solución no se puede preparar con este ácido tan concentrado
11. Realizar una dilución quíntuple de HCl en agua con un volumen final de 275 mL

DILUCIÓN

SOLUCIÓN DE PRINCIPIO
ACTIVO (MUESTRA)

DILUYENTE

DILUCIÓN LOGRADA

VOLUMEN FINAL

12. Realizar una dilución quíntuple en 4 pasos partiendo de una muestra diluida 1:10 con
un volumen final de 4.8 mL en cada tubo.
13. Obtener la dilución 1:120 en tres pasos. (sólo 3 tubos)

DILUCIONES SERIADAS
1 2 3 4
DILUCIÓN
ORIGINAL
DE LA
MUESTRA

SOLUCIÓN DE PRINCIPIO
ACTIVO (MUESTRA)
DILUYENTE
VOLUMEN DE
TRANSFERENCIA
DILUCIÓN FINAL
LOGRADA EN EL POCILLO
VOLUMEN FINAL

DILUCIONES SERIADAS
1 2 3

SOLUCIÓN DE PRINCIPIO
ACTIVO (MUESTRA)
DILUYENTE
VOLUMEN DE
TRANSFERENCIA
DILUCIÓN REALIZADA EN
POCILLO
DILUCIÓN DEL SUERO EN EL
POCILLO
VOLUMEN FINAL
BIBLIOGRAFÍA

• Sansón M.C. y col. Manual de prácticas. Química analítica I. México D.F. 2007.
Disponible en:
[Link] Fecha
de acceso: 17 de febrero de 2014.
 GUIA PRÁCTICA Nº 02 SEMANA 2
PRUEBA DE ELISA y DOT ELISA
OBJETIVO Describir y ejecutar los diversos métodos de las técnicas de ELISA
y Dot ELISA que se aplican en el laboratorio de Inmunología
Clínica
LOGRO A MEDIR • Realizar la prueba de ELISA indirecta en microplacas o en tiras
de 8 pocillos.
• Determinar la presencia de anticuerpos específicos contra un
antígeno o antígenos en muestras problema.
• Realizar la interpretación de la lectura de las pruebas.
• Realizar la prueba de Dot ELISA indirecta en tiras de papel de
nitrocelulosa.
• Valorar la importancia de la correcta ejecución de los
ensayos, así como el uso de controles en la prueba de ELISA y
Dot ELISA.

PRUEBA DE ELISA

INTRODUCCIÓN

ELISA es un acrónimo de “enzyme-linked immunosorbent assay”. La prueba ha sido

reconocida como una herramienta útil para el inmunodiagnóstico, así como para estudios
seroepidemiológicos. El enzimo inmunoanálisis ha reemplazado a muchas técnicas
tradicionales en el diagnóstico clínico e investigación biológica.
Esta prueba se basa en los fenómenos biológicos: alta especificidad del anticuerpo por un
antígeno y la amplificación por reacciones químicas llevadas a cabo por enzimas. Por
tanto, este procedimiento consiste en una reacción inmunológica y en una reacción
enzimática indicadora para demostrar la presencia o ausencia de reacciones antígeno-
anticuerpo.
La prueba de ELISA es dependiente del hecho que un antígeno o anticuerpo puede ser
inmovilizado en fase sólida, reaccionando posteriormente con el reactivo a determinar en
la muestra problema. A continuación, se añaden anticuerpos marcados con enzima, y
luego se agrega el respectivo sustrato; su hidrólisis, determinada a simple vista por un
cambio de color o por medición de su absorbancia, indicará la presencia de reacciones
antígeno-anticuerpo.
ELISA es una técnica que permite detectar antígenos o anticuerpos en muy baja
concentración (1 ng/mL) en una amplia gama de muestras biológicas (suero, líquido
cefalorraquideo, sangre, saliva, heces, etc.) o sobrenadantes de cultivos celulares.

Enzima Cromógeno Color de la

marcadora reacción

Fosfatasa p-Nitrofenil fosfato Amarillo

alkalina
2,2´-Azino-bis (6-ácido sulfónico-3- Verde
etilbenztiazolina) (ABTS)

O-fenilenediamina (OPD) Naranja

3,3´,5,5´-Tetrametilbenzidina (TMB) Azul

Peroxidasa

Acido 5-aminosalicílico (5 AS) Marrón

O-Dianisidina Amarillo-

MATERIALES

a) Kit de ELISA método indirecto j) Sustrato/cromógeno: peróxido de

b) Microplacas con antígeno hidrógeno 0,012% /
c) Sueros controles (positivo y negativo) ortofenilendiamina 0,04%
d) Sueros problema k) Solución de término: ácido
e) Conjugado: anti-IgG humana: peroxidasa sulfúrico 2,5 M
f) Buffer de recubrimiento: carbonato- l) Placa de microtitulación de
bicarbonato 0,05 M pH 9,6 polipropileno o poliestireno
g) Solución de lavado: PBS-Tween 20 0,05% m) Pipetas automáticas y puntas
h) Solución bloqueadora: PBS-Tween 20 n) Papel toalla
 0,05% - albúmina 1% o) Estufa a 37ºC
i) Buffer del sustrato/cromógeno: citrato p) Espectrofotómetro para placas de
fosfato pH 5,0 micro-ELISA
q) Bocal con lejía

METODOLOGÍA

1. Cubrir los pocillos de la placa con antígeno a la concentración de 1 a 5 g/mL en

tampón de recubrimiento. Si se tiene un kit este paso ya se realizó en la casa
2. Incubar a 37ºC por 60 minutos y luego toda la noche a 4ºC.
3. Lavar 3 veces (3 minutos por vez) con PBS/Tween.
4. Cubrir los pocillos con 100 L de PBS/Tween-BSA e incubar durante 1 hora a
temperatura ambiente.
5. Lavar 3 veces con PBS/Tween.
6. Agregar 100 L del diluyente de las muestras (blanco), control negativo, control
positivo y sueros problema en pocillos separados de la placa de reacción e incubar
durante 1 hora a 37ºC.
7. Lavar 3 veces con PBS/Tween.
8. Agregar 100 L de conjugado diluido en PBS/Tween-BSA en cada pozo e incubar
durante 1 hora a 37ºC.
9. Lavar 3 veces con PBS/Tween.
10. Agregar a cada pozo 100 L de la solución sustrato/cromógeno e incubar a
temperatura ambiente por 30 minutos en oscuridad.
11. Detener la reacción agregando a cada pocillo 50 L de ácido sulfúrico 2,5 M.
12. Leer absorbancia a 492 nm en un lector de ELISA o realizar la lectura a simple vista.

RESULTADOS

Una reacción positiva se evidencia por la aparición de un color marrón-rojizo.

CUESTIONARIO

1. ¿Cuál es el criterio para elegir el conjugado enzimático a utilizar en una prueba de

ELISA?
2. ¿Cuál es el criterio para elegir el sustrato cromógeno a utilizar en una prueba de
ELISA?
3. ¿Qué métodos se utilizan para sensibilizar las microplacas con antígeno o
anticuerpos?
4. ¿De qué manera la solución STOP detiene la reacción enzimática?
5. ¿Qué métodos de ELISA se utilizan para detectar o dosar antígenos en muestras
biológicas?
6. ¿Qué métodos se utilizan para detectar anticuerpos en muestras de suero?
7. ¿Qué es el efecto Hook?

BIBLIOGRAFÍA

• Harlow E, Lane D. Antibodies: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory,

Cold Spring Harbor, New York, 1988.
• Voller A, Bidwell D E, Bartlett A. The enzyme linked immunosorbent assay (ELISA): A
guide with abstracts of microplate applications, Dynatech Europe, Guernsey, 1979.
 DOT - ELISA

INTRODUCCIÓN

El ensayo inmunoenzimático (ELISA) es una técnica sencilla, sensible y rápida, que ha sido
usada para la detección de antígenos en personas que cursan con un proceso infeccioso,
sin embargo el ELISA no puede emplearse para los estudios seroepidemiológicos de
campo.
El dot-ELISA es una técnica que comparte los mismos principios que el ELISA estándar,
siendo su principal diferencia el empleo de papel de nitrocelulosa como fase sólida en
lugar de placas de poliestireno o polietileno, lo que la convierte en una técnica de
aplicación para los estudios de campo.
La prueba de dot-ELISA ha sido usada para la detección de anticuerpos o antígenos en
enfermedades infecciosas por parásitos (leishmaniasis, toxoplasmosis, tripanosomiasis),
virus (sarampión, dengue) y bacterias (leptospirosis, diarrea por E. coli).
Se han señalado dos ventajas del dot-ELISA sobre el ELISA o el radioinmunoensayo: 1) El
empleo de pequeños volúmenes de la muestra a evaluar, así como de los reactivos
empleados para la prueba, y 2) Una mayor sensibilidad.

LOGRO

• Realizar la prueba de dot-ELISA indirecta en papel de nitrocelulosa.

• Realizar lectura e interpretación de la prueba de dot-ELISA.
• Establecer semejanzas y diferencias entre la prueba de ELISA y el dot-ELISA.

MATERIALES

a) Kit de Dot ELISA para autoinmunidad l) Solución reveladora:

b) Papel de Nitrocelulosa cloronaftol/peróxido de hidrógeno
c) Prueba de Dot ELISA “in house” m) Agua destilada
d) Antígeno soluble dosado n) Papel de nitrocelulosa (NC)
e) Suero control positivo o) Pipeta de 5 mL
f) Suero control negativo p) Pipeta automática y puntas
g) Suero problema q) Propipeta
h) Conjugado: anti-IgG de conejo: r) Tubo de lavado
peroxidasa s) Gradilla para tubos
i) Buffer salino fosfato (PBS) t) Bocal con lejía
j) Solución bloqueadora: leche
descremada al 5% en PBS
k) Solución de lavado

METODOLOGÍA

1. Depositar 1-2 L del antígeno en diferentes sitios sobre el papel de NC, cuidando de
no colocar el antígeno muy cerca uno del otro.
2. Dejar secar el antígeno por 30-60 minutos (temperatura ambiente) o por 10-20
minutos (37 ºC).
3. Sumergir el papel de NC en un tubo conteniendo PBS-leche descremada. Incubar en
agitación por 1 hora (temperatura ambiente) o toda la noche (4ºC).
4. Retirar el papel de NC y dejar secar a temperatura ambiente (1-5 minutos). Guardar el
papel NC a –20ºC o procesarlo inmediatamente.
5. Añadir 2-5 L del suero (problema, control positivo y control negativo) sobre el área
del papel de NC que contiene antígeno. Colocar el papel de NC en cámara húmeda e
incubar por 0,5-1 hora a temperatura ambiente.
6. Lavar el papel de NC, sumergiéndolo en un tubo conteniendo solución de PBS-Tween
por 5 minutos. Repetir el lavado por 3 veces.
7. Sumergir el papel de NC en un tubo conteniendo conjugado, previamente titulado, e
incubar por 0,5-1 hora a temperatura ambiente.
8. Lavar como en el paso 6.
9. Sumergir el papel de NC en un tubo conteniendo la solución reveladora. Incubar por
10-30 minutos a temperatura ambiente.
10. Retirar la NC, lavarla con agua destilada y dejar que seque.

RESULTADOS

La lectura de la prueba se realiza a simple vista. Un resultado positivo se evidencia por

puntos (dots) o pequeñas áreas de color, mientras que un resultado negativo consiste en
áreas incoloras o muy débilmente coloreadas. Para ser válida la prueba los controles
positivo y negativo deben de haber dado una reacción de color y ausencia de color,
respectivamente.
CUESTIONARIO

1. ¿Cuál es el criterio para seleccionar el sustrato cromógeno en la prueba de Dot ELISA?

2. ¿Con qué reactivo se detiene la reacción?
3. ¿Cómo se estandariza una prueba de Dot ELISA?
4. Mencione 5 aplicaciones clínicas de la prueba de Dot ELISA

BIBLIOGRAFÍA

• Boccatto E, Dos Santos S A, Mazieri Nao y col. Evaluation of a rapid screening assay for
bacterial identification (dot-ELISA) in fecal samples from children, Rev Inst Med Trop
São Paulo 39:21-27, 1997.
• Boctor F N, Stek M J, Peter J B, Kamal R. Simplification and standardization of dot-ELISA
for human schistosomiasis mansoni. J Parasit 73: 589-592, 1987.
• Corral R S, Orn A, Grinstein S. Detection of soluble exoantigens of Trypanosoma cruzi
by a dot-immunobinding assay. Am J Trop Med Hyg 46:31-38, 1992.
• Crespo de Escribano M J, Benedi V J, Cordier J. Análisis de antígenos y anticuerpos por
fijación en membranas de nitrocelulosa e inmunodetección. Inmunología 2:71-76,
1983.
• Vaz de Lima L R A, Hoshino-Shimizu S, de Souza Vauf y col. Measles serodiagnosis:
standardization and evaluation of a dot-ELISA. Rev Inst Med Trop São Paulo 36:139-
147, 1994.
 GUIA PRÁCTICA Nº 03 SEMANA 3
PRUEBA DE WESTERN BLOT o INMUNOELECTROTRANSFERENCIA BLOT Y PRUEBAS
INMUNOCROMATOGRÁFICAS
OBJETIVO Ejecutar e interpretar las pruebas de Western blot y pruebas
inmunocromatográficas de diferentes diseños metodológicos.
LOGRO A MEDIR • Realizar la prueba de inmunoelectrotransferencia desde la
etapa del revelado.
• Determinar la presencia de anticuerpos específicos contra un
antígeno.
• Valorar la importancia del uso de estándares de peso molecular
en la prueba de inmunoelectrotransferencia.
• Realizar la lectura e interpretación de la prueba de
inmunoelectrotransferencia.
• Realizar e interpretar las diversas pruebas
inmunocromatográficas de acuerdo a su fundamento de diseño.

PRUEBA DE WESTERN BLOT

INTRODUCCIÓN

La inmunoelectrotransferencia, immunoblotting o Western Blot es una técnica que

permite detectar o identificar antígenos a partir de una mezcla compleja, pero su principal
aplicación en inmunología clínica es la detección de anticuerpos especificos para
antígenos conocidos.
En la inmunoelectrotransferencia se utilizan geles analíticos, como el gel de poliacrilamida
con SDS (dodecil sulfato de sodio), para separar las proteínas en función de sus tamaños
moleculares. A continuación, el grupo de proteínas separadas se transfiere del gel
separador a una membrana de soporte como la nitrocelulosa, por acción capilar o por
electroforesis, de forma que la membrana adquiere una réplica del conjunto de
macromoléculas separadas presentes en el gel. En la siguiente etapa se añade la muestra
biológica y la detección de anticuerpos se realiza con un anticuerpo secundario marcado
(conjugado). Finalmente después del revelado de bandas se procede a leer e interpretar
según criterios establecidos mediante investigaciones.
MATERIALES

a) Kit de Western blot para VIH 1 j) 0,05%- diaminobencidina 0,1% -

b) Kit de inmunoensayo en línea para H202 0,01%
VIH 1 (alternativa) k) Buffer de transferencia: Tris/glicina,
c) Gel de poliacrilamida con SDS pH 8,3
conteniendo el antígeno. l) Colorante Ponceau S.
d) Suero positivo (anticuerpo m) Agua destilada
primario). n) Nitrocelulosa de 0,45 m
e) Suero negativo o) Papel Whatman
f) Buffer salino fosfato (PBS) pH 7,3 p) Equipo para electroforesis vertical
g) Solución bloqueadora: BSA 1% en q) Sistema de transferencia
PBS electroforética
h) Conjugado: anti-Ig humana r) Bocal con lejía
conjugada con peroxidasa
(anticuerpo secundario)
i) Sustrato cromógeno: cloronaftol

METODOLOGÍA

1. Embeber las esponjas, los papeles de filtro y la hoja de nitrocelulosa en el buffer de

transferencia.
2. Colocar 2 hojas de papel Whatman sobre una de las esponjas del cassette.
3. Colocar el gel sobre el papel Whatman.
4. Ubicar la hoja de nitrocelulosa sobre el gel. Evitar que queden atrapadas burbujas
entre el gel y la nitrocelulosa.
5. Colocar las otras 2 hojas de papel filtro sobre la nitrocelulosa.
6. Colocar la otra esponja sobre la nitrocelulosa y ajustar el cassette.
7. Llenar el tanque con buffer de transferencia.
8. Colocar el cassette en el tanque de transferencia, verificar que la hoja de nitrocelulosa
esté ubicada hacia el ánodo y el gel hacia el cátodo.
9. Realizar la transferencia electroforética de 1-4 horas a 25 mA.
10. Terminada la transferencia, trazar una línea en la lámina de nitrocelulosa para marcar
las bordes del gel. Identificar el borde superior e inferior.
11. Colorear el gel con azul de coomassie.
12. Teñir la hoja de nitrocelulosa con Ponceau S durante 5 minutos, enjuagar en agua 2 -
3 veces. Cortar la nitrocelulosa en tiras y ubicarlas en la cubeta de reacción
 conteniendo solución bloqueadora. La nitrocelulosa puede permanecer en la solución
bloqueadora 1-16 horas.
13. Lavar la hoja de nitrocelulosa en PBS-Tween 0,05% por 10 minutos. Repetir el lavado
2 veces más.
14. Añadir el anticuerpo primario e incubar en agitación por 1-2 horas.
15. Lavar como en el paso 13.
16. Incubar la nitrocelulosa con el conjugado por 1-3 horas.
17. Lavar como en el paso 13.
18. Incubar con el sustrato por 10 minutos.
19. Lavar con agua destilada. Secar.
20. Realizar la lectura.

Papel filtro Membrana NC

Rejilla

Esponja

Esponja y papel filtro humedecidos Membrana de nitrocelulosa humedecida

sobre la rejilla sobre el papel filtro

Cámara de
Gel

Gel sobre la membrana de nitrocelulosa Casette cerrado en el interior de la

cámara de transferencia
RESULTADOS

La presencia de anticuerpos específicos contra los componentes antigénicos del antígeno

a ensayar revelará un patrón de reactividad compuesto por bandas de precipitación de
color marrón oscuro.

CUESTIONARIO

1. ¿Cuáles son las etapas del Western blot?

2. ¿Qué tipos de muestras se pueden resolver por SDS PAGE?
3. ¿Qué métodos se utilizan para realizar la transferencia de péptidos a membranas?
4. ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de cada método de transferencia?
5. ¿Qué métodos de revelado de los inmunocomplejos se utilizan en el western blot?

BIBLIOGRAFÍA

• Harlow E, Lane D. Antibodies: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory,

Cold Spring Harbor, New York, 1988.
• Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from
polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc.
Natl Acad Sci USA 76: 4350-4354, 1979.

