Que es?
• Es el estudio de la respuesta inmunitaria frente a un agente infeccioso
(antigeno).
• Consiste en la identificacion de los anticuerpos.
ANTIGENO
• Es cualquier sustancia capaz de estimular una respuesta inmunológica
cuando ingresa a un organismo animal.
ANTICUERPO
• Son proteínas del tipo de las globulinas, denominadas inmunoglobulinas,
capaces de reconocer y unirse a los antígenos.
Respuesta inmunologica
Memoria
Inmunologica
Produccion de antisueros
Purificacion de Acidos Nucleicos
Produccion de antisueros
Pruebas serologicas
Reaccion ANTIGENO-ANTICUERPO.
-Es altamente especifica.
• De lectura directa: tienen sus fundamentos en la observación directa
de la red antígeno-anticuerpo (pruebas de precipitación).
• De lectura indirecta: requieren la utilización de otros reactivos que
nos permiten confirmar que la reacción se ha producido(enzimas,
moléculas fluorescentes, etc.).
Enzyme-linked immunosorbent assay
Ensayo por Inmunoadsorción Ligado a Enzimas
Técnica inmuno-enzimática de lectura indirecta.
Se realiza sobre base sólida donde los anticuerpos capturan antígenos y luego se
pone en evidencia la presencia del virus mediante la utilización de una enzima
capaz de producir cambio de color en un sustrato adecuado.
Su invención se produjo simultáneamente por dos grupos de investigación
distintos, que publicaron sus trabajos el mismo año (Engvall y Perlmann,
1971; Van Weemen y Schuurs, 1971).
Los dos grupos de investigación involucrados en el descubrimiento
recibieron el Premio de Análisis Bioquímico en 1976.
Componentes esenciales…
El antígeno a detectar o cuantificar.
Un anticuerpo específico para ese antígeno conjugado a una enzima
que genere una reacción cuantificable.
Base solida (placa).
Un sistema que permita estimar la cantidad de antígeno presente en
la muestra a partir de la reacción enzimática que se genere.
Aparato de cuantificación: lector de
placas o fotómetro de microplacas
(mide valores absorbancia).
• Es una prueba de alta sensibilidad y
especificidad.
• Es cuantitativa.
• Es relativamente económica.
• Se pueden procesar hasta 96 muestras por placa.
• Reactivos de gran estabilidad.
• Positividad vs. Infección activa
ELISA DIRECTO
• Un anticuerpo primario marcado con una enzima se unirá
directamente al antígeno de interés permitiendo la
detección y/o cuantificación del mismo.
• Es adecuado para determinar la cantidad de antígenos de alto
peso molecular y se considera el tipo de ELISA más simple y
rápido.
• Otra ventaja es que se elimina la posibilidad de reactividad
cruzada del anticuerpo secundario, que puede ocurrir en un
ELISA indirecto.
• Sin embargo, el marcaje directo de los anticuerpos primarios
requiere mucho tiempo, es costoso y puede afectar
negativamente a la inmunorreactividad del anticuerpo con el
antígeno al que está dirigido.
ELISA INDIRECTO
Es un ensayo parecido al ELISA directo pero en dos pasos, lo
que permite amplificar la señal obtenida. En este caso se
utilizan dos anticuerpos, uno primario y otro secundario, y
es este último el que irá conjugado a una enzima.
• La detección por ELISA indirecto es versátil, ya que se pueden usar diferentes
marcadores de visualización con el mismo anticuerpo primario.
• Puede producirse reactividad cruzada y una señal no específica con el anticuerpo
secundario.
DAS-ELISA
• El antígeno queda inmovilizado entre dos anticuerpos, uno de
captura y otro de detección también conocidos como pares de
anticuerpos, que se unirán a dos epítopos distintos de un mismo
antígeno.
• Los ELISA sándwich son altamente específicos ya que se basan en
un par de anticuerpos para la captura y detección del antígeno.
• Por tanto, lo detectan a concentraciones muy bajas en la mezcla
inicial.
Otros aspectos a tener en cuenta…
• Todos los componentes de nuestro ensayo requieren ser diluidos en
buffer específicos para cada reacción que queremos lograr. Por
ejemplo: buffer de lavado, extracción, coating, enzima o de conjugado
y sustrato (para DAS-ELISA).
• Las diluciones cambian en base al antígeno en estudio.
¡Corroborar!
• Los lavados de las placas deben realizarse varias veces (3 o 4), para
cerciorarnos de que la lectura al final del ensayo sea precisa.
Además, cada lavado llevarse a cabo con cuidado de no salpicar
entre celdillas.
• A la hora de colocar el sustrato, como se llevará a cabo una reacción
fotosensible, debemos conservar la placa en un lugar donde no llegue
la luz.
• El P-nitrofenilfosfato es cancerígeno y todos los buffers
empleados contienen azida sódica, que inhibe la respiración
celular.
• Evitar el contacto con la piel.
Bibliografía
• Aydin S. 2015. A short history, principles, and types of ELISA, and our
laboratoryexperience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides. 72: 4
15.
• Coons AH, Creech HJ, Jones RN. 1941. Immunological properties of an anti-
body containing of fluorescent group. Pros Soc Exp Biol Med. 47:200–2.
• Engvall E, Perlmann P. 1971. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
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Assay (ELISA). Clinical Chemistry. 51 (12): 2415–2418.
• Murphy K, Travers P y Walport M. 2008. Inmunobiología de Janeway. Séptima
Edición. McGraw Hill Interamericana Editores. México, D.F., México.
• Van Weemen BK, Schuurs AH. 1971. Immunoassay using antigen-enzyme
conjugates. FEBS Lett. 15:232–236