SOLUCIONES BLOQUEADORAS

Tampón bloqueador Composición

Blotto Leche descremada 5% (p/v)
Azida de sodio 0,02% en PBS
Blotto/Tween Leche descremada 5% (p/v),
Tween 20 0,2%
Azida de sodio 0,02% en PBS
Tween Tween 20 0,2%
Azida de sodio 0,02% en PBS
BSA BSA
(libre de IgG, fracción V de Cohn) 3%
Azida de sodio 0,02% en PBS
Suero de caballo Suero de caballo 10%
Azida de sodio 0,02% en PBS
(De: Harlow E, Lane D. Antibodies: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor, pp. 496-497, 1988)
 PRUEBAS INMUNOCROMATOGRÁFICAS

INTRODUCCIÓN

La inmunocromatografia es un inmunonsayo en que las reacciones antígeno-anticuerpo

toman lugar en dos puntos sobre una membrana. Las principales ventajas de la técnica
son la rapidez, su fácil ejecución y la necesidad de mínimos requerimientos de
equipamiento.
Las pruebas inmunocromatográficas fueron inicialmente desarrolladas para ayudar en el
diagnóstico de enfermedades infecciosas, prueba de ello es que los primeros productos
comerciales fueron para el diagnóstico de malaria, sífilis, hepatitis B, etc. El éxito de la
técnica ha hecho que su aplicación trascienda el ámbito de las enfermedades y hoy se
puede ver su uso en la detección de drogas, identificación bacteriana presuntiva,
identificación de carnes en alimentos procesados, etc. El ejemplo más representativo de
aceptación masiva son las pruebas de embarazo de uso doméstico, que se adquieren en
las farmacias.
Las pruebas inmunocromatográficas o de flujo lateral tienen dos presentaciones básicas:
cassette y en tira.
La inmunocromatografía se basa en la migración de una muestra a través de una
membrana de nitrocelulosa. La muestra es añadida en la zona del conjugado, el cual está
formado por un anticuerpo específico contra uno de los epítopes del antígeno a detectar y
un reactivo de detección. Si la muestra contiene el antígeno éste se unirá al conjugado
formando un complejo inmune, el cual migrará a través de la membrana de nitrocelulosa.
De lo contrario, migrarán el conjugado y la muestra por separado. La zona de captura está
formada por un segundo anticuerpo específico contra otro epítopo del antígeno. Al llegar
la muestra a esta zona, los complejos formados por la unión del antígeno y conjugado
quedarán retenidos y la línea se coloreará (muestras positivas). En caso contrario las
muestras son negativas. La zona control está formada por un tercer anticuerpo que
reconoce al reactivo de detección. Cuando el resto de muestra alcanza esta zona, el
anticuerpo se unirá al conjugado libre que no ha quedado retenido en la zona de captura.
Esta línea es un control de que el ensayo ha funcionado bien, porque se colorea siempre,
con muestras positivas y negativas.
 Cassette Tira (“stick”)

LOGRO

• Llevar a cabo pruebas inmunocromatográficas para detectar antígenos o anticuerpos

en suero, orina o sangre.
• Comparar los tipos de pruebas inmunocromatográficas ensayadas, estableciendo
aplicaciones, ventajas y limitaciones en el inmunodiagnóstico.

DIAGNÓSTICO INMUNOLÓGICO DEL EMBARAZO

La gonadotropina coriónica humana (hCG) es producida por el tejido trofoblástico y

aparece alrededor de 8 y 9 días después de la ovulación cuando haya ocurrido la
fertilización, o alrededor de los 4 días después de la concepción. En un ciclo de 28 días con
ovulación en el día 14 se puede detectar la hCG en la orina o en cantidades menores
alrededor de 23 días, o 5 días antes de la esperada menstruación. Su función incluye la
facilitación de la implantación, así como el mantenimiento y el desarrollo del cuerpo lúteo.
La concentración de la hormona se duplica aproximadamente cada 2 días y aumenta entre
7 a 12 semanas después del primer día del último periodo de menstruación con una
concentración media de 50.000 mIU/mL. Se han reportado concentraciones de un valor
alto 100.000 mIU/mL en embarazos normales durante el primer trimestre. En sujetos
normales, la HCG en orina proporciona una indicación temprana del embarazo. Dado que
los niveles elevados de HCG también se asocian con la enfermedad trofoblástica y ciertas
neoplasias nontrophoblastic, se debe eliminar la posibilidad de tener estas enfermedades
antes de realizar un diagnóstico de embarazo.
La prueba OnSite HCG Combo Rapid Test está diseñada para cumplir todos los requisitos
en la obtención de resultados cualitativos rápidos y fáciles de leer, con el propósito de
detectar un embarazo prematuro mediante el ensayo de hCG, una hormona placentaria
que pueden estar presente en el plasma u orina humanos.
PRINCIPIO DE LA PRUEBA
La prueba rápida OnSite HCG Combo es un inmunoensayo cromatográfico de flujo lateral.
El casete de prueba contiene: 1) una almohadilla de conjugado de color vino tinto el cual
contiene conjugado de anticuerpo monoclonal anti-HCG con oro coloidal (conjugados HCG
Ab), 2) una tira de membrana de nitrocelulosa que contiene una banda de prueba (banda
T) y una banda de control (banda C). La banda T se encuentra pre-recubierta con otro
anticuerpo anti-HCG, y la banda C se encuentra prerecubierta con anticuerpo de cabra
anti-IgG de ratón.

Cuando un volumen adecuado de muestra de ensayo se vierte en la almohadilla de la tira

de prueba, la muestra migra por acción capilar a través de la tira. Si hay presencia de HCG
en la muestra en un nivel igual o superior a 25 mIU/mL éste se une a los conjugados HCG
Ab. El immunocomplejo es capturado en la membrana por el anti-HCG Ab pre-recubierto,
formando una banda T de color vino tinto, indicando un resultado positivo de la prueba
para HCG. La ausencia de la banda T sugiere un resultado negativo. La prueba contiene un
control interno (banda C) que debe presentar una banda de color vino tinto del
inmunocomplejo de cabra anti-IgG de ratón / IgG de ratón conjugado de oro
independientemente del desarrollo de color en la banda T. De otro modo, el resultado de
la prueba no es válido y la muestra debe ser analizada de nuevo con otro dispositivo.
MATERIALES

Bolsas de aluminio selladas que contiene:

a) Un dispositivo de cinta para prueba de embarazo
b) Un gotero plástico
c) Un desecante
d) Un inserto (instrucciones de uso)

METODOLOGÍA

1. Lleve los componentes de muestras y ensayos a temperatura ambiente en caso de

estar refrigerados o congelados Una vez descongelada, mezcle bien la muestra antes
de realizar el análisis.
2. Cuando esté listo, abra el empaque de aluminio por la muesca y retire el dispositivo.
Ubique el dispositivo de prueba sobre una superficie limpia y plana
3. Asegúrese de marcar el dispositivo con el número de muestra.
4. Llene el gotero plástico con la muestra. Mantenga el gotero verticalmente, vierta de 2
a 3 gotas (cerca de 60 a 90 uL) de la muestra en la cavidad para muestras
asegurándose de que no se produzcan burbujas de aire.
Nota: Añada 1 gota de solución salina o tampón fosfato salino (tampones comunes
utilizados en la clínica no proporcionado en el kit) en la cavidad de la muestra en caso
de no observarse la migración de flujo dentro de 30 segundos en la ventana de
resultados cuando se está analizando con muestras de suero o plasma, lo cual podría
ocurrir con una muestra altamente viscosa.
5. Programe el cronómetro.
6. Los resultados pueden leerse en el transcurso de 10 minutos. Los resultados positivos
son visibles en un tiempo de 1 minuto

RESULTADOS

RESULTADO NEGATIVO: Si sólo aparece la banda C, la prueba indica que no hay HCG
detectable presente en la muestra En este caso el resultado es negativo
RESULTADO POSITIVO: Si además de presentarse una línea en la banda C, se genera la
banda T, la prueba indica la presencia de HCG en la muestra. En este caso el resultado es
positivo

RESULTADO INVALIDO: Si no se genera una banda C, el ensayo no es válido sin importar

mediciones de HCG. que se haya creado una línea de color la banda T como se muestra a
continuación. El análisis se debe repetir con un nuevo dispositivo.

DIAGNÓSTICO INMUNOLÓGICO DE LA MALARIA

PRUEBA OptiMAL®

OptiMAL® es una prueba rápida para malaria, para diagnosticar la infección por especies
del género Plasmodium y llevar a cabo el control del tratamiento terapéutico.
La prueba se basa en la detección de isoformas de la enzima lactato deshidrogenasa del
parásito (pLDH) empleando anticuerpos monoclonales. No hay reacción cruzada con la
LDH humana.

MATERIALES
a) Tiras recubiertas con anticuerpos f) Pipeta automática de 2-20 L
contra la pLDH g) Pipeta automática de 40-200 L
b) Muestra problema h) Puntas de 2-20 L
c) Buffer A i) Puntas de 40-200 L
d) Buffer B j) Bocal con lejía
e) Placa de microtitulación
METODOLOGÍA

1. Colocar 2 gotas del buffer A en un pocillo de la microplaca.

2. Agregar 10 μL de la muestra de sangre al pocillo conteniendo el buffer A.
3. Colocar la tira de la prueba OptiMAL verticalmente en el pocillo conteniendo la muestra
y esperar 10 minutos. La sangre migra hacia la almohadilla y la línea control aparecerá
progresivamente.
4. Agregar buffer B en otro pocillo de la microplaca.
5. Trasladar la tira de prueba al pocillo que contiene el buffer B. Esperar que la tira aclare.
6. Cuando la línea control llega a ser claramente visible (~ 5-10 minutos), entonces se
procede a la lectura.

RESULTADOS

• NEGATIVO: sólo se observa la línea control.

• POSITIVO para género: se observan dos líneas de reacción, una corresponde al control
y la otra, situada inmediatamente por debajo, corresponde a P. vivax/P. malariae/P.
ovale.
• POSITIVO para P. falciparum: se observan tres líneas de reacción, una corresponde al
control, la siguiente a P. vivax/P. malariae/P. ovale y la que está más alejada
pertenece a P. falciparum.

Negativo

P. vivax

P. falciparum

CUESTIONARIO

1. Mencione 10 limitaciones de la prueba inmunocromatográfica para diagnóstico de

embarazo.
2. Elabore una curva de la dinámica de la HCG durante todo el embarazo.
3. ¿Cuáles son las sustancias químicas de potencial interferencia en la prueba de
embarazo y sus concentraciones?
4. ¿Qué es el fenómeno de antigenemia en el diagnóstico de malaria mediante pruebas
inmunocromatográficas?
5. ¿Qué antígenos se han venido detectando con pruebas inmunocromatográficas para
diagnosticar malaria?
6. ¿Cuáles son las ventajas y limitaciones de las pruebas inmunocromatográficas usadas
para diagnosticar malaria?
7. ¿Cuál es la utilidad de las pruebas inmunocromatográficas en los puntos de atención
primaria?
8. Elabore una guía de práctica de una prueba inmunocromatográfica para detectar
anticuerpos contra antígenos de Treponema pallidum o Antígeno de Core del virus de
la hepatitis B.
9. Elabore una guía de práctica de una prueba inmunocromatográfica para detectar algún
metabolito de droga (cocaína, marihuana) o fármaco.

BIBLIOGRAFÍA

• Wilcox, A. J.: [Link] J. Med., 1988, 319:189.

• Dawood, M. Y.: Ob. Gyn., 1990, 126:678.
• Palmer CJ, Lindo JK, Klaskala WI, Quesada JA, Kaminsky R, Baum MK y col. Evaluation of
the OptiMAL test for rapid diagnosis of Plamodium vivax and Plasmodium falciparum
malaria. J Clin Microbiol 1998; 36:203-206.
 GUIA PRÁCTICA Nº 04 SEMANA 5
PRUEBAS DE INMUNODIFUSIÓN EN GEL
DOBLE DIFUSIÓN E INMUNODIFUSIÓN RADIAL
OBJETIVO Describir, realizar e interpretar las técnicas de inmunodifusión
en gel: inmunodifusión doble e inmunodifusión radial.
LOGRO A MEDIR • Realizar la inmunodifusión doble de antígenos o anticuerpos para
comparar e identificar el tipo de reacción de identidad.
• Determinar la relación y composición de tres antígenos.
• Realizar el dosaje de clases de inmunoglobulinas mediante
inmunodifusión radial y elaborar curvas de calibración utilizando
estándares o sueros referencia.

INMUNODIFUSIÓN DOBLE

INTRODUCCIÓN
La inmunodifusión doble se puede definir como una reacción de precipitación en un gel de
agarosa, en la que se enfrentan antígenos y anticuerpos situados en pocillos circulares
adyacentes, para que difundan y formen líneas de precipitación visibles en el lugar en
donde se encuentran las concentraciones óptimas del antígeno y del anticuerpo.
En la inmunodifusión doble al colocar dos antígenos en pocillos adyacentes y enfrentarlos
a un antisuero que los reconoce, se pueden obtener los patrones de identidad, identidad
parcial y no identidad, según el caso.
La prueba de inmunodifusión doble permite identificar múltiples sistemas antígeno-
anticuerpo, y puede usarse también para hacer una estimación cuantitativa de la pureza
del antígeno o del anticuerpo. La técnica es muy utilizada en el análisis semicuantitativo
de la concentración del antígeno, para conocer el título precipitante de un anticuerpo o
para establecer relaciones de similitud o diferencia entre los antígenos evaluados.

MATERIALES

a) Antígenos: Nº 1, 2 y 3 g) Láminas portaobjetos

b) Antisuero: anti-Ag Nº2 desengrasadas
c) Agar al 1,2% en solución salina h) Cámara húmeda
tamponada pH 7,2 i) Patrón para cortar gel
d) Solución salina tamponada pH j) Cortadores de gel
7,2 k) Pipeta automática de 20 L
e) Colorante amido black l) Bocal con lejía
f) Pipeta de 5 mL

1. Colocar 3,5 mL de agar licuado en una lámina portaobjetos. Dejar gelificar a

temperatura ambiente.
2. Poner la lámina sobre el diagrama adecuado para la prueba y cortar en el gel
excavaciones para los antígenos y el antisuero.
3. Dispensar 20 L de los antígenos y del antisuero en los pocillos correspondientes.
4. Depositar la lámina en cámara húmeda e incubar por 24-48 horas a temperatura
ambiente.
5. Realizar la lectura de la lámina, hacer un esquema de los resultados obtenidos y
continuar con los pasos de lavado, desmineralización, secado y coloración.

RESULTADOS

• Observar e identificar el tipo de reacción de identidad.

• Determinar la relación existente entre los 3 antígenos evaluados.

1,2
1,3 1 1

Ac Ac
Anti-1 Anti-1,2
Reacción de identidad Reacción de identidad parcial

CUESTIONARIO
1. La inmunodifusión doble es una prueba cualitativa o semicuantitativa. Explique
brevemente.
2. A nivel de diagnóstico clínico ¿qué enfermedades pueden ser diagnosticadas mediante
una prueba de inmunodifusión doble?
3. ¿Cómo realizaría la inmunodifusión doble para obtener el título de un anticuerpo?
4. Grafique los resultados que encontraría en las siguientes pruebas de doble difusión:

A
1. Suero humano
2. Anti Ig G
3. Anti Ig M

B 1. Suero humano
total
2. Anti suero
humano total
3. Anti C4

C 1. Anti suero
humano total
2. Suero humano
total
3. C3
4. C4
5. Transferrina

BIBLIOGRAFÍA

• Clausen J. Immunochemical techniques for the identification and estimation of

macromolecules, 2da. ed., Elservier/North-Holland Biochemical Press, Amsterdan,
1981.
• Milford-Ward A. Immunoprecipitation in the evaluation of the proteins in plasma and
body fluids. En: Techniques in clinical immunology, Thompson R A (ed.), Blackwell
Scientific Publications, Oxford, Cap.1, 1997.
• Ouchterlony Ö, Nilsson L A. Immunodiffusion and immunoelectrophoresis. En :
Handbook of experimental immunology, Weir DM (ed.), 3ra. ed., Blackwell Scientific
Publications, Oxford, Vol. 1 Immunochemistry, Cap. 19, 1978.
 INMUNODIFUSIÓN RADIAL
CURVAS DE CALIBRACIÓN PARA LA PRUEBA DE INMUNODIFUSIÓN RADIAL

INTRODUCCIÓN

Es un método de precipitación que consiste en incorporar el anticuerpo específico en el

agar y colocar el antígeno en pocillos horadados en la misma placa. El antígeno difunde en
forma radial dentro del gel dando lugar a la formación de un anillo de precipitación. El
diámetro del anillo de precipitación está en relación directa con la concentración del
antígeno.
La inmunodifusión radial es utilizada en la cuantificación de antígenos solubles y tiene
gran valor en la determinación de niveles séricos de inmunoglobulinas, componentes del
complemento, proteínas transportadoras e inhibidores de enzimas de importancia clínica.
Su desarrollo no requiere equipo costoso, además de ser un método fácil de implementar
en el laboratorio. Sin embargo, es una técnica lenta y poco sensible debido a que necesita
mucha cantidad de anticuerpos para que se formen complejos inmunitarios.
En la técnica de inmunodifusión radial los anticuerpos en suspensión se mezclan con
agarosa en estado líquido, y luego este se vierte sobre una placa. Una vez solidificada la
agarosa se hacen pocillos, los cuales contendrán las muestras de suero. Se deja incubar,
de modo que el suero con las inmunoglobulinas difunda por la agarosa y reaccione con los
anticuerpos embebido en la placa. Luego de 24 h se observa un precipitado entre antígeno
y anticuerpo como una línea blanca que rodea al pocillo. El diámetro de este círculo es un
reflejo de la concentración de inmunoglobulinas (antígeno) que teníamos en la muestra de
suero, de modo que a mayor diámetro, mayor concentración de antígeno.
Para cuantificar la cantidad exacta de inmunoglobulinas se requiere construir una línea
recta o estándar. Esta recta se hace a partir de muestras de inmunoglobulinas conocidas
(estándares) en cada pocillo, que reaccionen con los anticuerpos; en el eje X el diámetro
del círculo y en el eje Y la concentración de inmunoglobulinas conocida. Al final se
comparan los valores obtenidos de la muestra de suero frente a los valores de la línea
patrón, obteniéndose así el valor de la concentración de inmunoglobulinas para cada
muestra de suero evaluada.

LOGROS

• Reconocer las etapas al efectuar la inmunodifusión radial simple de una muestra de suero
humano.
• Determinar la concentración de IgG sérica humana por los métodos de Mancini y Fahey.
MATERIALES

a) Sueros de referencia humanos d) Pipeta automática de 5 L

(concentración: alta, mediana y baja) e) Ocular milimétrico
b) Sueros de pacientes f) Papel milimetrado semilogarítmico
c) Placas con agar al 1,5% con anti-IgG de dos ciclos y/o papel milimetrado
g) Bocal con lejía

METODOLOGÍA

1. Sacar la placa y los sueros de referencia del

refrigerador. Equilibrar los reactivos a
temperatura ambiente.
2. Retirar la tapa de la placa e inspeccionar si hay
rastros de humedad. Si hubiera humedad, dejar
que la placa permanezca a temperatura
ambiente sin tapa (aproximadamente 15
minutos) hasta que se haya evaporado la
humedad.
3. Mezclar los sueros de referencia y las muestras
de los pacientes, invirtiéndolos
completamente.
4. Depositar 5 L de los sueros de referencia y de las muestras en los pocillos
correspondientes.
5. Colocar la tapa con firmeza e incubar a temperatura ambiente (232 °C) sobre una
superficie nivelada. El tiempo de incubación se determina según la clase de
inmunoglobulina que se está midiendo y el método que se haya elegido (difusión a
punto final o a tiempo limitado) (Cuadro N°1).
6. Medir los diámetros de los anillos de precipitación con incrementos próximos a 0,1
mm. Preparar la curva de referencia.
RESULTADOS

Obtener la concentración de las muestras analizadas colocando cada diámetro del anillo
de precipitación en la curva de referencia y leyendo la concentración correspondiente en
la escala logarítmica (difusión a tiempo limitado) (Fig.1), o colocando el cuadrado del
diámetro del anillo de la muestra en la curva de referencia y leyendo la concetración
correspondiente en el eje Y (difusión a punto final) (Fig. 2).
 CONCENTRACION (mg/dL)

DIAMETRO DEL ANILLO (mm)

Figura 1. Gráfico semilogarítmico de la muestra analizada por difusión a tiempo

limitado.
CONCENTRACION (mg/dL)

DIAMETRO DEL ANILLO AL CUADRADO (mm2)

Figura 2. Gráfico lineal de la muestra analizada

por difusión a punto final.
Cuadro Nº1 – Volumen y tiempo de incubación según método para la determinación de
inmunoglobulinas por inmunodifusión radial.

Tiempo de incubación (h)

PLACA Volumen del suero* Método gráfico
(L) Difusión a tiempo Difusión a punto
limitado ** final***

Ig G 5 18 + 0.5  48
Ig A 5 18 + 0.5  48
Ig M 5 18 + 0.5  72
Ig D 5 -  48

* Referencia y del paciente.

** Gráfico semilogarítmico: trazar una línea de punto a punto.
*** Gráfico lineal: trazar la línea recta que mejor encaje.

CUESTIONARIO

1. ¿Cómo debería proceder si los resultados revelan que la concentración de la muestra

(por ejemplo, IgG) está por encima del estándar de alta concentración?
2. ¿Cómo debería proceder si los resultados revelan que la concentración de la muestra
(por ejemplo, C3) está por debajo del estándar de baja concentración?
3. Si quiere cuantificar la IgG en un paciente con mieloma ¿qué procedimiento debería
seguir la muestra problema?
4. ¿Qué aplicaciones tiene la inmunodifusión radial en el diagnóstico de enfermedades?

5. Elaborar la curva de calibración con los datos obtenidos en la prueba de

Inmunodifusión Radial para dosaje de IgG, Ig M y C3 según la tabla 1. Pegar cada
papel milimetrado o semilogarítmico en una hoja bond A4 colocando el título y leyenda
de cada curva.
 TABLA 1

SUEROS DE REFERENCIA ALTO Tiempo de

PROTEINA MEDIO Y BAJO Difusión Gráfica Papel
N°1 N°2 N°3

Ig G 2350 1155 300 18 h

mg/dL mg/dL mg/dL
(diámetro) 7,8 mm 6,3 mm 3,7 mm
Ig G 2350 1155 300 48 h
mg/dL mg/dL mg/dL
(diámetro) 8,7 mm 6,5 mm 4,0 mm
Ig M 240 115 30 18 h
mg/dL mg/dL mg/dL
(diámetro) 7,6 mm 6,1 mm 3,6 mm
Ig M 240 115 30 72 h
mg/dL mg/dL mg/dL
(diámetro) 7,8 mm 6,3 mm 3,8 mm
C3 250 125 22 mg/dL 18 h
mg/dL mg/dL
(diámetro)
7,3 mm 5,7 mm 3,6 mm
C3 250 125 22 48 h
mg/dL mg/dL mg/dL
(diámetro) 7,7 mm 5,9 mm 3,8 mm

6. Obtener las concentraciones de Ig G, Ig M y C3 de las muestras A B y C utilizando las

gráficas anteriores y con los datos de la tabla 2.

TABLA 2

Ig G Ig M C3
MUESTRAS Diámetro Tiempo de Diámetro Tiempo de Diámetro Tiempo de
(mm) Difusión (mm) Difusión (mm) Difusión
A 6,0 18 h 7,0 72 h 7,0 18 h

B 5,4 18 h 6,6 72 h 5,8 18 h

C 6,2 48 h 3,9 72 h 4,2 48 h

 RESULTADOS

Ig G Ig M C3
MUESTRAS
Concentración Tiempo Concentración Tiempo Concentración Tiempo
(mg/dL) de (mg/dL) de (mg/dL) de
Difusión Difusión Difusión
A 18 h 72 h 18 h

B 18 h 72 h 18 h

C 48 h 72 h 48 h

BIBLIOGRAFÍA

• Milford-Ward A. Immunoprecipitation in the evaluation of the proteins in plasma and

body fluids. En: Techniques in clinical immunology, Thompson R A (ed.), Blackwell
Scientific Publication, Oxford, Cap. 1, 1977.
• Palmer D F, Woods R. Qualitation and quantitation of immunoglobulins, U.S.
Department of Health, Education, and Welfare, Center for Disease Control, Atlanta,
DHEW Publication Nº (CDC) 74-8102, 1972.
• Ochterlony Ö, Nilsson L A. Immunodiffusion and immunoelectrophoresis. En: Handbook
of experimental immunology, Weir DM (ed.), 3ra ed., Blackwell Scientific Publications,
Oxford, Vol. 1 Immunochemistry, Cap. 19, 1978.
• Sanofi Diagnostics Pasteur. Manual de instrucciones “Kallestad TM EndoplateTM single
radial immunodiffusion test kits”, 1994.
• Wikipedia. Inmunodifusión radial. Disponible en la siguiente dirección:
• [Link]
 GUIA PRÁCTICA Nº 05 SEMANA 6
PRUEBAS DE AGLUTINACIÓN EN LÁMINA, TUBO, HEMAGLUTINACIÓN PASIVA Y
CON PARTÍCULAS DE LÁTEX
OBJETIVO Describir, realizar e interpretar las diversas técnicas de
aglutinación : en lámina, tubo, hemaglutinación pasiva y con
partículas de látex.
LOGRO A MEDIR • Realizar las diversas técnicas de aglutinación en lámina o tubo
aplicadas en el diagnóstico de patologías humanas e investigación
básica.
• Determinar los TITULOS de las muestras problemas de
acuerdo al tipo de diluciones realizadas y técnica.
• Elaborar patrones de turbidez para la lectura de pruebas de
aglutinación en tubo con antígenos no coloreados.
• Realizar la determinación cualitativa y/o semicuantitativa y
cuantitativa de antígenos o anticuerpos en muestras
problemas mediante aglutinación de partículas de látex.

AGLUTINACIÓN EN LÁMINA
INTRODUCCIÓN

La aglutinación toma lugar cuando antígenos particulados, por ejemplo eritrocitos o

bacterias, reaccionan con anticuerpos específicos bajo adecuadas condiciones de reacción.
La aglutinación se lleva a cabo en dos etapas, los anticuerpos primero se unen con el
antígeno y luego se produce la aglutinación. El anticuerpo que participa en este tipo de
reacción es llamado “completo”. Algunas veces sólo toma lugar la primera etapa y el
anticuerpo es denominado “incompleto”.
Este método tiene la ventaja de su rapidez y simplicidad, pero la desventaja de ser menos
sensible que la prueba en tubo y el de poder presentar aglutinaciones inespecíficas.
La disponibilidad comercial de muchas suspensiones bacterianas estandarizadas permite
al laboratorio de Inmunología Clínica llevar a cabo un diagnóstico tentativo de una
enfermedad infecciosa aun cuando la bacteria no sea aislada del paciente. El diagnóstico
se obtiene evaluando el suero con varios tipos de antígenos. La prueba se emplea en el
diagnóstico de fiebre tifoidea, brucelosis y rickettsiosis.
MATERIALES

a) Antígenos bacterianos comerciales e) Propipetas

b) Sueros problema f) Palitos mondadientes
c) Pipeta serológica de 0,2 mL g) Lámpara fluorescente
d) Lámina excavada h) Bocal con lejía

METODOLOGÍA

1. Con la pipeta de 0,2 mL, depositar 0,08; 0,04; 0,02; 0,01 y 0,005 mL del suero problema
en las excavaciones de la lámina de vidrio. Repetir este procedimiento si más de un
antígeno es usado.
2. A cada gota de suero, añadir una gota de antígeno. Evitar que el gotero del antígeno
toque las gotas de suero. Agitar previamente los frascos de los antígenos bacterianos
hasta obtener la mezcla completa de sus contenidos. El gotero con que viene cada
antígeno debe liberar aproximadamente 0,03 mL.
3. Con un mondadientes, mezclar el suero y el antígeno con movimientos circulares,
empezando por la dilución más alta. Usar un mondadientes para cada suero. El
volumen de antígeno (0,03 mL) al ser mezclado con los diferentes volúmenes de suero,
dará diluciones que se aproximan a aquellas obtenidas con la prueba en tubo y son
1:20, 1:40, 1:80, 1:160 y 1:320, respectivamente.
4. Inmediatamente luego de mezclar, inclinar la lámina de aglutinación hacia adelante y
hacia atrás por 2 u 8 minutos (el tiempo depende del antígeno bacteriano empleado).
5. Colocar la lámina por encima de una lámpara fluorescente y observar la aglutinación.

RESULTADOS

• La aglutinación se evidencia por la formación de grumos.

• El título está dado por la inversa de la máxima dilución del suero que aglutina más del
50% del antígeno bacteriano.

CUESTIONARIO

1. ¿Cómo se obtiene el título de la muestra problema?

2. ¿Qué es el efecto prozona?
3. ¿Cómo se informa el resultado de la prueba?
4. ¿Cómo se realiza el control de calidad de los antígenos bacterianos para pruebas de
aglutinación?
5. ¿Qué es el título diagnóstico?
6. Si un suero problema da aglutinación hasta el último pocillo, ¿Qué debe hacerse para
obtener el título final de la prueba?
7. Mencione 10 ejemplos de aplicación clínica de las pruebas de aglutinación en lámina.

BIBLIOGRAFÍA

• Difco Laboratories. Hoja de instrucciones “Detection of Salmonella antibodies with

Bacto-Widal antigen set and Bacto-Salmonella O and H antigens”, 1979.
• Sundick R S, Rose N R. Agglutination reactions. En: Methods in immunodiagnosis, Rose
N R, Bigazzi P E (ed.), 2da. ed., John Wiley & Sons, New York, Cap. 8, 1980.

AGLUTINACIÓN EN TUBO

INTRODUCCIÓN

La prueba de aglutinación en tubo es una prueba semicuantitativa que consiste en

determinar cuál es la máxima dilución del suero capaz de aglutinar el antígeno específico.
Las diluciones generalmente se hacen seriadas y al doble, y el título se expresa como la
inversa de la máxima dilución aglutinante.
Esta prueba se utiliza para la confirmación de la prueba rápida en lámina. Su ventaja en
relación a la prueba en lámina es que da un mayor grado de confiabilidad debido a que
hay menor error de dilución del suero, y a que hay más precisión en las lecturas de la
reacción. La desventaja es el gasto de material y el mayor tiempo de las incubaciones. A
pesar de ello, es una metodología de singular importancia, debido a que efectuada en
forma seriada, la variación de título de anticuerpos puede ser muy útil para seguir la
evolución de una infección bacteriana o una isosensibilización por antígenos hemáticos.
LOGROS

• Realizar la prueba de aglutinación en tubo de una muestra de suero humano.

• Realizar la lectura contra los patrones de turbidez y determinar los niveles de anticuerpos
séricos contra Brucella o Salmonella. Interpretar los resultados de la prueba.

MATERIALES

a) Antígenos bacterianos comerciales h) Pipeta de 1 mL

b) Sueros problema i) Parafilm
c) Solución salina j) Lápiz de vidrio
d) Controles de turbidez k) Gradilla
e) Tubo de 16x150 mm l) Portapipetas
f) Tubos de 13 x 100 mm de vidrio claro y m)Propipetas
limpio n) Baño maría a 37ºC y 48-50ºC
g) Pipeta de 5 mL o) Bocal con lejía

METODOLOGÍA

1. Enumerar los tubos del 1 al 8.

2. Hacer diluciones del suero según el siguiente protocolo de trabajo:

Tubos
1 2 3 4 5 6 7 8

Salina (mL) 0,8 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Suero (mL) 0,2 Mezclar y pasar 0,5 mL al segundo tubo y repetir la
operación hasta el tubo 7. Descartar 0,5 mL del
tubo 7.

Dilución 1/5 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 -

3. Diluir el antígeno 1/20 en salina en un volumen final de 5 mL para cada prueba (4,75
mL de salina y 0,25 mL de antígeno).
4. Añadir 0,5 mL de antígeno a cada tubo. Tapar los tubos con parafilm.
5. Mezclar el contenido de los tubos e incubarlos de acuerdo al siguiente cuadro:

Antígeno Tiempo Temperatura

Salmonella O 18 - 24 horas 48-50 °C
Salmonella H 1 hora 48-50 °C
Brucella 48 horas 37 °C

6. Leer las reacciones con ayuda de los patrones de turbidez. Utilice una lámpara
fluorescente contra un fondo oscuro.

RESULTADOS

• Observar en cada tubo el grado de turbidez del líquido sobrenadante y la cantidad de

bacterias aglutinadas. Una aglutinación completa en la que se observa el líquido
sobrenadante totalmente claro indica que todas las bacterias han sido aglutinadas, lo
cual se evidencia por los grumos que se depositan en el fondo del tubo.
• La aglutinación se lee según el grado de turbidez que presenten los sobrenadantes:

Positivo 4+ el 100% de las bacterias estan aglutinadas y el líquido sobrenadante está

claro.
Positivo 3+ aproximadamente el 75% de las bacterias están aglutinadas y el líquido
sobrenadante está ligeramente turbio.
Positivo 2+ aproximadamente el 50% de las bacterias estan aglutinadas y el líquido
sobrenadante está moderadamente turbio.
Positivo 1+ aproximadamente el 25% de las bacterias estan aglutinadas y el líquido
sobrenadante está turbio.
Negativo - ausencia de aglutinación y se aprecia una turbidez uniforme. Esta reacción
se debe observar en el tubo 8 (control negativo).
• El título del suero estará dado por aquella dilución en que se observe al menos 2 +
(50%) de aglutinación.

CUESTIONARIO

1. ¿Cómo se realiza la lectura de la prueba?

2. ¿Qué es un patrón de turbidez?
3. ¿Cómo se obtiene el título de la muestra problema?
4. ¿Qué se evidencia el efecto prozona?
5. ¿Cómo se informa el resultado de la prueba?
6. ¿Qué es el título diagnóstico?
7. ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de las pruebas de aglutinación en tubo?
8. Si un suero problema da aglutinación hasta el último pocillo, ¿Qué debe hacerse para
obtener el título final de la prueba?
9. Mencione 10 ejemplos de aplicación clínica de las pruebas de aglutinación en lámina.

BIBLIOGRAFÍA

• Difco Laboratories. Hoja de instrucciones “Detection of Salmonella antibodies with

Bacto-Widal antigen set and Bacto-Salmonella O and H antigens”, 1979.
• Sundick R S, Rose N R. Agglutination reactions. En: Methods in immunodiagnosis, Rose
N R, Bigazzi P E (ed.), 2da ed., John Wiley & Sons, New York, Cap. 8, 1980.
 HEMAGLUTINACIÓN PASIVA

INTRODUCCIÓN

En la hemaglutinación pasiva el antígeno soluble (extractos de bacterias, hongos,

protozoarios o helmintos, o proteínas o polisacáridos purificados) es adosado a la
superficie de eritrocitos, los cuales sirven como soporte del antígeno. Los eritrocitos de
animales como carneros o conejos, o del grupo sanguíneo O humano, funcionan como
portadores para detectar y titular los anticuerpos correspondientes por aglutinación. La
técnica es llamada hemaglutinación pasiva o indirecta porque no es el antígeno del
eritrocito sino los antígenos pasivamente acoplados o unidos los que reaccionan con los
anticuerpos. El método de acoplamiento de los antígenos a los eritrocitos depende de
antígeno con que se trabaje y de los recursos con que cuenta el laboratorio. Muchos
antígenos se acoplan de manera espontánea a los eritrocitos (antibióticos, DNA o
albúmina) mientras que otros (proteínas y extractos microbianos) necesitan de sustancias
químicas, por ejemplo, ácido tánico, glutaraldehído, 1,3,-difluoro- 4,6-dinitrobenceno o
cloruro crómico.
Las ventajas de emplear eritrocitos para recubrirlos con antígeno son: disponibilidad
inmediata, sensibles como indicadores y su posibilidad de ser almacenados por largos
períodos, principalmente cuando son tratados con formol o glutaraldehido.
Las pruebas de aglutinación pueden ser llevadas a cabo en tubos de ensayo
(macrométodo) o en placas de microtitulación (micrométodo).
Es necesario llevar a cabo controles de la prueba para asegurarse que los resultados
positivos son debido a la reacción de los anticuerpos contra los antígenos absorbidos y no
por anticuerpos naturales antieritrocitos (anticuerpos heterófilos). Una manera de
eliminar esta interferencia es absorbiendo las muestras de suero con eritrocitos lavados
no recubiertos del antígeno.
La prueba de hemaglutinación pasiva puede detectar anticuerpos a concentraciones tan
bajas como 0.03 µg/mL.
En la práctica se trabajará con antígenos de Salmonella typhi obtenidos por
calentamiento de un cultivo bacteriano en medio líquido.
LOGROS

• Realizar la prueba de hemaglutinación en tubo o microplaca de una muestra de suero humano.

• Realizar la lectura, determinar los niveles de anticuerpos séricos contra antígenos solubles de
Salmonella e interpretar los resultados de la prueba.
• Reconocer las ventajas y limitaciones de la prueba.

MATERIALES

a) Solución salina al 0,85% f) Gradilla para tubos de prueba

b) Suero positivo anti- S. typhi g) Propipeta
c) Eritrocitos sensibilizados al 2% h) Parafilm
d) Tubo de 13 x 100 mm i) Bocal con lejía
e) Pipetas de 1 mL

METODOLOGÍA

1. Enumerar los tubos del 1 al 8.

2. Colocar 0,4 mL de salina en el tubo 1 y 0,25 mL de salina en los tubos 2 al 8 (Cuadro
Nº1).
3. Agregar 0,1 mL de suero al tubo 1. Pasar 0,25 mL del suero del tubo 1 al tubo 2, mezclar
el contenido del tubo 2 y pasar 0,25 mL al tubo 3; repetir el procedimiento anterior y
continuar así hasta el tubo 7, descartar 0,25 mL del tubo 7. El tubo 8 no lleva suero, es
el tubo control.
4. Agregar 0,20 mL de eritrocitos sensibilizados al 2% a todos los tubos.
5. Agitar la gradilla y dejar en reposo hasta que sedimenten los eritrocitos
(aproximadamente 2 horas).

Cuadro Nº1 Protocolo de trabajo

Tubo

1 2 3 4 5 6 7 8

Sol. salina (mL) 0,40 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25
Suero (mL) 0,10 Mezclar y pasar 0,25 mL al tubo 2 y así
sucesivamente hasta el tubo 7.
Eritrocitos sens. (mL) 0.20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20
Dilución 1/5 1/10 1/20 1/40 1/80 1/80 1/160 -

RESULTADOS

Una reacción positiva se evidencia por una malla de eritrocitos que se deposita en el
fondo del tubo. Una reacción negativa presenta los eritrocitos sedimentados en forma de
botón.

(-) (-) (-)

(+) (+) (-)

El título del suero es la inversa de la máxima dilución que origina una hemaglutinación
completa.

CUESTIONARIO

1. ¿Qué es la heterofilia? ¿Con qué tipo de hematíes se puede presentar este tipo de
reacción?
2. ¿Cómo se pueden eliminar los anticuerpos heterófilos de una muestra de suero?
3. ¿En qué casos se prefiere optimizar una prueba de hemaglutinación pasiva en vez de
una prueba de precipitación?
4. Mencione 5 aplicaciones clínicas de la prueba de hemaglutinación pasiva.
5. ¿Cómo se determinan los títulos diagnósticos en las pruebas inmunoserológicas?

BIBLIOGRAFÍA

• Aguilar-García V. VI. Reacciones de aglutinación. Gac Med Mex 140: S50-S52, 2004.
• Herbert W J. Passive haemagglutination with special reference to the tanned cell
technique. En: Handbook of experimental immunology, Weir D M (ed.), 3ra ed.,
Blackwell Scientific Publications, Oxford, Vol I Immunochemistry, Cap. 20, 1978.
 AGLUTINACIÓN CON PARTÍCULAS DE LÁTEX

INTRODUCCIÓN

Las pruebas de aglutinación tienen como características sobresalientes ser rápidas y

sensibles. Por eso no resulta extraño que se hayan hecho muchos esfuerzos para
desarrollar partículas inertes que puedan ser usadas en las pruebas de aglutinación.
Dentro de estas partículas, la más ampliamente usada en la actualidad es el látex.
Se pueden incorporar antígenos o anticuerpos a las esferas de látex por absorción pasiva o
por métodos químicos. Por lo tanto, las partículas de látex pueden ser usadas para
detectar antígeno o anticuerpos.
Las pruebas basadas en la aglutinación de partículas de látex deben ser realizadas bajo
condiciones estandarizadas, debido a que la cantidad del complejo antígeno-anticuerpo
depende de factores como el pH, osmolaridad y concentración iónica de la solución.

LOGROS

• Realizar la prueba de aglutinación de látex cualitativa y semicuantitativa de una

muestra de suero humano.
• Realizar la lectura, determinar los niveles de anticuerpos séricos e interpretar los
resultados de la prueba, reconociendo sus ventajas y limitaciones

MATERIALES

a) Suero problema g) Pipetas serológicas de 1 mL

b) Látex sensibilizado con antígeno h) Láminas de vidrio
c) Buffer glicina i) Pipetas gotero
d) Control positivo j) Palitos mondadientes
e) Control negativo k) Reloj
f) Tubos de 10 x 75 mm l) Bocal con lejía

PRUEBA CUALITATIVA

METODOLOGÍA

1. Llevar los reactivos y la muestra problema a temperatura ambiente, y mezclarlos bien

antes de usarlos.
2. Colocar una gota (50 L) de la muestra, control positivo y control negativo en
diferentes círculos de la lámina de vidrio, empleando una pipeta gotero para cada uno
de ellos.
3. Añadir una gota (50 L) del reactivo de látex sobre los círculos con la muestra problema
y los controles.
4. Mezclar con los mondadientes hasta obtener una suspensión uniforme en toda la
superficie de cada círculo. Emplear un mondadientes para cada muestra.
5. Rotar suavemente la lámina por 2 minutos.

RESULTADOS

• La suspensión homogénea de la mezcla indica una aglutinación negativa. La presencia

de pequeños agregados indica una aglutinación positiva.

• La lectura de la lámina debe realizarse dentro de los 2 minutos siguientes al término de

la prueba, debido a que la evaporación de la mezcla de reacción puede conducir a
resultados falsos positivos.
PRUEBA SEMI-CUANTITATIVA

METODOLOGÍA

1. Enumerar seis tubos de 10 x 75 mm del 1 al 6.

2. Colocar 0,9 mL de buffer glicina en el tubo 1 y 0,5 mL en cada uno de los tubos
restantes.
3. Agregar 0,1 mL del suero al tubo 1 y mezclar. Transferir 0,5 mL de esta dilución al
tubo 2 y mezclar, continuando de esta forma las diluciones hasta el último tubo. Las
diluciones así obtenidas equivalen a 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160 y 1:320.
4. Ensayar cada dilución según la prueba cualitativa.

RESULTADOS

• Negativo: suspensión homogénea

Positivo: aglutinación en el tiempo especificado.
• El título de la muestra es la inversa de la máxima dilución a la que se produce
aglutinación visible macroscópicamente.

CUESTIONARIO

1. ¿Qué es el látex?
2. ¿Cómo se sensibiliza el látex con antígenos?
3. ¿Qué nombre recibe la prueba cuando el látex se sensibiliza con anticuerpos?
4. ¿Cómo se transforman los resultados semicuantitativos a cuantitativos?
5. ¿Mencione 5 aplicaciones clínicas de la aglutinación con partículas de látex para
detectar antígenos y anticuerpos?

BIBLIOGRAFÍA

• CRP-slide test. Folleto del reactivo comercial, Cal-Tech Diagnostics, Inc. Chino, C A,
1997.
• Inzana T J. Simplified procedure for preparation of sensitized latex particles to detect
capsular polysaccharides: application to typing and diagnosis of Actinobacillus
pleuropneumoniae. J Clin Microbiol 33:2297-2303, 1995.
• McCarthy L R. Latex agglutination tests for the rapid diagnosis of infections disease. En:
Rapid detection and identification of infectious agents, Kingsbury D T, Falkow S (ed),
Academic Press, Orlando, pp.165-175, 1985.
 GUIA PRÁCTICA Nº 06 SEMANA 7
DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE FIEBRE TIFOIDEA, BRUCELOSIS, SÍFILIS Y
MONONUCLEOSIS INFECCIOSA
OBJETIVO Realizar e interpretar las pruebas utilizadas en el diagnóstico de
fiebre tifoidea, Brucelosis, Sífilis y Mononucleosis infecciosa.
LOGRO A MEDIR • Medir los niveles de anticuerpos contra el antígeno O y H de S.
typhi en muestras de suero problema.
• Establecer la utilidad y limitaciones de la prueba de Widal.
• Determinar la presencia de anticuerpos contra el antígeno
somático de Brucella en muestras de suero problema
mediante la prueba de Rosa de bengala.
• Medir los niveles de anticuerpos contra el antígeno somático
de Brucella en muestras de suero problema, empleando la
aglutinación en tubo y el 2-mercaptoetanol.
• Analizar el algoritmo diagnóstico empleado en el diagnóstico
serológico de brucelosis.
• Determinar la presencia y título de anticuerpos contra el
antígeno no Treponémico del reactivo de VDRL en muestras
de suero problema.
• Analizar el algoritmo diagnóstico empleado en el diagnóstico
serológico de Sífilis.
• Medir los niveles de anticuerpos en muestras de suero
problema, utilizando la prueba de EBNA-IgG Elisa

DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE FIEBRE TIFOIDEA

INTRODUCCIÓN

La fiebre tifoidea es una enfermedad aguda que se diagnostica en el laboratorio a través

de métodos directos (hemocultivo, coprocultivo o urocultivo, menos frecuentemente por
bilicultivo o mielocultivo) o indirectos (detección de anticuerpos circulantes).
Luego de 7-10 días de iniciada la infección, aparecen en la sangre del paciente anticuerpos
(aglutininas) contra el bacilo tífico, aumentando su concentración durante la segunda y
tercera semana de evolución de la enfermedad. Los anticuerpos pueden persistir durante
semanas, meses o años después de la cura clínica del paciente.
La prueba de Widal se utiliza para detectar la presencia de la aglutinina H (flagelar) y la
aglutinina O (somática). Los anticuerpos contra el antígeno O aparecen luego de 6-8 días
de iniciada la enfermedad y desaparecen posteriormente entre 3 y 6 meses. Los
anticuerpos contra el antígeno H aparecen a los 8-14 días y pueden persistir por más de 1
año.
La prueba es positiva en el 15% de los casos durante la primera semana de evolución de la
enfermedad, con un aumento de la positividad hasta el 60-70% durante la tercera
semana. Sin embargo, existe dificultad en la interpretación de la prueba, y hay quienes le
dan escaso valor diagnóstico debido a las reacciones antigénicas cruzadas con otras
bacterias (principalmente enterobacterias, incluyendo salmonelas no tíficas), parásitos,
virus y hongos, lo que trae consigo un sobrediagnóstico de los síndromes febriles como
fiebre tifoidea.
La prueba de aglutinación de Widal también puede ocasionar falsos positivos en procesos
no infecciosos, como enfermedades autoinmunes y hepatopatías crónicas. Así mismo, la
prueba de Widal puede revelar resultados negativos para los antígenos H y O o la falta de
seroconversión en los títulos anti-O.
El diagnóstico de la fiebre tifoidea mediante la prueba de Widal se puede realizar si los
títulos iniciales se cuadruplican entre una y cuatro semanas. Sin embargo, no es una
práctica común tener muestras pareadas, por lo que muchas veces se realiza el
diagnóstico utilizando un título aislado determinado.
El punto de corte, por encima del cual se puede considerar el diagnóstico de fiebre
tifoidea, depende de la prevalencia de la enfermedad y varía geográficamente aún en un
mismo país.
En nuestro país se considera que un paciente tiene fiebre tifoidea cuando se alcanza
títulos O ≥ 160-320. No se le asigna importancia diagnóstica a los anticuerpos H.
AGLUTINACIÓN EN LÁMINA

MATERIALES

a) Antígenos comerciales H y O de S. typhi f) Solución salina

b) Suero problema g) Mondadientes
c) Suero control positivo y suero control h) Propipeta
negativo i) Bocal con lejía
d) Lámina para aglutinaciones j) Antígenos comerciales
e) Pipetas serológicas de 0,2 mL paratífico A y paratífico B

METODOLOGÍA

1. Anotar en la lámina el suero y antígeno a probar.

2. Repartir los siguientes volúmenes de suero del paciente: 0,08; 0,04; 0,02; 0,01 y 0,005
mL. Repetir este procedimiento de acuerdo al número de antígenos a ser usados.
3. Mezclar el antígeno, invirtiendo el frasco gotero varias veces.
4. Agregar una gota de antígeno a cada una de las divisiones que contiene suero. El
volumen de antígeno que se mezcla con las diferentes cantidades de suero da lugar a
las siguientes diluciones:
Suero Dilución
0,08 1/20
0,04 1/40
0,02 1/80
0,01 1/160
0,005 1/320
5. Mezclar el contenido de cada división con el mondadiente o mezclador.
6. Rotar la lámina suavemente durante 2 minutos y examinar para detectar aglutinación.

RESULTADOS

• En la reacción positiva la mezcla suero-antígeno es clara y se presentan grumos

que no se rompen con una agitación suave.
• Los grados de aglutinación se interpretan con la siguiente escala:
4+ aglutinación completa
3+ el 75% de las partículas aglutinan
 2+ el 50% de las partículas aglutinan
1+ el 25% de las partículas aglutinan
• En la reacción negativa la mezcla suero-antígeno no es clara y la agitación suave no
revela grumos.
• El título está dado por la inversa de la máxima dilución donde se puede apreciar
una aglutinación de por lo menos 2+ (50%).
• El título diagnóstico para fiebre tifoidea es igual o mayor a 160.
• Algunos autores no otorgan criterio diagnóstico a los títulos obtenidos con el
antígeno H.

CUESTIONARIO

1. ¿Qué pruebas de laboratorio se utilizan para diagnosticar Tifoidea en cada semana de

la enfermedad?
2. ¿Cuál es el valor diagnóstico de la detección de anticuerpos anti-vi?
3. ¿Porqué razón la prueba de Widal genera muchas controversias en el campo clínico?
4. ¿Cómo se realizaría el control de calidad de los antígenos usados en la prueba de
Widal’
5. ¿En qué consiste la prueba de Tubex?
6. ¿Cuáles son las causas de falsos positivos en la prueba de Widal?
7. ¿Cuáles son las causas de falsos negativos en la prueba de Widal?
8. ¿Qué significa “O” y “H”? Investigue la historia de la prueba de Widal.
9. ¿Cómo se determina el título diagnóstico de una prueba para determinada
enfermedad?

BIBLIOGRAFÍA

• Clendenes M, Carrillo C, Gotuzzo E, Benavente L. Estudio seroepidemiológico de fiebre

tifoidea en población escolar en el área norte de Lima Metropolitana, Rev Med
Herediana 3: 94-100, 1992.
• Gotuzzo E, Guerra J, Crosby E y col. Evaluación de los procedimientos diagnósticos de
fiebre tifoidea, Acta Med Peruana 5:14-19, 1978.
• Katime A E. Reacción de Widal – interpretación clínica. Rev Panam Infectol 8: 40-44,
2006.
• Ministerio de Salud: región de salud de Lima. Fiebre tifoidea: criterios para su
diagnóstico y tratamiento, Lima, 1980.
• Zurita S. Manual de procedimientos de laboratorio, ed Amarilys CIRL, Perú, 1997.
Preparación de los Patrones de turbidez
Antígeno (mL) Solución Patrón de Prueba de Widal
salina (mL) turbidez

0,5 0,5 Negativo Ac para el Ag O grupo D (Tífico O)

0,25 0,75 2+ Ac para el Ag H a (Paratífico A)
0,125 0,875 3+ Ac para el Ag H b (Paratífico B)
Ac para el Ag H d (Tífico H)

DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE BRUCELOSIS

INTRODUCCIÓN

La brucelosis conocida también como fiebre ondulante o fiebre malta, es una enfermedad
zoonótica caracterizada por una fase aguda seguida por una fase crónica que puede
prolongarse muchos años y llegar a afectar a diversos tejidos.
Con el propósito de confirmar si el paciente padece de brucelosis se realizan hemocultivos
y mielocultivos en los laboratorios de bacteriología y en los laboratorios de inmunología se
practican pruebas serológicas que detecten la presencia de IgG.
Al principio de la enfermedad aparecen los anticuerpos aglutinantes IgM, un poco más
tarde los anticuerpos IgG y los anticuerpos bloqueadores. Mientras que los anticuerpos
IgM pueden persistir después de la recuperación, el hallazgo de un título significativo de
anticuerpos IgG indica infección y enfermedad activa. Por eso, los mejores resultados se
logran cuando se aplican varios procedimientos diagnósticos y los interpretamos en
conjunto, sobre todo para determinar brucelosis aguda, subaguda o crónica.
Las pruebas utilizadas son: aglutinación en lámina, como prueba rápida, Rosa de bengala,
como prueba tamiz, y luego se realizan las pruebas de aglutinación en tubo y 2-
mercaptoetanol. En la fase crónica es necesario hacer la prueba de anticuerpos
bloqueadores.
LOGROS

• Determinar la presencia de anticuerpos contra el antígeno somático de Brucella en muestras

de suero problema mediante la prueba de Rosa de bengala.
• Medir los niveles de anticuerpos contra el antígeno somático de Brucella en muestras de suero
problema, empleando la aglutinación en tubo y el 2-mercaptoetanol.
• Analizar el algoritmo diagnóstico empleado en el diagnóstico serológico de brucelosis.

PRUEBA DE AGLUTINACIÓN EN LÁMINA

Es una prueba de diagnóstico rápido usada en los laboratorios por su facilidad de

ejecución. Ha sido estandarizada para tener una buena correlación con la prueba en tubo.
Detecta IgM e IgG.

MATERIALES

a) Antígeno Brucella abortus cepa 1119-3 d) Pipetas serológicas de 0,2 mL

(volumen celular al 10-12%) e) Lámina de vidrio
b) Suero problema f) Propipeta
c) Sueros controles positivos y negativos g) Mondadientes
h) Bocal con lejía

METODOLOGÍA

1. Los sueros y los antígenos deben estar a temperatura ambiente por lo menos una hora
antes de realizar la prueba.
2. Depositar los siguientes volúmenes de suero en la lámina de vidrio: 0,08; 0,04; 0,02;
0,01 y 0,005 mL.
3. Agitar suavemente el antígeno y con el gotero en posición vertical dejar caer una gota
(0,03 mL) del antígeno sobre cada uno de los volúmenes de suero. La cantidad de
antígeno mezclado con los diferentes volúmenes de suero, dará diluciones que se
aproximan a aquellas obtenidas en la prueba en tubo, esto es, 1:25, 1:50, 1:100, 1:200
y 1:400.
4. Con el mondadiente, mezclar el suero y el antígeno con movimientos circulares,
empezando por la dilución más alta.
5. Rotar la lámina por espacio de 4 minutos y hacer la lectura inmediatamente.
RESULTADOS

• Una reacción completa es aquella que muestra grumos finos o grandes rodeados de un
líquido transparente.
• Una reacción negativa es una mezcla homogénea de suero-antígeno sin ninguna
evidencia de aglutinación.
• El título está dado por la inversa de la máxima dilución que presente reacción
completa.
• El título diagnóstico positivo es 200.

PRUEBA DE ROSA DE BENGALA

Esta prueba fue desarrollada por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos
para su uso en ganado vacuno. Posteriormente, su uso con sueros humanos reveló una
alta sensibilidad y especificidad de la prueba.
En la actualidad, muchos laboratorios utilizan esta prueba como tamiz: todos los sueros
son procesados por esta prueba y aquellos que dan reacciones positivas son evaluados por
las pruebas de aglutinación en tubo y 2-mercaptoetanol.
La prueba, llamada también de la tarjeta o card test, se basa en la inactivación de la IgM a
un pH bajo, detectando anticuerpos de la clase IgG1. Se emplea como antígeno la cepa de
Brucella abortus 1119-3 al 8%, coloreada con Rosa de bengala en una solución tampón a
pH 3,65.

MATERIALES

a) Antígeno de Rosa de bengala. e) Lámina de vidrio

b) Suero problema f) Propipeta
c) Sueros controles positivos y negativos g) Mondadientes
d) Pipeta de 0,2 mL h) Bocal con lejía

METODOLOGÍA

1. Colocar 0,03 mL de suero problema sobre la lámina de vidrio. Repetir este

procedimiento para los sueros control.
2. Colocar una gota (0,03 mL) de antígeno Rosa de bengala cerca de la gota de cada suero.
3. Con el mondadiente, mezclar bien el suero y el antígeno.
4. Hacer girar la lámina por 4 minutos.
5. Leer la prueba sobre fondo blanco.
RESULTADOS

• La reacción positiva presenta grumos de aglutinación, grandes o pequeños, que debe

observarse con el suero control positivo.
• En una reacción negativa no hay evidencia de aglutinación, tal como deben observarse
con el suero control negativo.
• El suero problema que presente resultado positivo someterlo a pruebas confirmatorias
como aglutinación en tubo o 2-mercaptoetanol.

AGLUTINACIÓN EN TUBO

Además de ser muy sensible, la prueba de aglutinación en tubo es más exacta y

reproducible que la prueba de aglutinación en lámina. Detecta la presencia de anticuerpos
de las clases IgG e IgM.

MATERIALES

a) Antígeno para la prueba en tubo al 4,5%. d) Suero negativo

(antígeno no coloreado del INS) e) Pipetas de 0,2 mL y 5 mL
b) Suero problema f) Tubos de 13 x 100 mm
c) Suero positivo g) Propipeta

METODOLOGÍA

1. Rotular los tubos del 1 al 5.

2. Con una pipeta de 0,2 mL depositar en el fondo del primer tubo 0,08 mL, en el segundo
tubo 0,04 mL, en el tercer tubo 0,02mL, en el cuarto tubo 0,01 mL y en el quinto tubo
0,005 mL.
3. Pipetear en forma similar los controles positivo y negativo.
4. Agregar 2 mL de antígeno fenolado (1 mL de antígeno más 99 mL de solución salina al
0,85%, fenolada al 0,5%).
5. Incubar las gradillas por 48 horas a 37 ºC en estufa o en baño maría.

RESULTADOS

• Para la lectura de la prueba los tubos se leen contra un patrón de turbidez, cuya escala
va desde negativo a 4+ de aglutinación.
• El título de la prueba está dado por la inversa de la dilución más alta que produce 2+
(50%) o más de aglutinación.
• Una prueba con un título de 100 es presuntiva.

PRUEBA DEL 2-MERCAPTOETANOL

La prueba del 2-mercaptoetanol es mejor indicadora de infección reciente o activa que la

prueba de aglutinación en tubo. Se basa en la propiedad que tiene el 2-mercaptoetanol de
inactivar la propiedad aglutinante de los anticuerpos de la clase IgM, detectando la
presencia de IgG. Se recomienda efectuarla simultáneamente con la prueba de
aglutinación en tubo.

MATERIALES

a) Antígeno para la prueba de 2-ME e) Solución salina

(antígeno no coloreado del INS) f) Pipetas de 0,2 mL y 5 mL
b) Suero problema g) Tubos de 13 x 100 mm
c) Sueros controles h) Propipeta
d) Solución de 2-ME 0,1 molar

METODOLOGÍA

1. Enumerar los tubos del 1 al 5.

2. Con una pipeta de 0,2 mL se carga el suero, depositar en el fondo del primer tubo 0,08
mL, en el segundo tubo 0,04 mL, en el tercer tubo 0,02 mL, en el cuarto tubo 0,01 mL y
en el quinto tubo 0,05 mL.
3. Pipetear en forma similar los controles positivo y negativo.
4. Agregar 1 mL de solución 2-ME a cada tubo, agitar y dejar a temperatura ambiente por
30 minutos.
5. Agregar 1 mL de antígeno para la prueba de 2-ME (1 mL de antígeno más 49 mL de
solución salina al 0,85%), a todos los tubos.
6. Incubar a 37 ºC por 48 horas.

RESULTADOS

• La prueba se lee como se ha descrito para la prueba de aglutinación en tubo.

• El título de la prueba está dado por la inversa de la dilución más alta que produce 2+ o
más de aglutinación.
• Un título de 25 es considerado como positivo.

FENÓMENO DE ZONA

Es la ausencia de aglutinación o presencia de aglutinaciones parciales en las diluciones

bajas, y aglutinación completa en las diluciones altas, y está asociado con sueros que
contienen un alto título de anticuerpos o que contienen anticuerpos bloqueadores.
Es causa de resultados falsos negativos, especialmente si no se realizan todas las
diluciones de la prueba.
Reportar las diluciones donde ocurre el fenómeno de zona. El título del suero está dado
por la inversa de la dilución más alta que aglutina.

ANTICUERPOS BLOQUEADORES

Los anticuerpos bloqueadores no sólo son incapaces de producir aglutinación sino que
también la inhiben. Son anticuerpos divalentes que pertenecen a las clases IgA e IgG. Su
presencia origina falsos negativos.

MATERIALES

a) Antígeno de Brucella para la prueba en e) Tubo de 13 x 100 mm

tubo f) Propipeta
b) Suero problema g) Bocal con lejía
c) Suero positivo anti Brucella
d) Pipeta de 0,2 mL

METODOLOGÍA

1. Colocar 0,04 mL del suero del paciente en un tubo.

2. Agregar 1 mL de antígeno para la prueba en tubo.
3. Agitar e incubar por 3 horas a 37 ºC.
4. Agregar 0,02 mL de suero positivo de título 100. También se pueden utilizar sueros
positivos de mayor título, 400 ó 200, en cuyo caso se utilizan 0,005 y 0,01 mL,
respectivamente.
5. Agitar e incubar por 24 horas a 37 ºC.
6. Leer como la prueba en tubo.
RESULTADOS

• Si el paciente presenta anticuerpos bloqueadores, estos bloquean los determinantes

antígenos del antígeno, por lo que al añadir el suero positivo este no puede reaccionar.
• Si existe aglutinación el suero es negativo a anticuerpos bloqueadores, y si no existe
aglutinación el suero es positivo a anticuerpos bloqueadores y debe titularse (usando
volúmenes de suero conocidos).
• Se considera un título de 100 como positivo.

CUESTIONARIO

1. Elabore una gráfica del perfil inmunológico de la Brucelosis.

2. Defina Brucelosis aguda, crónica, sub aguda, recidiva y recaída.
3. ¿Qué isotipos de respuesta inmune tendrán los pacientes A, B y C si se encuentran los
siguientes resultados?

PACIENTE AGLUTINACIÓN EN PRUEBA DE 2 ISOTIPOS

TUBO MERCAPTOETANOL

A 200 50

B 800 800

C 400 NEGATIVO

BIBLIOGRAFÍA

• Alton G G, Jones L M & Pietz D E. Las técnicas de laboratorio en la brucelosis, 2da. ed,
Organización Mundial de la Salud, Serie de monografías Nº55, 1976.
• Buchanan T M, Sulzer C R, Frix M K y col. Brucellosis in the United States, 1960-1972. An
abattoir-associated disease. Part II. Diagnostic aspects. Medicine 53: 415-25, 1974.
• Carazas I, Páucar J, Derenzin M, Ramos A. Brucellosis en el medio policial. Pruebas
serológicas para su seguimiento. Importancia del 2-mercaptoetanol. Diagnóstico
18:140-146, 1986.
• Eisen H N. Immunology. An introduction to molecular and cellular principles of the
immune responses, 2da. ed, Harper & Row Publishers, Inc, 1974.
• Guillén A, Arreluce M, Llamoga A y col. Manual de procedimientos de laboratorio para
el diagnóstico bacteriológico y serológico de brucelosis, 2da ed, Instituto Nacional de
Salud, 1995.
• Sánchez LM, Asmat R, Carrillo L, Guillén A, Quispe V. Val,or diagnóstico de los
anticuerpos incompletos en brucelosis humana. Bol Soc Per Med Inter 1995; 8:20-22.
• Young E J. Serologic diagnosis of human brucellosis: analysis of 214 cases by
agglutination test and review of the literature. Rev Infect Dis 13:359-372, 1991.

DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE SÍFILIS

INTRODUCCIÓN

La sífilis es una enfermedad que normalmente se transmite a través del contacto sexual.
Treponema pallidum, su agente causal, no puede cultivarse en los medios convencionales
ni en cultivos de tejidos. La infección se diagnostica habitualmente mediante la detección
de anticuerpos específicos para T. pallidum en sangre o líquido cefalorraquídeo del
paciente.
Los anticuerpos pueden ser detectados a las 3-4 semanas de la exposición,
manteniéndose en niveles apreciables durante largos períodos de tiempo posterior al
tratamiento. En el transcurso de la infección se producen dos tipos de anticuerpos: los que
reaccionan frente a los antígenos no treponémicos empleados en las pruebas VDRL y RPR,
y los que reaccionan frente a los antígenos específicos de T. pallidum. Los anticuerpos
frente a antígenos no treponémicos se detectan en la fase activa de la enfermedad y sus
niveles disminuyen luego de un tratamiento eficaz. Los anticuerpos específicos persisten
luego de superado el proceso infeccioso. Es necesario investigar los dos tipos de
anticuerpos, ya que los no treponémicos pueden desarrollarse por razones ajenas a la
infección sifilítica.
En la práctica se realizará la prueba de VDRL.
LOGROS

• Determinar la presencia y título de anticuerpos contra el antígeno no Treponémico del reactivo

de VDRL en muestras de suero problema.
• Analizar el algoritmo diagnóstico empleado en el diagnóstico serológico de Sífilis.

MATERIALES

a) Antígeno: solución alcohólica de g) sectores de 4 cm2

cardiolipina 0,03%, colesterol 0,9% y h) Jeringa de 2 cc con aguja calibre
lecitina purificada 0,21% 18 (sin bisel)
b) Suero problema i) Rotador
c) Suero control reactivo j) Microscopio
d) Suero control no reactivo k) Baño maría a 56 ºC
e) Solución salina al 0,9% l) Bocal con lejía
f) Lámina de vidrio transparente con

METODOLOGÍA

Prueba de VDRL cualitativa

1. Inactivar el suero problema en baño maría a 56ºC durante 30 minutos.
2. Con una micropipeta colocar 50 L del suero control reactivo en el primer círculo o
sector de la lámina serológica y 50 L del suero control no reactivo en el segundo
círculo; a partir del tercer círculo, colocar 50 L de los sueros problema en cada uno de
los círculos de la lámina serológica.
3. Con una pipeta automática, añadir 17 L del antígeno sobre cada muestra. De no
contar con pipeta, utilice una jeringa de 2 cc con aguja calibre 18 (sin bisel) y
sosteniéndola en posición vertical dejar caer una gota del antígeno sobre cada muestra.
4. Colocar la lámina con las muestras en un rotador a 180 rpm por 4 minutos.

RESULTADOS

Los resultados se informarán de la siguiente manera:

Grumos medianos o grandes : Reactivo (R)
Grumos pequeños : Reactivo débil (RD)
Sin grumos : No reactivo (NR)
Pruebas de VDRL cuantitativa

1. Colocar 50 L de solución salina al 0,9% del 2do al 4to círculo de la lámina serológica
(Figura).
2. Añadir 50 L de suero en el 1er y 2do círculo.
3. Mezclar la solución salina y el suero en el 2do círculo y transferir 50 L del suero
diluido (1:2) al 3er círculo. Mezclar el suero y la solución salina y transferir 50 L del
suero diluido (1:4) al 4to círculo. Mezclar el suero y la solución salina y descartar 50 L
del suero diluido (1:8).
4. Repetir los pasos 3 y 4 de la prueba cualitativa.

1 2 3 4
Suero 1

1:1 1:2 1:4 1:8

Suero 2
1 2 3 4

Suero 3 1:1 1:2 1:4 1:8

1 2 3 4

1:1 1:2 1:4 1:8

RESULTADOS

Reportar el título en términos de la más alta dilución en que se produzca un resultado

reactivo. Ejemplo:

Diluciones del Suero

Resultado
1:1 1:2 1:4 1:8
R RD N N Reactivo, dilución 1:1 ó 1 dil
R R N N Reactivo, dilución 1:2 ó 2 dil
RD N N N Reactivo, débil, 0 dil
R R R N Reactivo, dilución 1:4 ó 4 dil
N= no reactivo; R= reactivo; RD= reactivo débil
• Si se obtiene un resultado reactivo por sobre el título 8 dil, proseguir con:
- Preparar una dilución 1/8 colocando en un tubo 0,7 mL de solución salina 0,9% y
agregar 0,1 mL del suero problema.
- Colocar 50 L de solución salina 0,9% en los círculos 2,3 y 4 de la lámina.
- Añadir 50 L de la dilución 1/8 en los círculos 1 y 2.
- Seguir los pasos 3 y 4 ya descritos.

INTERPRETACIÓN
1. Un VDRL reactivo puede indicar infección presente o pasada con treponemas
patógenos, sin embargo, también puede ser una reacción falso positiva. Un falso
positivo se detecta con una prueba treponémica, la cual da un resultado negativo.
2. Un VRDL no reactivo sin evidencia clínica de sífilis puede indicar que no hay infección
por treponemas o que el tratamiento fue efectivo. Un VDRL no reactivo, con evidencia
clínica, puede observarse en sífilis primaria o en sífilis secundaria, presentándose en
este último caso como fenómeno de prozona.
3. La caída de 4 veces el título en la prueba de VDRL es una evidencia de tratamiento
efectivo.
4. El valor predictivo del diagnóstico serológico de sífilis se incrementa cuando se
combina el resultado de una prueba de VDRL con una prueba treponémica.

CUESTIONARIO

1. ¿Qué son las pruebas treponémicas y no treponémicas?

2. ¿Qué son las reaginas?
3. Mencione las causas de falsos positivos y negativos en las pruebas no treponémicas.
4. Elabore un cuadro comparativo de sensibilidad y especificidad de pruebas
treponémicas y no treponémicas.
5. Elabore un cuadro de sensibilidad y especificidad de las pruebas treponémicas y no
treponémicas según etapa de la sífilis.
6. ¿Cuál es el algoritmo convencional para el diagnóstico serológico de sífilis?
7. ¿En qué consiste el algoritmo inverso para diagnóstico serológico de sífilis?
8. Elabore una guía práctica para la prueba de RPR.
9. Elabore una guía práctica para la prueba de TPHA
10. Elabore una guía práctica para la prueba de FTA Abs IgG
BIBLIOGRAFÍA

• Coffey E, Bradford L. Serodiagnosis of syphilis. En: Manual of clinical immunology, Rose

N R, Friedman H (ed.), 2da ed., American Society for Microbiology, Washington, D C,
Cap. 74, 1980.
• OPS. Manual de reacciones para el diagnóstico de la sífilis, Pub Cient No 311, 1975.

DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE MONONUCLEOSIS INFECCIOSA

INTRODUCCIÓN

La mononucleosis infecciosa (MI) es una enfermedad sintomática, pero habitualmente

benigna, producida por el virus de Epstein-Barr (EBV), que cursa con fiebre irregular
durante una o dos semanas, dolor e hinchazón de los ganglios cervicales e irritación
faríngea; con un cuadro hematológico bastante característico debido a la gran proliferación
de células linfoides atípicas.
El diagnóstico de la MI es estrictamente serológico, se disponen de técnicas que detectan
una especie particular de anticuerpos heterófilos, cuya aparición es común en el transcurso
de la enfermedad, y de otras que ponen de manifiesto la presencia de anticuerpos
específicos frente a determinadas proteínas del virus.
En la actualidad se emplea una amplia variedad de pruebas para la detección de
anticuerpos heterófilos, desde la técnica clásica de Paul-Bunnell, hasta técnicas de ELISA,
aglutinación de partículas de látex sensibilizadas con antígenos de membrana de eritrocitos
bovinos y técnicas inmunocromatográficas.
La detección de anticuerpos que detectan antígenos del EBV toma en consideración los
complejos antigénicos del virus como el VCA, el EA y EBNA. Las técnicas habituales
empleadas son la inmunofluorescencia indirecta y el ELISA.

EBNA-1 IgG ELISA

El inmunoensayo enzimático sobre fase sólida (ELISA) está basado en el principio del
sandwich. Los pocillos están recubiertos con un antígeno. Los anticuerpos específicos
de la muestra que se unen a los pocillos recubiertos con el antígeno son detectados por
un conjugado enzimático del segundo anticuerpo (E-Ab) específico para el antígeno
humano IgG. La intensidad del color desarrollado por la reacción del substrato es
proporcional a la cantidad de anticuerpos específicos IgG detectados. Los resultados de
las muestras se pueden determinar directamente usando la curva estándar.
LOGRO

• Determinación cualitativa y cuantitativa de anticuerpos IgG contra el antígeno nuclear

del virus de Epstein-Barr en suero y plasma humanos.

MATERIALES

a) Kit ELISA EBNA IgG

b) Micropipetas
c) Agua Destilada
d) Papel Absorbente

METODOLOGÍA

* Utlizar el siguiente protocolo:

RESULTADOS

• Determinar el resultado de manera Cualitativa o Cuantitativa

• Establecer Cálculos en base al COI

Evolución de los anticuerpos en la mononucleosis infecciosa

AH: anticuerpos heterófilos; VCA: antígeno de la cápside del virus;

EA: antígeno temprano; EBNA: antígeno nuclear del virus Epstein-Barr

CUESTIONARIO

1. ¿Qué es el antígeno de Forssman?

2. ¿Cómo se logran las diluciones del suero en base 7?
3. ¿Cómo se confirmaría una prueba de Paul Bunnell positiva?
4. ¿Qué otras pruebas inmunológicas se utilizan para diagnosticar la Mononucleosis
infecciosa?

BIBLIOGRAFÍA
• Evans A S, Niederman J C, Cenabre L C y col. A prospective evaluation of heterophile
and Epstein-Barr virus-specific IgM antibody tests in clinical and subclinical infectious
mononucleosis: specificity and sensitivity of the tests and persistance of antibody. J
Infect Dis 132:546-554, 1975.
• Lee C L, Davidsohn I, Slaby B S. Horse agglutinis in infectious mononucleosis. Am J Clin
Pathol 49:3-11, 1968.
• Lee C L, Davidsohn I, Panczyszyn M T. Horse agglutinins in infectious mononucleosis. II.
The spot test. Am J Clin Pathol 49:12-18, 1968.
• Svahn A, Magnusson M, Jägdahl L, Kahlmeter G, Linde A. Evaluation of three
commercial enzyme linked immunosorbent assays and two latex agglutination assays
for diagnosis of primary Epstein-Barr virus infection. J Clin Microbiol 1997;35: 2728-
2732.
• Turgeon M L. Immunology & Serology in laboratory medicine, 2da ed, Mosby, St Louis,
Cap. 23, 1996.
 GUIA PRÁCTICA Nº 07 SEMANA 10
DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE LA INFECCIÓN POR VIH
OBJETIVO Realizar e interpretar las pruebas utilizadas en el diagnóstico
del VIH
LOGRO A MEDIR • Medir los niveles de anticuerpos en muestras de suero problema,
utilizando la prueba de ELISA, estableciendo su utilidad y
limitaciones.
• Realizar e interpretar las pruebas rápidas inmunocromatografias de
cuarta generación. Indicar su utilidad y limitaciones.
• Identificar las bandas antígeno-anticuerpo con valor diagnóstico en
la prueba de Western blot para diagnosticar infección por el VIH

DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE LA INFECCIÓN POR VIH

INTRODUCCIÓN

El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) es un virus RNA perteneciente a la familia

retroviridae que se caracteriza por su transmisión sexual, sanguínea y congénita. Hay dos
tipos de virus descritos: VIH-1 y VIH-2, siendo el VIH-1 el más común.
El tamizaje de los anticuerpos contra VIH tiene por objetivo el diagnóstico de la infección
por este virus; sin embargo dicho diagnóstico no implica necesariamente el desarrollo
clínico del SIDA. A pesar de que los métodos de tamizaje son muy sensibles, la ausencia de
anticuerpos contra el virus no descarta totalmente la infección viral, ya que en un primer
momento va a existir replicación viral sin que haya expresión serológica de los anticuerpos
contra el VIH; esta etapa se denomina “período de ventana” y puede prolongarse por varias
semanas.
Las principales pruebas de tamizaje utilizadas para la detección de anticuerpos anti-VIH
incluyen: ELISA, aglutinación y dot Blot.
Actualmente existen variadas y excelentes pruebas serológicas por lo cual el diseño del
algoritmo para realizar el diagnóstico de la infección por VIH siempre debe de seleccionar
las pruebas más sensibles para el tamizaje. Por otra parte deben de seleccionarse aquellas
pruebas más específicas para confirmación del diagnóstico, las cuales generalmente son
realizadas en los Centros de Referencia.
Las técnicas confirmatorias más utilizadas son: Western-Blot, inmunoensayos lineales
(LIA), radioinmunoprecipitación (RIPA) e inmunofluorescencia indirecta.
LOGRO

• Medir los niveles de anticuerpos en muestras de suero problema, utilizando la prueba de

ELISA, estableciendo su utilidad y limitaciones.
• Realizar e interpretar las pruebas rápidas HIVCHEK 1+2, inmunocromatografias de
tercera y cuarta generación .Indicar su utilidad y limitaciones.
• Identificar las bandas antígeno-anticuerpo con valor diagnóstico en la prueba de Western
blot para diagnosticar infección por el VIH (demostrativo).

PRUEBA DE ELISA MÉTODO INDIRECTO (DETECCIÓN DE ANTICUERPOS)

MATERIALES

a) Soporte con 12 pocillos recubiertos h) Sustrato/cromógeno: Peróxido de

con antígenos VIH hidrógeno/OPD
b) Muestra problema i) Ácido sulfúrico 4N
c) Suero control positivo j) Jeringa dispensadora de 0,3 mL
d) Suero control negativo k) Pipetas de 10, 100 y 500 L
e) Diluyente de muestras: buffer fosfato l) Pinzas de plástico
+ suero normal de cabra m) Precintos para placas
f) Buffer de lavado: buffer fosfato + n) Estufa a 37ºC con una humedad relativa
Tween 20 al 0,05% > 80%
g) Conjugado: Inmunoglobulinas o) Lector de ELISA con filtro de 492 nm
antihumanas de cabra-peroxidasa p) Bocal con lejía

METODOLOGÍA
1. Colocar la tira de pocillos en el soporte.
2. Diluir los sueros problema 1:100 (10 L de suero + 1 mL de diluyente de muestras).
3. Dispensar en los pocillos correspondientes:
a. 100 L de diluyente (blanco)
b. 100 L de suero control negativo
c. 100 L de suero control negativo
d. 100 L de suero control positivo
e. 100 L de suero control positivo
f. 100 L de suero problema
4. Cubrir los pocillos con cinta adhesiva e incubar 30 minutos a 37ºC.
5. Lavar cada pocillo 4 veces con buffer de lavado.
6. Agregar 100 L de conjugado a cada pocillo.
7. Cubrir los pocillos con cinta adhesiva e incubar 30 minutos a 37ºC.
8. Lavar cada pocillo 4 veces con buffer de lavado.
9. Durante el paso de la incubación preparar el sustrato cromógeno: abrir el vial con las
tabletas de OPD, extraer con una pinza de plástico una tableta y colocarla en un frasco
oscuro. Agregar 2,5 mL de agua destilada guardar en oscuridad hasta su completa
disolución (unos 15 minutos). Añadir 100 L de solución de peróxido de hidrógeno.
10. Agregar 100 L de sustrato a cada pocillo e incubar por 30 minutos a 20-25 ºC en
oscuridad.
11. Detener la reacción añadiendo a cada pocillo, 100 L de ácido sulfúrico 4N.
12. Lectura:
Fotométrica: Leer dentro de las dos horas después del paso 11 la absorbancia de la
solución de los pocillos a 492 nm.
A simple vista: Comparar dentro de las 2 horas después del paso 11, el color de los
pocillos de las muestras frente al de los pocillos control.

RESULTADOS

• Lectura fotométrica: Calcular el valor de corte

Valor de corte: 0,2 (4Ñ + P)
Ñ: Absorbancia media de los controles negativos
P: Absorbancia media de los controles positivos
S: Absorbancia de las muestras
Una prueba es positiva si S > valor de corte
Una prueba es negativa si S  valor de corte
• Lectura a simple vista: una prueba es positiva si el color es más parecido al de los
controles positivos.
• Un resultado negativo indica que la muestra analizada no contiene anti-VIH o que el
nivel de anticuerpos anti-VIH está por debajo del límite de sensibilidad de la prueba.
• Un resultado positivo significa que la muestra probablemente contiene anticuerpos
contra VIH.

WESTERN BLOT VIH

RecomLine HIV-1 & HIV-2 IgG (Suero / Plasma )

El recomLine HIV-1 & HIV-2 IgG es una prueba cualitativa para la detección de
anticuerpos IgG contra el virus de la inmunodeficiencia humana 1 (VIH tipo 1) así como
VIH tipo 2 en el suero humano o en el plasma.

El recomLine HIV-1 & HIV-2 IgG es un inmunoensayo lineal. Debido a la alineación

separada de los antígenos individuales, el principio de la prueba permite la identificación de
anticuerpos específicos frente a cada uno de los antígenos de VIH-1 y VIH-2, comparado
con la prueba ELISA (proteína ENV del VIH-1: gp120, gp41; proteína ENV del VIH-2:
gp105, gp36; proteína GAG: p24, p17; proteína POL: p51, p31).
Mediante la aplicación de los antígenos específicos de tipo de la gp41 (VIH-1) y gp36
(VIH-2), se puede diferenciar entre una infección con VIH-1 o VIH-2.
El recomLine HIV-1 & HIV-2 IgG es una prueba de confirmación y puede utilizarse para la
clarificación de resultados de Screening poco claros.

PRINCIPIO DEL ENSAYO

Unos antígenos recombinantes VIH altamente purificados se fijan en tiras de ensayo con
una membrana de nitrocelulosa.
1. Las tiras de ensayo se incuban con una muestra diluida del suero o plasma. Se añaden
anticuerpos específicos en los antígenos del agente en la tira de ensayo.
2. Los anticuerpos no ligados se aclaran a continuación.
3. En un segundo paso, las tiras se incuban con anticuerpos de inmunoglobulina (IgG) anti-
humanos que se han conjugado con peroxidasa de rábano.
4. Los anticuerpos conjugados no ligados se aclaran a continuación.
5. Con una reacción de color catalizado por la peroxidasa se comprueban los anticuerpos
específicos ligados. Si ocurre una reacción antígeno-anticuerpo, aparecerá una barra oscura
en el lugar correspondiente en la tira.
En el extremo superior de la tira de ensayo se encuentran las barras de control:
a. El control de reacción, bajo el número de la tira, tiene que mostrar una reacción en cada
suero o muestra de plasma.
b. El control de conjugado (IgG), que sirve para comprobar la clase de anticuerpos
detectada. Si se utiliza la tira de ensayo para la detección de anticuerpos IgG, la barra de
control de conjugado IgG muestra claramente una barra.
c. "Control de corte": La intensidad de esta barra permite evaluar la reactividad de cada una
de las barras de antígenos

MATERIALES

METODOLOGÍA
RESULTADOS

Para realizar la interpretación de resultados se debe seguir los siguientes pasos en mención :

Validación y control de calidad

Se puede proceder al análisis de una prueba siempre que se cumplan los siguientes criterios:
1. Barra de control de reacción (línea superior): claramente teñida, barra oscura
2. Categoría de anticuerpos (segunda barra): la barra de control de la conjugación IgG debe
aparecer teñida en un color diferente.
3. Control de corte (tercera barra): teñida en un color más débil pero visible

No es necesario realizar controles positivo y negativo para evaluar la prueba. Si es

necesario, se pueden realizar para el control de calidad interno.
Los controles deben mostrar las siguientes bandas de antígenos reactivas:
Control positivo: gp120, gp41, p51, p31, p24, p17, gp105 y gp36 pueden reaccionar, pero
no necesariamente.
Control negativo: ninguno.
Evaluación
La evaluación de las tiras de ensayo se puede realizar de forma visual o informatizada con
el software de supervisión y escaneo de tiras de ensayo recom. El software para escaneo
recom está diseñado para el apoyo de la interpretación de las tiras de ensayo. Para obtener
más información y unas instrucciones adecuadas acerca de la evaluación asistida por
computador, consulte con MIKROGEN. Las instrucciones siguientes hacen referencia a la
evaluación visual.
9.2.1 Valoración de la intensidad de la barra
1. Anote en el formulario de evaluación adjunto la fecha y el número de lote, así como las
categorías de anticuerpos detectadas.
2. Escriba los números de identificación de las muestras en el formulario de evaluación.
3. Pegue con pegamento las tiras de ensayo pertenecientes en el campo correspondiente del
formulario de evaluación. Para ello, ajuste las tiras de ensayo con las barras de control de
reacción en las rayas marcadas. A continuación, fije con una cinta adhesiva transparente las
tiras de ensayo a la izquierda de las rayas marcadas (no pegue barras de control de reacción
encima de otras). Extienda el pegamento en una capa uniforme por toda la tira de ensayo o
de lo contrario, la cinta adhesiva modificará la coloración.
4. Identifique las barras de las tiras de ensayo desprendidas mediante la cinta de control
impresa del formulario de evaluación y apúntelos en la hoja de registros. Para ello, efectúe
mediante la Tabla 1 la evaluación de la intensidad de las barras presentadas separadas por
la categoría de inmunoglobulina correspondiente.
INTERPRETACION

DIFERENCIACION

La diferenciación se realiza a través las glicoproteínas de transmembrana gp-41 VIH-1 y

gp-36 VIH-2 , esto es únicamente posible frente a un resultado de prueba positivo .
PRUEBA INMUNOCROMATOGRÁFICA DE CUARTA GENERACIÓN
ONSITE HIV AG / AB 4TH GEN. RAPID TEST

La prueba rápida onsite HIV-Ab/Ag de 4ª generación es un ensayo inmunocromatográfico

de flujo lateral. La tira reactiva consiste en:
1) una almohadilla que contiene antígeno HIVgp120-41 recombinante y gp-36 conjugados
con oro coloidal (conjugados VIH), anticuerpo monoclonal antiHIV-p24 conjugado con
oro coloidal (conjugados P24) y conejo IgG-oro conjugados (para línea de control),
2) una tira de membrana de nitrocelulosa que contiene dos bandas de ensayo (banda Ab y
banda Ag) y una banda de control (banda C). La banda Ab está pre-recubierta con
antígenos HIVgp120-41 y gp-36 para la detección de anticuerpos contra el VIH-1
incluyendo O y VIH-2, la banda Ag está pre-recubierta con otro anticuerpo monoclonal
anti-VIH-p24 para la detección de p24 antígeno, y la banda C está pre-recubierta con
anticuerpo IgG anti-conejo de cabra.

Cuando se dispensa un volumen adecuado de muestra de prueba en el pozo de muestra de la

prueba cassette, el espécimen migra por acción capilar a lo largo del [Link] anticuerpos
de clases IgG, IgM o IgA contra el VIH-1 o el VIH-2 están presentes en la muestra,
migraran a través de la almohadilla conjugada donde se unirán a los conjugados del VIH.
El inmunocomplejo se captura entonces en la membrana por el antígeno VIH-1+2 pre-
recubierto, formando una banda de color borgoña en la región Ab , que indica un resultado
positivo de la prueba. La ausencia de la banda Ab en la región de prueba sugiere un
Resultado negativo de anticuerpos contra el VIH -1 y VIH-2.
El antígeno VIH-1 p24, si está presente en la muestra, migrará a través de la almohadilla
conjugada donde se unirá al conjugado P24. El inmunocomplejo es capturado en la
membrana por el anticuerpo VIH-p24 prerecubierto, formando una banda de color borgoña
en la región de Ag, lo que indica un resultado positivo de la prueba. La ausencia de la
banda Ag en la región de prueba sugiere un antígeno VIH-p24 resultado negativo.

La prueba contiene un control interno (banda C) que debe exhibir una banda de color
borgoña de cabra anti conejo IgG/conejo IgG inmunocomplejos conjugados
independientemente de la presencia de cualquier banda de prueba De lo contrario, el
resultado de la prueba no es válido y la muestra debe volver a analizarse con otro
dispositivo.

Identificación de Banda Líneas de Pozo de

Muestra Control Reacción muestra
MATERIALES

Cada kit contiene 25 o 30 dispositivos de prueba, cada uno sellado en una bolsa de
aluminio con tres (3) artículos adentro:
a) Un dispositivo de casete
b) Un gotero de plástico
c) Un desecante
d) Muestra de diluyente (1 frasco, 5 ml).
e) Un inserto de paquete (instrucciones de uso)

METODOLOGÍA

1. Llevar la muestra y los componentes de prueba a temperatura ambiente si están

refrigerados o congelados. Mezcle bien el espécimen antes del ensayo una vez
descongelado.
2. Abra la bolsa en la muesca y retire el dispositivo. Coloque el dispositivo de prueba en
una superficie limpia y plana.
3. Asegúrese de etiquetar el dispositivo con el número de identificación de la muestra.
4. Llene el gotero de pipeta con la muestra. Sosteniendo el gotero verticalmente, dispense
1 gota (aproximadamente 30-40 μL) de suero/plasma o 1 gota de sangre total
(aproximadamente 45-55 μL) en el pozo de la muestra asegurándose de que haya no hay
burbujas de aire.
5. Agregue inmediatamente 1 gota (aproximadamente 35-50 μL) de diluyente de muestra
a
el pozo de muestra.
6. Configure el temporizador.

Los resultados se pueden leer en 15 minutos. Los resultados positivos o reactivos pueden
ser visibles en corto tiempo como 1 minuto.
No lea el resultado después de 15 minutos. Para evitar confusiones, deseche el dispositivo
de prueba después de interpretar el resultado.

RESULTADOS

RESULTADO NEGATIVO O NO REACTIVO

Si sólo la banda C está presente, la ausencia de cualquier color borgoña en ambas bandas de
prueba (banda Ab y banda Ag) indica que no se detectan anticuerpos contra el VIH ni
antígeno p24 del VIH en la muestra. El resultado es negativo.
RESULTADO POSITIVO O REACTIVO
Además de la presencia de la banda C, si se desarrolla la banda Ab, la prueba indica la
presencia de anticuerpos contra el VIH-1 y/o el VIH-2 en la muestra. El resultado es VIH-
1+2 Ab positivo.

Además de la presencia de la banda C, si se desarrolla la banda Ag (incluyendo línea débil),

la prueba indica la presencia de VIH-p24 en la muestra. El resultado es VIH-p24 positivo

Además de la presencia de la banda C, si tanto la banda Ab como la banda Ag se

desarrollan, el resultado es tanto VIH-1 + 2 Ab como antígeno p24 positivo.

Las muestras con resultados positivos deben confirmarse con métodos de ensayo
alternativos y hallazgos clínicos antes de tomar una decisión diagnóstica.

INVÁLIDO
Si no se desarrolla ninguna banda C, el ensayo no es válido independientemente de
cualquier color borgoña en las bandas T como se indica a continuación. Repita el ensayo
con un dispositivo nuevo.
TRABAJO ACADÉMICO

1. Elabore una guía práctica en Word de una prueba de ELISA de cuarta generación para
diagnóstico de infección por VIH.
2. Esquematice las reacciones moleculares que se originan en el pocillo de ELISA cuarta
generación cuando la muestra es positiva para antígeno o anticuerpo. Elabore un power
point con efectos de movimiento de las moléculas en cada etapa de reacción.
3. Elabore una guía práctica en Word de una prueba de inmunoensayo en línea para
diagnóstico de infección por VIH.
4. Elabore un power point sobre la prueba de LIA VIH con efectos de movimiento de las
moléculas en cada etapa de reacción.
5. Esquematice el algoritmo diagnóstico de infección por VIH en adultos y recién
nacidos.

BIBLIOGRAFÍA

• Gallo D y col. Comparison of detection of antibody to the acquired immune deficiency

syndrome virus by enzyme immunoassay, immunofluorescence, and Western Blot
methods. J Clin Microbiol 23: 1049-1051, 1986.
• Henry K, Thurn J, Anderson D. Diagnóstico paraclínico del virus de la
inmunodeficiencia humana. Trib Med 80:245-250, 1989.
• Turgeon M L. Immunology & Serology in laboratory medicine, 2da ed, Mosby, St
Louis, Cap. 23, 1996.
• Inserto de la prueba inmunocromatográfica de tercera generación ONSITE HIV 1/2 AB
PLUS COMBO (Suero / Plasma / Sangre Total)
• Inserto de la prueba inmunocromatográfica de cuarta generación ONSITE HIV AG /
AB 4TH GEN. RAPID TEST
 GUIA PRÁCTICA Nº 08 SEMANA 11
DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE HEPATITIS B
OBJETIVO Realizar e interpretar las pruebas utilizadas en el diagnóstico de
hepatitis B
LOGRO A MEDIR Detectar cualitativa y/o cuantitativamente anticuerpos anti HBs
y anti HBc o antígenos HBsAg en muestras de sueros problemas,
utilizando la prueba de ELISA

DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE HEPATITIS B

INTRODUCCIÓN

Las pruebas para detectar la presencia y la actividad del virus de la hepatitis B (VHB) son
las piedras angulares del diagnóstico y tratamiento. Las pruebas que detectan o miden los
niveles séricos del antígeno de superficie HBs, el anticuerpo de contra el antígeno de
superficie y el anti core de HB se utilizan para identificar a las personas expuestas al HBV,
mientras que otras pruebas proporcionan información sobre el nivel de replicación del
virus, la presencia de variantes específicas y la presencia de reservorios del virus.
Los marcadores séricos para el diagnóstico de HBV son: el antígeno de superficie (HBsAg),
los anticuerpos frente el antígeno de superficie (anti-HBs), el antígeno e (HBeAg), los
anticuerpos frente el antígeno e (anti-HBe) y los anticuerpos frente a las proteínas del
core (anti-HBc), que a su vez incluyen el anti-HBc IgM y los anti-HBc totales (IgM e IgG).
También son útiles la determinación del DNA del virus (DNA-VHB) y el genoma viral, éste
además sirve tanto para decidir los fármacos a usar como para monitorizar el tratamiento

PRUEBA DE ELISA PARA LA DETERMINACIÓN DE HBsAg

MATERIALES

a) Microplaca de ELISA b) Control Positivo

c) Conjugado concentrado d) Control Negativo
e) Diluyente del conjugado f) Solución de parada
g) Solución de lavado h) Sellos adhesivos
i) Buffer Sustrato j) Bolsa resellable
k) Cromógeno
METODOLOGÍA

1. Vierta 100 μl de cada uno de los controles positivos y negativos en los pocillos
correspondientes. Utilice al menos 3 pocillos para el Control Negativo y un pocillo para
el Control Positivo, uno para el blanco de sustrato en todas las placas o en una fracción
de placa para cada prueba, independientemente del número de muestras a analizar.
Deje el pozo del blanco vacío (es aconsejable reservar el pozo A1 para el blanco).
2. Añadir 100 μl de cada muestra a analizar en los pocillos correspondientes.
3. Cubrir la placa con una lámina adhesiva e incubar durante 60 ± 5 minutos a 37°C.
4. Deseche la lámina adhesiva. Aspirar el contenido de los pocillos y llenarlos
completamente (aproximadamente 350 μl) con solución de lavado diluida. Repetir el
proceso de aspiración-lavado 3 veces más. Asegúrese de que cada columna de pocillos
esté empapada durante al menos 15 segundos antes del siguiente ciclo de aspiración.
Tras el último lavado, golpear la placa invertida sobre papel secante para eliminar el
exceso de líquido en los pocillos.
5. Transferir 100 μl de conjugado diluido a todos los pocillos de la placa, excepto al pocillo
de blanco de sustrato.
6. Cubrir la placa e incubar durante 30 ± 2 minutos a 37°C.
7. Durante los últimos 5-10 minutos de esta incubación, preparar la solución de sustrato
cromogénico. Para una placa completa, añada 280 μl de solución cromógena (TMB) a
una botella de tampón de sustrato (14 ml) y mezcle bien.
8. Deseche el adhesivo. Aspirar y lavar la placa como se describe en el punto 4.
9. Añadir 100 μl de sustrato-TMB a todos los pocillos, incluido el blanco.
10. Incubar durante 30 ± 2 minutos a temperatura ambiente (20-25°C).
11. Añadir 100 μl de solución de parada a cada pocillo en la misma secuencia y a los
mismos intervalos que para la adición del sustrato-TMB.
12. Poner a cero el lector con el pozo en blanco a 450 nm y leer la absorbancia de cada
pozo en 30 minutos. Se recomienda que la lectura bicromática se realice con un filtro
de referencia de 620 - 630 nm.

RESULTADOS

La presencia o ausencia de HBsAg en las muestras de prueba se determina por la relación

entre el valor de absorbencia de cada muestra y el valor umbral.
1. Calcule el valor de corte añadiendo 0,040 a la media del control negativo.
Valor de corte = CNx + 0,040
2. Dividir la absorbancia de la muestra por el valor de corte.
Positivo: relación absorbancia/valor umbral ≥ 1,0
Negativo: relación absorbancia/valor umbral < 0,9
Dudoso: relación absorbancia/valor umbral ≥ 0,9 < 1,0

PRUEBA DE ELISA PARA LA DETERMINACIÓN Y CUANTIFICACIÓN ANTI-HBs

MATERIALES

a) Microplaca b) Control Positivo

c) Conjugado concentrado d) Control Negativo
e) Diluyente del conjugado f) Solución de parada
g) Solución de lavado h) Sellos adhesivos
i) Buffer Sustrato j) Bolsa resellable
k) Cromógeno l) Hoja de papel gráfico

METODOLOGÍA

1. Utilice sólo el número de tiras necesarias para la prueba. Reserve 8 pocillos para el
blanco y los controles. Transfiera 100 μl de control negativo a 2 pocillos y 100 μl de
calibrador positivo alto a 2 pocillos y 100 μl de calibrador positivo bajo a 3 pocillos.
Dejar un pocillo vacío para el blanco de sustrato.
2. Ensayo cualitativo: Transferir 100 μl de cada muestra a analizar al pocillo asignado.
Ensayo cuantitativo: Transferir 100 μl de cada muestra sin diluir, diluida 1/10 y diluida
1/100 a los pocillos correspondientes. Para cada muestra se necesitan 3 pocillos.
3. Cubrir la placa con el sello adhesivo, mezclar suavemente e incubar durante 1 hora a
37°C.
4. Retirar y desechar el sello adhesivo. Aspirar el contenido de los pocillos y llenarlos
completamente (aproximadamente 350 μl) con la solución de lavado diluida. Repita el
proceso de aspiración y lavado 3 veces más. Asegúrese de que cada columna de
pocillos se empapa durante al menos 15 segundos antes del siguiente ciclo de
aspiración. Tras el último lavado, secar la microplaca invertida en un tejido absorbente
para eliminar el exceso de líquido de los pocillos.
5. Añada 100 μl de conjugado a todos los pocillos, excepto al blanco. Evite que se formen
burbujas al añadirlo.
6. Cubrir la placa con el sello adhesivo, mezclar suavemente e incubar durante 30 minutos
a 37°C.
7. Durante los últimos 5-10 minutos de esta incubación preparar la solución de sustrato-
cromógeno. Si se utiliza toda la placa, añadir 280 μl de cromógeno (TMB) a la botella
 que contiene el tampón de sustrato (14 ml) y mezclar bien. Si no se utiliza toda la placa,
siga la tabla 1. La solución final debe ser de color rosa; deséchela si se vuelve azul.
8. Retire y deseche el sello adhesivo. Lave la placa como en el paso 4.
9. Añadir 100 μl de solución de sustrato-TMB a cada pocillo, incluido el blanco.
10. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente (20-25°C).
11. Detener la reacción añadiendo 100 μl de solución de parada en la misma secuencia e
intervalos de tiempo que para el sustrato-TMB.
12. Poner en blanco el lector a 450 nm con el pozo en blanco y leer la absorbancia de cada
pozo, antes de 30 minutos. Se recomienda leer en modo bicromático utilizando un
filtro de referencia de 620 - 630 nm.

RESULTADOS

Ensayo cualitativo
1. Calcular la absorbencia media del calibrador positivo bajo. Este es el punto de corte.
Punto de corte: LPCx
2. Dividir la absorbancia de la muestra por el valor de corte.
Positivo: relación absorbancia/corte ≥ 1,0
Negativo: relación absorbancia/corte < 0,9
Dudodo: relación absorbancia/corte ≥ 0,9 < 1,0

Ensayo cuantitativo
Trazar en coordenadas gráficas lineales las concentraciones de anti-HBs del control
negativo (0 mIU/ml), del calibrador positivo bajo (10 mIU/ml) y del calibrador positivo alto
(100 mIU/ml) en las abscisas (eje x) frente a sus correspondientes valores medios de
absorbancia en las ordenadas (eje y). Trazar una línea a través de estos tres puntos. La
concentración en mIU/ml de cada muestra puede derivarse de su absorbancia utilizando
la curva de calibración. Si la muestra fue diluida, el resultado debe multiplicarse por el
factor de dilución para obtener la concentración real de anti-HBs presente en el suero.
PRUEBA DE ELISA PARA LA DETERMINACIÓN DE ANTI-HBc

MATERIALES

a) Microplaca b) Control Positivo

c) Conjugado d) Control Negativo
e) Solución de lavado f) Solución de parada
g) Buffer Sustrato h) Sellos adhesivos
i) Cromógeno j) Bolsa resellable

METODOLOGÍA

1. Utilice sólo el número de tiras necesarias para la prueba. Reservar 7 pocillos para el
blanco y los controles. Transferir 50 μl de control negativo a 4 pocillos y 50 μl de
control positivo a 2 pocillos. Deje un pocillo vacío para el blanco de sustrato.
2. Transferir 50 μl de cada muestra a analizar a los pocillos correspondientes.
3. Añadir 50 μl de solución de conjugado en cada pocillo, excepto en el reservado para el
blanco de sustrato.
4. Cubrir la placa con el sello adhesivo, mezclar suavemente e incubar durante 1 hora a
37°C.
5. Durante los últimos 5-10 minutos de esta incubación preparar la solución de sustrato-
cromogénico. Si se utiliza toda la placa, añadir 280 μl de cromógeno (TMB) a la botella
que contiene el tampón de sustrato (14 ml) y mezclar bien. Si no se utiliza toda la placa,
siga la tabla 1. La solución final debe ser incolora; desechar si se vuelve azul.
6. Retire y deseche el sello adhesivo. Aspirar el contenido de los pocillos y llenarlos
completamente (aproximadamente 350 μl) con la solución de lavado diluida. Repita el
proceso de aspiración y lavado 3 veces más. Asegúrese de que cada columna de
pocillos se empapa durante al menos 15 segundos antes del siguiente ciclo de
aspiración. Tras el último lavado, secar la microplaca en un tejido absorbente para
eliminar el exceso de líquido de los pocillos.
7. Añadir 100 μl de solución de sustrato-TMB a cada pocillo, incluido el blanco.
8. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente (20-25°C).
9. Detener la reacción añadiendo 100 μl de solución de parada en la misma secuencia e
intervalos de tiempo que para el sustrato-TMB.
10. Poner en blanco el lector a 450 nm con el pozo en blanco y leer la absorbancia
de cada pozo, antes de 30 minutos. Se recomienda leer en modo bicromático utilizando
un filtro de referencia de 620 - 630 nm.

RESULTADOS

1. Calcule el valor de corte sumando la absorbencia media del control negativo a la

absorbencia media del control positivo y multiplicando este resultado por 0,4.
Valor de corte = (NCx + PCx) x 0,4
2. Dividir la absorbancia de la muestra por el valor de corte.
Positivo: relación absorbancia/corte ≤ 1,0
Negativo: relación absorbancia/corte > 1,1
Dudoso: relación absorbancia/corte > 1,0 ≤ 1,1

CUESTIONARIO
1. ¿Cuáles son los marcadores serológicos de la hepatitis B aguda?
2. ¿Cuáles son los marcadores serológicos de la hepatitis B crónica?
3. ¿Qué es el core window?
4. ¿Por qué es importante cuantificar el marcador anti HBs?
5. Elabore la guía práctica de las pruebas de detección de anti HBe y de AgHBe
6. Elabore un power point con las reacciones moleculares de los 3 marcadores tratados
en esta práctica.
BIBLIOGRAFÍA

• Wiegand SB, Beggel B, Wranke A, Aliabadi E, Jaroszewicz J, Xu C-J, et al. Soluble

immune markers in the different phases of chronic hepatitis B virus infection. Scientific
Reports. 2019.
• Coffin CS, Zhou K, Terrault NA. New and Old Biomarkers for Diagnosis and Management
of Chronic Hepatitis B Virus Infection. Gastroenterology. 2019.
 GUIA PRÁCTICA Nº 09 SEMANA 13
DIAGNÓSTICO INMUNOLOGICO DE ALERGIAS / DETERMINACION CUANTITATIVA DE
HCG
OBJETIVO Realizar e interpretar las pruebas utilizadas en el diagnóstico de
alergias / Realizar e interpretar la determinación cuantitativa de
HCG
LOGRO A MEDIR • Medir los niveles de anticuerpos en muestras de suero problema,
utilizando la prueba de Elisa IgE
• Identificar las bandas antígeno-anticuerpo con valor diagnóstico en
la prueba de panel de alérgenos específicos
• Determinar concentraciones de HCG en sueros problemas ,
emplear diluciones y realizar cálculos de resultados

DETERMINACION CUANTITATIVA DE IgE

INTRODUCCIÓN

Reacciones alérgicas, las cuales se han vuelto comunes, son diagnosticadas generalmente
en base al historial medico y síntomas clínicos. Sin embargo las pruebas in vitro e in vivo,
juegan un papel clave en la confirmación de sospechas clínicas y tratamientos de
adaptación. La medición de inmunoglobulina E (IgE) en sueros es usada ampliamente en la
diagnostico de reacciones alérgicas e infecciones por parásitos. Gran número de alergias
son causadas por inmunoglobulinas de subclase IgE actuando como punto de contacto entre
el alergéno y las células especializadas. Las moléculas de IgE (MW 200,000) se unen a la
superficie de las células centrales y los glanulocitos basofílos. Seguidamente la unión de
alergéno a la unión-celular IgE causa en las células la liberación de histaminas y otras
sustancias vasoactivas. La liberación de histaminas en el cuerpo inicia lo que es
comúnmente conocido como una reacción alérgica.
Antes de tomar cualquier determinación terapéutica es importante saber si la reacción
alérgica es mediada o no por Inmunoglobulina E. La medición de IgE total en la muestra de
suero, además de otra información de diagnostico de apoyo, pueden ayudar a tomar tal
determinación. La medida del total de IgE circulante puede ser de valor en la pronta
detección de alergias en niños y como un medio para predecir futuras manifestaciones
atópicas. Antes de decidir sobre cualquier terapia es importante considerar toda la
información clínica relevante así como la información proporcionada por el análisis
específico de alergias.
Los niveles de IgE muestran un aumento mínimo durante la niñez, alcanzando niveles
adultos durante la segunda década de vida. En general, los niveles totales de IgE aumentan
con las alergias que presentan una persona y el número de veces que está expuesta a los
alergénos relevantes. Un aumento significativo puede verse en individuos sensibilizados,
pero también en casos de mieloma, aspergilosis pulmonar y durante las etapas activas de
infecciones parasitarias.
En este método primero se adicionan el calibrador IgE, y el control o muestra del paciente
al pozo revestido con estreptavidina. El anticuerpo monoclonal marcado con biotina
(especifico para (IgE) se adiciona y se mezclan los reactivos. La reacción entre los
anticuerpos IgE y los IgE nativos forma un complejo que se une con la estreptavidina que
recubre el pozo. El exceso de proteínas en suero es removido por medio del lavado.
Otro anticuerpo monoclonal marcado con enzima específica para IgE es adicionado los
pozos. El anticuerpo marcado con enzima se une a la inmunoglobulina E ya inmovilizada
sobre el pozo a través de su unión con el anticuerpo monoclonal marcado con biotina. El
exceso de enzima es removido por medio del lavado. Un color es generado por la adición
de un sustrato. La intensidad del color es directamente proporcional a la concentración de
IgE en la muestra.

LOGRO

• Medir los niveles de IgE en muestras de suero

MATERIALES

a) Elisa IgE
b) Micropipetas
c) Papel absorbente

METODOLOGÍA

Antes de proceder con el ensayo, permita que todos los reactivos, los sueros de
referencia y los controles se encuentren a temperatura ambiente (20-27ºC).
1. Marcar los pozos de microplacas para cada calibrador, control y muestra de paciente para
ser procesados por duplicado. Colocar las tiras no utilizadas nuevamente en la bolsa de
aluminio, sellar y almacenarlo de 2-8ºC.
2. Pipetee 0.025 ml (25μl) del suero de referencia apropiado, control o muestra dentro del
pozo asignado.
3. Adicionar 0.100ml (100μl) de solución de reactivo IgE Biotina a cada pozo pozos. Es
muy importante dispensar todos los reactivos muy cerca de la base del pozo recubierto.
4. Agite suavemente la micro placa ligeramente por 20-30 segundos para mezclar y cúbrala.
5. Incube 30 minutos a temperatura ambiente.
6. Descarte los contenidos de la microplaca por decantación o aspiración. Si decanta, seque
la placa con papel absorbente.
7. Adicione 300μl de tampón de lavado (ver Sección Preparación de Reactivos), decante
(golpee y seque) o aspire. Repita 2 veces adicionales para un total de 3 lavados. 8.
Adicionar 0.100 ml (100μl) del anticuerpo IgE marcado con enzima a cada pozo.
NO AGITAR LA MICROPLACA DESPUES DE ADICIONAR LA ENZIMA
9. Cubra e incube a temperatura ambiente por 30 minutos.
10. Desechar el contenido de la microplaca por medio de decantación o aspiración. Si se
realiza decantación, seque la placa con papel absorbente.
11. Adicionar 350μl de tampón de lavado (ver Sección Preparación de Reactivos), decantar
(con golpe o con secado) o aspirar. Repetir 2 veces adicionales para un total de 3 lavados
12. Adicionar 0.100ml (100μl) de solución de sustrato de trabajo en todos los pozos (Ver
Sección de preparación de reactivos).
NO AGITAR LA PLACA DESPUES DE LA ADICIÓN DEL SUSTRATO
13. Incubar a temperatura ambiente por 15 minutos.
14. Adicionar 0.050 ml (50μl) de solución de parada a cada pozo y mezclar ligeramente
(por 15-20 segundos).
15. Leer la absorbancia en cada pozo a 450nm (usando una referencia de longitud de onda
de 620-630nm para minimizar las imperfecciones de los pozos) en un lector de
microplacas.
Los resultados deben ser leídos dentro de los treinta (30) minutos después de la
adición la solución de parada.

RESULTADOS

Una curva dosis respuesta es usada para hallar la concentración IgE en muestras
desconocidas.
1. Registrar la absorbancia obtenida del listado del lector de microplacas como se indica en
el Ejemplo 1.
2. Graficar la absorbancia para cada calibrador en duplicado vs la concentración
correspondiente IgE en IU/ml en papel lineal de gráficos (no promediar los duplicados de
los calibradores antes de graficar).
3. Sacar la mejor curva de ajustes a través de los puntos de la grafica).
4. Para determinar la concentración de IgE de una muestra desconocida, localizar la
absorbancia promedio de los duplicados desconocidos en el eje vertical del gráfico,
encontrar el punto de intersección sobre la curva y leer la concentración (en UI/ml) del eje
horizontal del gráfico (los duplicados desconocidos pueden ser promediados como se
indica).

DETERMINACION DE ALERGENOS ESPECIFICOS

INTRODUCCIÓN

Un aumento progresivo de la prevalencia de las enfermedades alérgicas a nivel mundial se

ha producido con un 30-40% de la población mundial ahora se vean afectados por una o
más condiciones alérgicas. La Inmunoglobulina E es especialmente importante para las
alergias alimentarias que es parte de la hipersensibilidad tipo I. Ordinariamente Se produce
al combatir las infecciones causadas por parásitos. Esta molécula también se produce frente
a los seres inofensivos como el polen, el polvo y los alimentos que pueden causar
enfermedades alérgicas como asma, rinitis alérgica y alergia a los alimentos.

El kit de prueba de alérgenos NIC un ensayo de inmunotransferencia para la detección

cualitativa de anticuerpos IgE al alérgeno en el suero humano. La superficie de viaje de la
membrana de nitrocelulosa de la prueba se recubre con alérgenos específicos. Durante las
pruebas, se añade la muestra a la tira de ensayo y se incuban. Si la muestra contiene
anticuerpos IgE específicos de alérgeno, puede reaccionar con los alérgenos y se unen a la
membrana de nitrocelulosa de la tira. El material no unido se elimina mediante lavado. Los
anticuerpos detectores (anticuerpo anti-IgE humana junto con biotina) se añaden a la tira y
se incuban. Los anticuerpos del detector se unirán a la respectiva IgE específica que se une
a la banda en la primera incubación. Anticuerpos detectores no unidos se eliminan por
lavado. A continuación, la estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina se añade a la tira
de prueba y se incuba. Esto se unirá a la biotina, que se une a la tira en la segunda
incubación. El conjugado de estreptavidina no unido se elimina mediante lavado. Entonces
se añade el sustrato y se incuba, lo que provocará una reacción de color enzimática
específica de la fosfatasa alcalina.
La intensidad del color que corresponde a la cantidad de alérgeno anticuerpo específico se
interpreta mediante comparación con una carta de color. Para servir como control de
productos, una línea coloreada aparecerá siempre en la zona de control que indica el
procedimiento correcto.
LOGRO

• Identificar las bandas coloreadas e intensificadas con valor diagnóstico en la prueba de

IgE especifica de anticuerpos

MATERIALES

a) Kit de pruebas para alergias

b) Agua destilada
c) Caja de incubación
d) Agitador

METODOLOGÍA

1) Preparar trabajo tampón de lavado diluyendo el tampón de lavado concentrado 1:25.

Diluir 1 volumen de Buffer de Lavado Concentrado (25x) con 24 volúmenes de agua recién
destilada en una botella de lavado.
Mezclar bien antes de usar.
2) Añadir 250 μl de la solución de lavado de trabajo en la pila de reacción; mojar la cubeta
de reacción; mojar la cubeta de reacción sacudiéndolo (en un agitador) a temperatura
ambiente (18-25 °C) durante 5 minutos. Retire el tampón de lavado de trabajo y limpie el
exceso de agua en la superficie de plástico usando un papel absorbente.
3) Primera Incubación: Añadir 250 μl de las muestras de suero en las cubetas de reacción
entonces se incuba en el agitador a temperatura ambiente (18-25 C) durante 45 minutos.
Retire las muestras de suero después de la incubación.
4) Lave las tiras reactivas 6 veces con tampón de lavado de trabajo mientras se mantienen
el canal de reacción en diagonal. Agitar la solución en la cubeta manualmente durante unos
10 segundos y luego retire el tampón de lavado de trabajo. Limpiar el exceso de solución en
la superficie de plástico utilizando tejido absorbente.
NOTA: lavado completo es importante. Agite la solución de lavado de trabajo en el canal
durante varios segundos antes de verterla a cabo para asegurar el lavado eficaz.
5) Segunda Incubación: Añadir 5 gotas (250 μl) del anticuerpo detector luego incubar en el
agitador a temperatura ambiente (18-25 C) durante 45 minutos. Retire el exceso de
anticuerpo detector después de la incubación.
6) Repetir el Paso 4.
7) Tercera Incubación: Añadir 5 gotas (250 μl) de Conjugado luego incubar en el agitador a
temperatura ambiente (18-25 °C) durante 20 minutos. Retire el exceso de conjugado
después de la incubación.
8) Repetir el Paso 4.
9) Cuarta Incubación: Añadir 5 gotas (250 μl) de sustrato luego incubar (en la oscuridad) en
el agitador a temperatura ambiente (18-25 C) durante 20 minutos en oscuridad. Retire el
exceso de sustrato después de la incubación.
NOTA: La incubación del sustrato debe ser llevada a cabo en la oscuridad para evitar la
auto-coloración del sustrato.
10) Enjuague la tira bajo el agua que fluye para detener la reacción del substrato. Limpiar el
exceso de agua sobre la superficie de plástico utilizando tejido absorbente.
11) Seque la tira en el aire o mediante el uso de un secador de Hait convencional que
acelerará el proceso de secado. El color azul-púrpura del fondo desaparece a medida que la
tira reactiva seca.
NOTA: La tira de prueba se debe secar completamente antes de leer los resultados
12) Comparar la tira de la muestra con la tira con la carta de colores. Una evaluación
cualitativa de esas líneas es posible por comparación visual de la intensidad de color de
cada línea de la tira con la carta de colores.
NOTA: La línea de control debería aparecer ahora, que se utiliza para comprobar si el
ensayo se ha llevado a cabo correctamente.

RESULTADOS

• Identificar las bandas inmunoreactivas de la muestra problema comparando su

ubicación con las bandas presentes en la tira revelada
DETERMINACION CUANTITATIVA DE HCG

INTRODUCCIÓN

La HCG es una hormona glicoproteína con un peso de 40 kD secretada por la placenta.

HCG tiene dos subunidades, alfa y beta. La subunidad alfa es similar a la subunidad alfa
encontrada en LH, FSH y TSH hormonas glicoproteícas. Sin embargo, la subunidad beta es
específica y se diferencia de hormona a hormona. Los aumentos séricos de HCG en el
embarazo temprano a concentraciones de 50.000 - 150.000 mUI / ml entre las semanas 8 y
12 de gestación y el declive para 20.000 mUI / ml en la semana 18, donde permanecen
durante la duración del embarazo. El aumento del nivel de HCG en mujeres no
embarazadas o los hombres sugieren neoplasia. Por lo tanto la medición de HCG es útil
para el reconocimiento y la vigilancia de los tumores y como marcador tumoral para otros
tumores malignos que producen HCG ectópica. Estos incluyen páncreas, testicular, cáncer
broncogénico y pulmonar. La sensibilidad de esta prueba de ELISA es de 0,5 mUI / ml.

La HCG es un método directo de ELISA en fase sólida .Las muestras y el diluyente

conjugado anti-HCG-HRP se suman a los pocillos recubiertos con Streptavidina a la
subunidad beta. La HCG en el suero del paciente se une al anticuerpo monoclonal
antiHCG. Las proteínas no unidas con el conjugado HRP son lavados por la solución de
lavado. Tras la adición del sustrato, la intensidad del color es proporcional a la
concentración de HCG en las muestras. Una curva estándar se prepara sobre la intensidad
del color a la concentración de la HCG en la muestra.

LOGRO

• Realizar determinaciones cuantificadas de concentraciones de HCG mediante

método de ELISA

MATERIALES

a) Kit de ELISA HCG

b) Agua destilada
c) Micropipetas
METODOLOGÍA

Previo al ensayo, permita que todos los reactivos alcancen la temperatura ambiente (18°-
26°C). Mezcle suavemente los reactivos antes de su uso.

1. Corte el número de pozos a utilizar. Cierre y selle el resto de los micropocillos no

utilizados y refrigérelos a 2-8 °C.
2. Agregue 25 µl de estándares, especímenes y controles en los pozos apropiados.
3. Vierta 100 µl de solución enzima conjugada.
4. Cubra e incube a temperatura ambiente por 60 minutos (18- 26C).
5. Retire el líquido de los pocillos. Enjuague y lave los pocillos tres veces con 300 µl de
solución de lavado de 1X. Golpee la placa de los micropocillos sobre el papel absorbente
para remover las gotas de agua residuales.
6. Vierta 100 µl de reactivo TMB.
7. Incube a temperatura ambiente por 15 minutos.
8. Frene la reacción agregando 50 µl de solución de frenado a cada pozo.
9. Lea la densidad óptica a 450nm con un lector de placa de micro valoración en un plazo
de 15 minutos después de haber agregado la solución de frenado

RESULTADOS

1. Calcule los valores de absorbancia media (A450) para cada juego de estándares de
referencia, control y muestras del paciente.
2. Elabore una curva estándar al trazar la absorbancia media obtenida para cada
estándar de referencia comparada con su concentración en IU/ml sobre el papel
cuadrícula, con los valores de absorbancia sobre el eje vertical (Y) y las
concentraciones sobre el eje horizontal (X).
3. Utilice el valor de absorbancia media para cada muestra para determinar la
concentración correspondiente de HCG en mlU/ml desde la curva estándar.
4. Valores sobre 250 mIU deberán ser re testeados luego de diluir con “0” standard
BIBLIOGRAFÍA

• Arbes SJ y colaboradores. Las prevalencias de pruebas cutáneas positivas a 10

alérgenos comunes en la población de Estados Unidos: Los resultados de la
Encuesta de Nutrición Salud Tercer Examen Nacional; J Allergia Clin Immuniol.
2005; 116: 377-383

• Wao (Organización Mundial de Alergia) Libro blanco de 2011.

 GUIA PRÁCTICA Nº 10 SEMANA 14
DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS Y TOXOPLASMOSIS
OBJETIVO Realizar e interpretar las pruebas utilizadas en el diagnóstico de
la enfermedad de Chagas y Toxoplasmosis
LOGRO A MEDIR • Medir los niveles de anticuerpos anti T. cruzi en muestras de suero
problema, utilizando la prueba de ELISA-IgG, estableciendo su
utilidad y limitaciones.
• Medir los niveles de anticuerpos anti Toxoplasma en muestras de
suero problema utilizando el método de ELISA para Toxoplasma IgG
e IgM

DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS

INTRODUCCIÓN

La enfermedad de Chagas o tripanosomiasis americana es una zoonosis endémica del

continente americano, que se extiende desde el norte de México hasta el sur de
Argentina. Según las estimaciones de la OMS, habrían aproximadamente 16-18 millones
de personas infectadas.
El diagnóstico de laboratorio de la enfermedad de Chagas depende del estadio de la
enfermedad. Durante la fase aguda, inicial, la detección del parásito se puede realizar por
microscopía debido a los elevados niveles de parasitemia. Por el contrario, la detección de
T. cruzi durante la fase crónica necesita métodos de amplificación como el hemocultivo, el
xenodiagnóstico o los procedimientos moleculares.
Las pruebas serológicas son más útiles durante la fase crónica, especialmente para
tamizaje en los bancos de sangre, para estudios epidemiológicos y para la prevención,
control y vigilancia de la enfermedad.
Varias pruebas serológicas han sido aplicadas al diagnóstico de la enfermedad de Chagas
incluyendo fijación de complemento, inmunofluorescencia indirecta, aglutinación directa,
aglutinación de partículas de látex, ELISA, dot-ELISA, Western blot y pruebas
inmunocromatográficas. Estas pruebas serológicas tienen alta sensibilidad pero carecen
de especificidad, habiéndose detectado reacciones cruzadas con otros parásitos como
Leishmania sp. y T. rangeli.
PRUEBA DE ELISA
La respuesta inmunitaria humoral a la infección causada por Trypanosoma cruzi puede ser
detectada por la prueba de ELISA para la enfermedad de Chagas.
La prueba de ELISA es un inmunoensayo en fase sólida para la detección de anticuerpos
contra T. cruzi. La prueba se realiza en una placa recubierta de extractos totales del
parásito.

MATERIALES

a) Tiras recubiertas de antígeno T. cruzi j) Acido sulfúrico 1 N

b) Soporte microplaca de las tiras k) Pipeta automática de 2-20 μL
c) Diluyente l) Pipeta automática de 40-200 μL
d) Buffer salino fosfato m) Puntas de 2-20 μL
e) Suero control negativo n) Puntas de 40-200 μL
f) Suero control positivo o) Lámina adhesiva
g) Sueros problema p) Papel toalla
h) Anti-IgG conjugada con peroxidasa q) Lector de microplacas con filtro de
i) Sustrato/cromógeno: peróxido de 492 nm
hidrógeno/OPD r) Bocal con lejía

METODOLOGÍA

1. Colocar 100 μL de los sueros control y sueros problema a los pocillos

correspondientes. Incluir un pocilloque contenga únicamente 100 μL de diluyente.
Este servirá como blanco de los reactivos.
2. Cubrir la tira con cinta adhesiva e incubar durante 1 h a temperatura ambiente.
3. Descartar el contenido de los pocillos y llenarlos (~ 300 μL) con solución de lavado.
Descartar la solución de lavado en el bocal y elimine el líquido remanente golpeando
ligeramente la placa sobre papel toalla. Repetir el lavado 2 veces más.
4. Añadir 100 L de conjugado diluido a cada pocillo. Evitar la formación de burbujas.
5. Cubrir la tira con cinta adhesiva e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente.
6. Lavar los pocillos como se ha descrito en el paso 3.
7. Añadir 100 L de la solución sustrato-OPD a cada pocillo e incubar durante 30 minutos
a temperatura ambiente.
8. Detener la reacción añadiendo 100 L de solución de parada a cada pocillo.
9. Agitar ligeramente la placa para mezclar el contenido de los pocillos. Ajustar el cero
del lector con el pocillo del blanco y leer la absorbancia de cada uno de los pocillos en
el plazo máximo de 60 minutos.
RESULTADOS

• El cálculo del valor de corte o umbral varía con el fabricante del reactivo comercial.
• Aquellas muestras que presenten un valor de absorbancia igual o superior al valor
umbral, se considerarán positivas para IgG [Link].
• Los resultados de la prueba sirven de ayuda en el diagnóstico de una infección activa o
reciente, pero no deben ser interpretados como diagnósticos en si mismos. Es
aconsejable que los resultados de la prueba se interpreten junto con otros hallazgos
clínicos.

CUESTIONARIO

1. ¿Cuáles son las pruebas de laboratorio utilizadas para diagnosticar Enfermedad de

Chagas en cada una de sus etapas clínicas?
2. ¿Qué es el Xenodiagnóstico y cómo se realiza?
3. ¿Cómo se diagnostica la enfermedad de Chagas congénita?
4. Elabore la guía práctica de las pruebas de Hemaglutinación pasiva e
Inmunofluorescencia indirecta para el diagnóstico de Enfermedad de Chagas.
5. ¿Cómo se diagnostica la toxoplasmosis congénita?
6. ¿Qué es la prueba de ISAGA?
7. ¿En qué consiste la prueba de Avidez para diagnosticar Toxoplasmosis? ¿Cómo se
realiza?
8. Elabore la guía práctica de la prueba de ELISA para el diagnóstico de Toxoplasmosis
(detección de anticuerpos clase Ig G e Ig M).

BIBLIOGRAFÍA

• Alvarez M, De Rissio A M, Del Prado C. y col. Diagnóstico de la enfermedad de Chagas

en el laboratorio. En: Carlomagno M y col (ed.), Parasitosis humanas producidas por
protozoos, INDIECH “Dr. Mario Fatala Chabén”, Buenos Aires, 1989.
• da Silveira JF, Umezawa ES, Luquetti AO. Chagas disease: recombinant Trypanosoma
cruzi antigens for serological diagnosis. Trends Parasitol 2001; 17:286-291.
• de Andrade AL, Martinelli CM, Luquetti AO, de Oliveira OS, Almeida e Silva S, Zicker F.
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DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE TOXOPLASMOSIS

INTRODUCCIÓN

La toxoplasmosis es una enfermedad infecciosa del hombre y de los animales, de

distribución universal, cuyo agente etiológico es un parásito intracelular obligado, el
Toxoplasma gondii. Es una enfermedad generalmente benigna y asintomática en
individuos inmunocompetentes, convirtiéndose en una seria complicación en pacientes
inmunocomprometidos. Cuando la infección se adquiere durante la gestación, existe un
alto riesgo de infección del feto, pudiendo provocar abortos o lesiones graves en el
mismo. Las lesiones provocadas en el feto son más severas cuanto más temprana en el
embarazo sea la infección materna.

LOGRO

• Medir los niveles de anticuerpos en muestras de suero problema, utilizando método de

ELISA

MATERIALES

a) Kit de prueba Toxoplasma IgG / IgM

b) Sueros controles
c) Papel Absorbente
d) Micro pipetas

METODOLOGÍA

1- Llevar a temperatura ambiente los reactivos y las muestras antes de iniciar la prueba.
2- Preparar el volumen necesario de buffer de lavado (1x).
3- Colocar en el soporte de tiras, el número de pocillos requeridos para la cantidad de
determinaciones a realizar, incluyendo 1 pocillo para el Control Positivo (CP), 1 pocillo
para el Control Cut-off (Cco) y 1 pocillo para el Control Negativo (CN).
4- Diluir la muestra 1:101 con el Diluyente de Muestra, colocando 10 µl de muestra y 1000
µl de diluyente (en tubo). Los Controles no deben ser diluidos.
5- Pipetear 100 µl de Controles y de las muestras diluidas.
6- Para evitar la evaporación, cubrir la placa con la cinta autoadhesiva provista, e incubar
60 ± 2 minutos a 37ºC ± 1ºC. En forma paralela, preparar el conjugado.
7- Después de la incubación eliminar el líquido de cada pocillo por completo. Lavar 5 veces
según instrucción de lavado (ver Procedimiento de Lavado).
8- Agregar 100 µl de Conjugado. Para evitar la evaporación cubrir la policubeta con cinta
autoadhesiva.
9- Incubar 60 ± 2 minutos a 37ºC ± 1ºC.
10- Lavar 5 veces según instrucción de lavado.
11- Dispensar 100 µl del Revelador.
12- Incubar 30 ± 2 minutos a temperatura ambiente (18- 25ºC), protegido de la luz.
13- Agregar 100 µl del Stopper.
14- Leer absorbancia en espectrofotómetro en forma bicromática a 450/620-650 nm o a 450
nm. En caso de absorbancias elevadas (por encima del valor máximo de lectura del
espectrofotómetro usado) leer a 405/620-650 nm. Esto permite un mayor rango de la curva.

RESULTADOS

• Realizar el cálculo de los resultados con las absorbancias establecidas

• Verificar criterios de validación según inserto

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